检索结果-南通市图书馆

作者：闻金萱上海海洋大学

学位级别：硕士

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid Herpesvirus 2,CyHV-2)是双链DNA病毒,主要感染鲫和金鱼引起病毒性造血器官坏死病(Herpes Viral Haematopoietic Necrosis,HVHN),给鲫养殖产业造成了严重的经济损失。DNA病毒基因可根据其表达的时序划分为立即... 详细信息

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid Herpesvirus 2,CyHV-2)是双链DNA病毒,主要感染鲫和金鱼引起病毒性造血器官坏死病(Herpes Viral Haematopoietic Necrosis,HVHN),给鲫养殖产业造成了严重的经济损失。DNA病毒基因可根据其表达的时序划分为立即早期基因(又称极早期基因,IE),早期基因(E)与晚期基因(L)。立即早期基因在病毒感染的早期表达,调控病毒早期和晚期基因以及相关宿主基因的转录和翻译。在本实验室前期的研究中,利用放线菌酮(CHX)和阿糖胞苷(Ara C)两种药物建立了立即早期基因筛选模型,得到5个立即早期基因(orf54、orf121、orf141、orf147和orf155),其中orf121基因在感染CyHV-2濒死鲫的各个组织中表达量较高,但该基因在CyHV-2感染过程中的功能尚未得知。因此,本研究主要围绕orf121及其互作的宿主因子开展实验,主要结果如下:1利用酵母双杂交系统筛选鲫蛋白中与orf121蛋白相互作用的宿主蛋白,并对其结构进行生信分析。为探究orf121基因的功能,用Mating法筛选与orf121蛋白互作的鲫蛋白。将pGBKT7-orf121转化Y2H Gold酵母菌株与转化鲫cDNA文库的Y187酵母菌株共培养,经二缺、三缺、四缺平板筛选后得到5个与orf121互作的候选蛋白:C-Myc转录调控因子,中心体和纺锤极相关蛋白异构体X4,锌指蛋白518B,Prem RNA加工因子40同源物A,半乳糖凝集素3。生物信息学分析结果显示鲫CMyc存在一段结合DNA序列的BHLH结构域,orf121的Tyr 68和Gln 127分别与C-Myc的Glu 349和Lys 332结合。2利用Dot-Blot overlay、亚细胞共定位等方法证实orf121与C-Myc的相互作用。利用siRNA敲降C-Myc,发现C-Myc与CyHV-2复制密切相关。病毒和宿主之间的互作影响病毒的侵染和复制。为探究其机制,在酵母中明确orf121与C-Myc转录调控因子互作的基础上,用Dot-Blot overlay实验证实二者互作,并用亚细胞共定位实验发现orf121与C-Myc共同定位于细胞核。为进一步探究C-Myc在病毒感染中起到的具体作用,对C-Myc的功能进行研究。在CyHV-2感染中,orf121与C-Myc呈同步上调趋势。用siRNA干扰C-Myc基因表达,发现orf121的表达随之降低,CyHV-2的拷贝数显著降低。综上,推测C-Myc蛋白与orf121蛋白互作,从而调控CyHV-2的复制。3转录组分析显示PI3K/AKT/mTOR信号通路在CyHV-2感染中显著上调。10058-F4抑制实验表明C-Myc的表达不仅影响CyHV-2基因组的转录,还影响PI3K/AKT/mTOR信号通路基因的表达。雷帕霉素抑制实验表明orf121与C-Myc互作通过调控mTOR的磷酸化影响PI3K/AKT/mTOR信号通路。为探究orf121与C-Myc互作通过调控哪些途径影响CyHV-2的复制,首先检测C-Myc在鲫和金鱼各组织中的分布,结果显示C-Myc在鳃组织中表达量最高,约为其他组织的4.5倍。将CyHV-2 SH-01株病毒人工注射鲫和金鱼并与健康的鲫和金鱼一同进行转录组分析。结果发现PI3K/AKT/mTOR信号通路在病毒感染中显著上调,并在感染CyHV-2的GiCF细胞的RT-qPCR实验中证实这一点。CMyc抑制剂10058-F4抑制实验结果显示orf121在转录和翻译水平均被抑制,其余4个立即早期基因(orf54、orf141、orf147和orf155),1个早期(orf24)和1个晚期基因(orf7)的表达也被抑制,CyHV-2拷贝数降低,PI3K/AKT/mTOR信号通路基因被抑制。mTOR抑制剂雷帕霉素抑制实验结果显示,mTOR磷酸化被抑制后orf121和C-Myc在转录水平被抑制。CyHV-2的其余4个立即早期基因(orf54、orf141、orf147和orf155),1个早期(orf24)和1个晚期基因(orf7)的表达均被抑制,CyHV-2拷贝数下降。PI3K/AKT/mTOR信号通路部分基因被抑制。综上,本研究揭示了一个新的与CyHV-2立即早期基因orf121互作的宿主蛋白——C-Myc转录调控因子。C-Myc转录调控因子的表达与CyHV-2复制密切相关。且orf121与C-Myc互作通过调控mTOR的磷酸化来介导PI3K/AKT/mTOR信号通路,从而影响CyHV-2的复制。本研究发现C-Myc与mTOR可能是两个有效抑制CyHV-2感染的潜在药物靶点,为CyHV-2的防控以及新型环保绿色渔药的研发提供新策略。

关键词： CyHV-2 C-Myc 立即早期基因 orf121 PI3K/AKT/mTOR

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Ⅱ型鲤疱疹病毒orf121蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

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水产学报 2019年第6期43卷 1463-1471页

作者：余琳吕利群王浩上海海洋大学国家水生动物病原库上海海洋大学农业农村部淡水种质资源重点实验室上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心

针对CyHV-2病毒orf121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增orf121基... 详细信息

针对CyHV-2病毒orf121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增orf121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rorf121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒orf121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rorf121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rorf121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗orf121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗orf121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗orf121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。

关键词： Ⅱ型鲤疱疹病毒 orf121 原核表达多克隆抗体间接免疫荧光检测

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绵羊痘病毒orf121基因的序列分析及其B细胞表位预测

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黑龙江畜牧兽医 2009年第2期 16-18页

作者：陈轶霞乔自林刘俊林王明明陆会宁郑亚东陈智华西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室／甘肃省动物寄生虫病重点实验室／中国农业科学院人兽共患病重点实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学甘肃兰州730070

选取GenBank上4株不同绵羊痘毒株orf121基因序列，采用DNASTAR软件对该基因序列进行同源性分析，并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据，综合预测orf121蛋白B细胞表位。结果表明：4株不同绵羊痘毒株orf121基因核苷酸序列的同... 详细信息

选取GenBank上4株不同绵羊痘毒株orf121基因序列，采用DNASTAR软件对该基因序列进行同源性分析，并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据，综合预测orf121蛋白B细胞表位。结果表明：4株不同绵羊痘毒株orf121基因核苷酸序列的同源性为99％；在orf121蛋白的肽链中，35～46、76～82、160～167区段亲水性强，35～45、54～83、90～124、130～139、144～158和160～167区段柔韧性好，37～45、112～116、129～137和143～167区段抗原指数高，33～45、78～83和159～167区段表面可及性高，30～57和151～170区段可形成一定的空间构象。结果说明orf121基因在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守，orf121蛋白35～45、160～167区段可能是B细胞表位优势区，具有潜在的疫苗或／和诊断价值。

关键词：绵羊痘病毒 orf121 序列分析 B细胞表位

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家蚕核型多角体病毒orf121克隆以及非翻译区分析

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西北师范大学学报（自然科学版） 2011年第4期47卷 87-90页

作者：郝碧芳王猛沈兴家江苏科技大学蚕业研究所江苏镇江212018 中国农业科学院蚕业研究所江苏镇江212018

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)orf121是Ac145的同源基因,同为杆状病毒11K基因家族,但其功能尚不明确.克隆了BmNPVorf121基因并对其侧翼序列以及转录时相进行分析.结果发现orf121与GenBank发表的T3株一致,orf121编码的蛋白N端含有一段疏水... 详细信息

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)orf121是Ac145的同源基因,同为杆状病毒11K基因家族,但其功能尚不明确.克隆了BmNPVorf121基因并对其侧翼序列以及转录时相进行分析.结果发现orf121与GenBank发表的T3株一致,orf121编码的蛋白N端含有一段疏水性很强的氨基酸,C端有一个几丁质结合域基序(C6基序);orf121的转录产物在病毒感染后6 h可以检测到,一直持续到病毒感染末期,推测orf121是一个早期基因;3 RACE分析显示在orf121终止密码子下游111个核苷酸处有一个AATAAA的加尾信号,5 RACE分析表明其转录起始位点位于起始密码子上游120 bp处.

关键词：家蚕核型多角体病毒 orf121 非翻译区

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绵羊痘病毒甘肃流行株orf121基因的克隆及序列分析

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畜牧与兽医 2009年第4期41卷 61-63页

作者：陈轶霞才学鹏郑亚东张冬峰骆学农乔自林西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国农业科学院人兽共患病重点实验室甘肃兰州730046

从甘肃景泰疑似羊痘绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增糖蛋白orf121基因。序列分析表明,该基因由519个核苷酸组成,编码172个氨基酸,分子量为19.9 kua,序列中A+T含量占74.95%,G+C含量仅占25.05%。甘肃景泰株orf121基因同绵羊痘病毒... 详细信息

从甘肃景泰疑似羊痘绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增糖蛋白orf121基因。序列分析表明,该基因由519个核苷酸组成,编码172个氨基酸,分子量为19.9 kua,序列中A+T含量占74.95%,G+C含量仅占25.05%。甘肃景泰株orf121基因同绵羊痘病毒参考株之间的核苷酸同源性高达99%;与疙瘩皮肤病病毒和山羊痘病毒参考株之间的同源性分别为97%和95.6%。结构预测结果显示,orf121蛋白具有两个N-糖基化位点和一个跨膜区,且具有极强的亲水性。以上结果表明,orf121蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗或/和诊断价值。

关键词：绵羊痘病毒 orf121 糖蛋白序列分析

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Ⅱ型鲤疱疹病毒orf121的多克隆抗体制备及鉴定

Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121的多克隆抗体制备及鉴定

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2018年中国水产学会学术年会

作者：余琳王浩吕利群上海海洋大学国家水生动物病原库上海海洋大学农业部淡水种质资源重点实验室上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心

本实验旨在制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）orf121的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定。利用在线软件TMHMM和BLASTx对CyHV-2-orf121基因进行分析。实验以Ⅱ型鲤疱疹病毒为模板,采用PCR法扩增orf121基因,将其连接到原核载体pGEX-4T-3上,并... 详细信息

本实验旨在制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）orf121的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定。利用在线软件TMHMM和BLASTx对CyHV-2-orf121基因进行分析。实验以Ⅱ型鲤疱疹病毒为模板,采用PCR法扩增orf121基因,将其连接到原核载体pGEX-4T-3上,并将重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21（DE3）后经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,将纯化后的重组orf121蛋白免疫6周龄小鼠制备多克隆抗体,运用western blot和间接免疫荧光技术鉴定多克隆抗体orf121的特异性。结果显示Ⅱ型鲤疱疹病毒的orf121基因在原核表达中能够正确表达重组蛋白,预期大小一致约56KD,主要以不可溶的包涵体存在。经过western-blot显示能够特异性识别重组orf121蛋白和Ⅱ型鲤疱疹病毒感染的RyuF-2细胞,间接免疫荧光进一步说明制备的多克隆抗体能够识别Ⅱ型鲤疱疹病毒感染的RyuF-2细胞。研究表明制备的抗orf121蛋白多克隆抗体能够特异性识别Ⅱ型鲤疱疹病毒,对CyHV-2的检疫检测具有一定的临床应用价值。

关键词： Ⅱ型鲤疱疹病毒 orf121 原核表达多克隆抗体 western blot IFA

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