检索结果-南通市图书馆

APEC E058株tolA基因缺失株生物学特性及其外膜囊泡免疫保护效力的初步研究

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

APEC E058株tolA基因缺失株生物学特性及其外膜囊泡免疫保护效力...

作者：苏森燕扬州大学

学位级别：硕士

禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是导致禽类发病的常见病原菌,能够引起以败血症、广泛组织炎症为特征的禽大肠杆菌病,严重危害养禽业,造成巨大的经济损失。滥用抗生素导致APEC多重耐药菌株的大量增加,依赖... 详细信息

禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是导致禽类发病的常见病原菌,能够引起以败血症、广泛组织炎症为特征的禽大肠杆菌病,严重危害养禽业,造成巨大的经济损失。滥用抗生素导致APEC多重耐药菌株的大量增加,依赖抗生素为主的防治手段面临很大的挑战。利用非药物途径防控APEC是未来发展的必然趋势,而疫苗接种是防控禽大肠杆菌病发生和流行、减少禽产品污染及保证食品安全的重要手段。外膜囊泡（Outer Membrane Vesicless,OMVs）是由革兰阴性菌和部分革兰阳性菌分泌的一种纳米级（20-200 nm）的球形磷脂双层泡状结构,其包裹细菌多种组分,如外膜蛋白,周质蛋白,磷脂分子,脂多糖,核酸等,具有良好的免疫原性和佐剂活性,能有效刺激宿主免疫系统,因而具备开发成新型疫苗的潜力。前期研制基于OMVs的疫苗中发现,APEC野生型菌株在生长中所分泌的OMVs产量偏低。研究报道位于Tol-Pal系统中的tolA基因,在维持细菌外膜稳定性、影响OMVs产出方面发挥着作用,如tolA缺失后能显著增强鲍氏志贺菌4型菌株OMVs的产量。目前,对于tolA基因在APEC中发挥的功能以及对于OMVs产出的影响未见报道。因此,本研究以APEC O2型强毒株E058为亲本,构建了tolA基因缺失株,研究tolA基因对于APEC生物学功能以及OMVs产量的影响,并对其介导的OMVs的免疫保护效力进行初步评价,为开发基于OMVs的新型疫苗提供参考。1 APEC E058株tolA基因缺失株的构建及其生物学特性研究以APEC E058株为亲本,经λRed同源重组技术构建tolA基因缺失株,并将tolA回补构建回复株,对野生株、缺失株和回复株的生物学特性进行比较。生长曲线测定显示,ΔtolA缺失株与野生株在相同培养条件下的生长速度没有差异;透射电镜观察发现缺失株细胞膜表面明显变薄,表面结构不完整;血清杀菌试验结果显示,AtolA缺失株在不同血清浓度（0.5%-25%）下的抗补体杀菌能力显著下降;穿刺半固体培养基观察运动性试验结果显示,在缺失tolA基因后,菌株的运动性明显降低;HD11巨噬细胞吞噬试验结果显示,ΔtolA缺失株在HD11细胞中的存活能力显著下降;半数致死率（50%Lethal Dose,LD50）毒力评价显示,与野生株相比,ΔtolA缺失株的毒力降低了 100倍左右,而回复株毒力恢复至野生株水平;21日龄SPF鸡体内定殖试验结果显示,ΔtolA缺失株在心血、肝脏和肺脏中定殖能力显著下降,表明tolA基因对于APEC E058株的毒力具有明显影响,提示ΔtolA缺失株有作为弱毒疫苗候选株的潜力。2 APEC E058株tolA基因缺失对其外膜囊泡产出的影响通过超滤浓缩超离的方法提取E058野生株和ΔtolA缺失株分泌的OMVs,经透射电镜观察两者OMVs形态、BCA试剂盒检测蛋白浓度、SDS-PAGE对蛋白图谱进行比较分析、检测不同浓度OMVs对HD11细胞胞内相关酶活的影响。透射电镜观察OMVs形态结果显示,野生株和缺失株的OMVs在形态上没有明显区别,均为球形双层膜结构。BCA试剂盒检测结果显示,在培养相同菌量的条件下,ΔtolA缺失株提取的OMVs蛋白含量高于野生株,从浓度上提高了 3.25倍。SDS-PAGE电泳结果显示,缺失tolA基因后,OMVs蛋白图谱有所改变。OMVs与HD11细胞共培养试验结果显示,ΔtolA-OMVs能够显著提高胞内酸性磷酸酶（ACP）、乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,表明tolA介导的OMVs能够激活巨噬细胞并增强巨噬细胞的免疫功能。3 APEC E058株tolA基因缺失株OMVs的免疫保护效力的初步研究为了评价APEC E058株tolA基因缺失株OMVs的免疫保护效力,本研究用提取的E058野生株和ΔtolA缺失株的OMVs免疫商品鸡,进一步对OMVs所产生的免疫保护效果进行研究。通过提取细菌外膜蛋白（Outer Membrane Proteins,OMPs）,建立间接ELISA方法检测OMVs免疫所产生的特异性抗体水平,另外,通过玻板凝集试验检测免疫血清整体抗体效价水平。结果显示,OMVs具有良好的免疫保护效果,E058-OMVs免疫组的保护率可以达到80%以上,Atol4-OMVs免疫组保护率可以达到90%以上。经间接ELISA方法测定,Atol4-OMVs免疫组可以达到较高的IgG水平,且高于E058-OMVs免疫组。病理组织学观察显示,AtolA-OMVs免疫后对APEC造成的组织损伤具有明显的抑制作用。

关键词：禽致病性大肠杆菌 tolA基因生物学特性 OMVs 免疫效力

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

革兰阴性菌外膜囊泡的研究进展

畜牧与兽医 2020年第5期52卷 136-142页

作者：卞志标李冰勾红潮杨君臧莹安李春玲仲恺农业工程学院广东广州510225 广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 茂名市动物疫病预防控制中心广东茂名525000

外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是革兰阴性(G^-)菌从细胞膜上脱落下来的囊泡,携带有细菌的大量组分,如外膜蛋白、脂多糖、脱氧核糖核酸等。由于OMVs无活性、不能复制且具有免疫原性,所以被认为是最具潜力的亚单位疫苗,同时OMV... 详细信息

外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是革兰阴性(G^-)菌从细胞膜上脱落下来的囊泡,携带有细菌的大量组分,如外膜蛋白、脂多糖、脱氧核糖核酸等。由于OMVs无活性、不能复制且具有免疫原性,所以被认为是最具潜力的亚单位疫苗,同时OMVs对细菌本身具有多种作用,故OMVs成为研究的热点。本文从G^-菌OMVs的组成成分、形成机制、生物学功能、提取纯化方法及其开发应用前景5个方面综述其研究现状,为G^-菌的致病机制研究、OMVs的疫苗开发应用提供技术指导。

关键词： OMVs 形成机制组分分析生物学功能

大肠杆菌属Nissle1917胞外囊泡蛋白组分析及其对鼠巨噬细胞功能的免疫调控作用

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

大肠杆菌属Nissle1917胞外囊泡蛋白组分析及其对鼠巨噬细胞功能的...

作者：林华西北农林科技大学

学位级别：硕士

大肠杆菌Nissle 1917(EcN)是一种革兰氏阴性益生菌,因其对肠道疾病有显著的缓解效果而被广泛用于临床治疗中。它能够通过其分泌胞外囊泡调节宿主肠上皮细胞的免疫反应。巨噬细胞是固有免疫反应中的重要免疫细胞,然而关于EcN与巨噬细胞... 详细信息

大肠杆菌Nissle 1917(EcN)是一种革兰氏阴性益生菌,因其对肠道疾病有显著的缓解效果而被广泛用于临床治疗中。它能够通过其分泌胞外囊泡调节宿主肠上皮细胞的免疫反应。巨噬细胞是固有免疫反应中的重要免疫细胞,然而关于EcN与巨噬细胞互作报道甚少。鉴于此,本试验旨在通过分离EcN的胞外囊泡(EcNMVs)探究其对巨噬细胞生物功能的调节作用,并利用蛋白组学技术进一步挖掘影响巨噬细胞功能的潜在免疫信号分子,为EcN在动物肠道中的免疫调节机制提供理论基础。试验包括两部分:(1)首先利用差速离心和梯度密度离心法分离和纯化EcNMVs,用激光纳米颗粒分析仪分析其粒径大小及分布,透射电子显微镜观察其形态结构;利用激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对EcNMVs的内在化;用玻璃珠涂板法测定巨噬细胞吞噬病原性大肠杆菌的数量以探究EcNMVs对巨噬细胞杀菌能力的影响。然后分别用PBS(对照组)、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和20μg/mL EcNMVs刺激RAW264.7巨噬细胞16 h。检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和NO含量以及乳酸脱氢酶(LDH)活性,细胞裂解液中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性;(2)采用液相色谱-质谱联用技术分析EcNMVs蛋白组分;研究结果如下:(1)成功从EcN培养上清中分离纯化出具有磷脂双分子层结构的EcNMVs,其粒径范围是5000 nm,峰值为101.5 nm;(2)EcNMVs能够被RAW 264.7细胞所内化,且EcNMVs能够在5 h后提高RAW264.7细胞的杀菌能力;与对照组相比,不同浓度EcNMVs处理的巨噬细胞的LDH活性没有显著差异(P>0.05);与对照组相比,各浓度EcNMVs处理的巨噬细胞分泌NO含量均显著提高(POMVs作为信号分子的载体,引发RAW 264.7细胞的促炎反应和抗炎反应,调节RAW 264.7细胞生物功能,并且推测此OMVs中携带的鞭毛蛋白和外膜蛋白等与其引起的免疫反应相关。

关键词：大肠杆菌属Nissle1917 OMVs 巨噬细胞生物功能

OMVs通过MAPKs信号通路调控老年人血管钙化的机制

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

OMVs通过MAPKs信号通路调控老年人血管钙化的机制

铜绿假单胞菌降低猪精子活力及作用机制初步研究

2019年中华口腔医学会老年口腔医学专业委员会第十四次...

作者：袁一方郭斌中国人民解放军总医院第一医学中心口腔科

目的:探讨MAPKs信号通路在牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化中的调控机制。方法:构建牙龈卟啉单胞菌OMVs诱导的VSMCs和血管组织钙化模型,提取VSMCs样... 详细信息

目的:探讨MAPKs信号通路在牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化中的调控机制。方法:构建牙龈卟啉单胞菌OMVs诱导的VSMCs和血管组织钙化模型,提取VSMCs样本的RNA和蛋白,通过qRTPCR、ELISA和Western blot检测VSMCs相关因子(α-SMA、SM22α、Runx2、Col1A1、OC、ALP)的基因和蛋白表达情况。以此确定的OMVs最佳浓度为基础,通过尾静脉注射OMVs构建ApoE-/-小鼠的血管钙化模型,收集小鼠血管样本,采用茜素红染色、组织钙盐测定、免疫组化、qRT-PCR、Western blot等技术检测血管钙化情况。利用最佳浓度的OMVs诱导VSMCs钙化,提取样本蛋白,检测ERK1/2、p38 MAPK和JNK的总量和磷酸化表达量。结果:qRT-PCR、ELISA和Western blot可检测到VSMCs相关因子基因和蛋白表达的变化,VSMCs发生骨样分化;小鼠模型可检测到小鼠血管发生钙化;OMVs诱导下钙化的VSMCs中MAPKs信号通路被激活。结论:牙龈卟啉单胞菌分泌的OMVs可引起血管病理性钙化,其机制为OMVs侵入VSMCs,诱导骨向分化,其细胞调控通路为OMVs-MAPKs-Runx2。

关键词： OMVs VSMCs 血管钙化 MAPKs信号通路

来源： cnki会议评论

在线全文

cnki会议

学校读者我要写书评

暂无评论

铜绿假单胞菌降低猪精子活力及作用机制初步研究

作者：李玉华上海交通大学

学位级别：硕士

铜绿假单胞菌是猪精液中普遍存在的优势菌种,通过损伤精子的质膜、顶体及线粒体超微结构等作用方式降低精子活力,影响母猪的受胎率及产仔数。目前,铜绿假单胞菌降低精子活力的具体作用机制尚未明确,尤其铜绿假单胞菌对精子能量代谢及蛋... 详细信息

铜绿假单胞菌是猪精液中普遍存在的优势菌种,通过损伤精子的质膜、顶体及线粒体超微结构等作用方式降低精子活力,影响母猪的受胎率及产仔数。目前,铜绿假单胞菌降低精子活力的具体作用机制尚未明确,尤其铜绿假单胞菌对精子能量代谢及蛋白翻译后修饰水平影响的相关报道甚少。因此,本研究以精子活力的降低为切入点,在评估铜绿假单胞菌对精子作用方式及精子形态学变化的基础上,主要针对精子能量代谢通路及蛋白翻译后修饰水平的变化,深入探究铜绿假单胞菌对精子ATP主要来源的糖酵解及线粒体氧化磷酸化代谢过程,蛋白磷酸化及酰化修饰水平的影响,以期为阐述铜绿假单胞菌影响猪精子活力及作用机制提供理论基础,为制定猪精液质量标准提供参考依据。本研究主要包括以下四个部分:1、本实验利用不同浓度的铜绿假单胞菌处理精子,分析铜绿假单胞菌对精子的具体作用方式。结果显示,随着铜绿假单胞菌浓度的增加,精子的活力显著降低(POMVs等作用方式降低精子活力。2、精子活力的维持主要来源于糖酵解及线粒体氧化磷酸化能量代谢途径,同时与蛋白翻译后修饰水平具有密切联系。铜绿假单胞菌是否通过调控猪精子能量代谢及蛋白翻译后修饰水平降低精子活力?本研究结果显示,随着铜绿假单胞菌浓度的增加,精子糖酵解过程中关键酶GAPDH活性,电子传递链中NADH含量及细胞内ATP水平均显著降低(POMVs在降低猪精子活力方面具有重要作用,为进一步探究OMVs是如何影响精子能量代谢及蛋白翻译后修饰水平,实验利用不同浓度的OMVs处理精子。结果显示,随着OMVs浓度的增加,精子糖酵解过程中关键酶GAPDH活性降低,但未发生显著性差异(P>0.05),电子传递链中NADH含量及细胞内ATP水平均显著降低(P0.05),c AMP水平的降低从而促进蛋白丝/苏氨酸脱磷酸化、酪氨酸脱磷酸化水平,遵循c AMP-PKA信号通路降低猪精子活力。结果提示,OMVs作为铜绿假单胞菌的主要作用方式,但与铜绿假单胞菌影响精子活力及作用机制有所差异,主要通过影响NADH及ATP水平,遵循c AMP-PKA信号通路影响精子蛋白磷酸化修饰降低精子活力。4、为筛选OMVs中降低精子活力的特异性蛋白,利用质谱技术对OMVs蛋白种类及数量初步探究。OMVs共鉴定出152种特异性蛋白,候选蛋白包括氨肽酶(Pa AP)、外膜孔蛋白(Opr F,Opr E,Opr D,Opr H,Opr C)、鞭毛蛋白(Hap 2)及溶血素共调节蛋白(Hcp)等。KEGG通路富集分析结果表明主要涉及氨酰t RNA生物合成,精氨酸生物合成,β-内酰胺抗性,C5支链酸代谢及阳离子抗菌肽抗性等过程;GO功能富集分析结果表明差异表达基因与有机氮化合物代谢过程,胞质组分类别及绑定蛋白分子功能有关。综上所述,铜绿假单胞菌主要通过粘附精子形成纳米管通道及OMVs等作用模式,破坏精子形态结构,抑制精子糖酵解过程中关键酶GAPDH活性,降低线粒体氧化电子传递链中NADH含量及细胞内ATP水平;同时,促进蛋白脱乙酰化和脱琥珀酰化,降低c AMP水平,从而促进蛋白丝/苏氨酸脱磷酸化、酪氨酸脱磷酸化水平,磷酸化变化遵循c AMP-PKA信号通路进而降低猪精子活力。

关键词：猪精子铜绿假单胞菌 OMVs 能量代谢蛋白翻译后修饰

hhdA对HPS外膜囊泡组分及主要生物学功能的影响

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

hhdA对HPS外膜囊泡组分及主要生物学功能的影响

作者：卞志标仲恺农业工程学院

学位级别：硕士

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）能引起猪的革拉瑟氏病,临床表现为关节炎,脑膜炎和浆膜炎等症状,致死率较高,是目前国内外规模化猪场威胁最严重的细菌性传染病之一。抗生素是防治该菌的主要药物,由于近些年耐药菌株的不断增加... 详细信息

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）能引起猪的革拉瑟氏病,临床表现为关节炎,脑膜炎和浆膜炎等症状,致死率较高,是目前国内外规模化猪场威胁最严重的细菌性传染病之一。抗生素是防治该菌的主要药物,由于近些年耐药菌株的不断增加,疫苗免疫成为防治该菌的主要方式,但是该菌血清型众多,且缺乏有效的交叉免疫保护,研发新型有效的副猪嗜血杆菌疫苗是解决问题的当务之急。外膜囊泡（Outer membrane vesicles,OMVs）是革兰氏阴性菌在生长阶段,由细菌向外周环境释放的微小囊泡,其中包括脂多糖、蛋白质、核酸、溶血素等。其成分不仅仅是引起病变的毒力因子,同时也具有良好的免疫原性,是极具潜力的新型疫苗抗原。我们前期的研究也证实OMVs具有良好免疫原性,同时也具有致炎作用。溶血素是副猪嗜血杆菌中潜在的毒素因子之一,它不仅存在于菌体上,也能够随OMVs分泌到菌体外,但是在溶血素对OMVs功能影响方面还未有报道。本试验选用血清型5型的强致病毒株H45菌株与其溶血素相关基因缺失株ΔhhdA（hemolysin of Haemophilus ducreyi）菌株为研究对象,然后分别将两者提取纯化得到OMVs,使用透射电镜对两者OMVs进行形态观察,并对OMVs的蛋白组分进行初步的比较分析。进一步使用OMVs作为免疫原对试验豚鼠进行滴鼻和注射接种,通过对试验豚鼠的组织切片观察和早期细胞因子的测定,分析hhdA基因缺失对OMVs致炎作用的影响。通过对豚鼠IgA抗体、IgG抗体以及IFN-γ和IL-8细胞因子的测定,分析hhdA基因缺失对OMVs免疫原性的影响。试验结果及结论:（1）hhdA基因缺失对OMVs的形态和蛋白组分无明显影响;（2）H45 OMVs能够诱导比ΔhhdAH45 OMVs更高水平的IL-1β和IFN-γ分泌,所以hhdA基因缺失能够降低OMVs的致炎反应;（3）H45 OMVs能够诱导比ΔhhdAH45 OMVs更高水平的IgG抗体反应,但是对IL-8、IFN-γ和IgA的分泌量无显著差异。所以hhdA基因缺失能够降低OMVs的体液免疫反应,但是在黏膜免疫和细胞免疫方面无明显影响。

关键词：副猪嗜血杆菌 OMVs hhdA 致炎性免疫原性

一株抗碳青霉烯抗生素的铜绿假单胞菌突变体的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

一株抗碳青霉烯抗生素的铜绿假单胞菌突变体的研究

作者：李晶西北大学

学位级别：硕士

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是一种医院里三大常见的机会致病菌之一,据2014年CHINET中国细菌耐药性监测网报告,PA是我国医院第二大易感染的革兰氏阴性致病菌。这种革兰氏阴性菌因为自身的固有耐药性和获得性耐药性而具有... 详细信息

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是一种医院里三大常见的机会致病菌之一,据2014年CHINET中国细菌耐药性监测网报告,PA是我国医院第二大易感染的革兰氏阴性致病菌。这种革兰氏阴性菌因为自身的固有耐药性和获得性耐药性而具有多种耐药机制,如：产生由基因组或者质粒编码的β-内酰胺酶,降低外膜渗透性阻止了抗生素进入细胞内,形成生物被膜等耐药机制。因此给临床治疗带来很大的挑战。BK3是一株对碳青霉烯类抗生素产生耐药性的PAO1转座突变体。通过随机PCR和测序确定转座子正向插在操纵子PA4639-4638与PA4640的问隔区,其中PA4639与PA4638位于同一操纵子上。另外,PA4639-4638的启动方向与转座子上带有的强启动子的启动方向一致,因此推测BK3耐药性的增加,可能是山于对PA4639-4638的破坏或过表达而引起的。通过构建PAO1(APA4639) PAO1(APA4639-4638)以及过表达菌株PAO1(pAK4639-4638),并对它们进行耐药性检测,发现BK3突变体产生较强耐药性的原因不是由于基因功能被破坏引起的,而是PA4639-4638过表达引起的。同时发现,在PAO 1 A4639-4638操纵子中,基因PA4639和PA4638对PA的耐药性均有影响,因为分别过表达这两个基因都导致PA耐药性增加,但是,过表达PA4639产生接近于转座突变体的耐药性。说明在PA4639-4638中PA4639对耐药性起重要作用。使用YRCPDR、TMHMM和NCBI-CDD,对PA4639的氨基酸序列进行分析表明,PA4639的氨基酸序列的N端含有Ⅱ型脂蛋白信号肽,并且紧跟其后含有保守的“脂盒结构”,因此是PA4639编码的是一种分泌到细胞内膜外的假定脂蛋白。这种假定脂蛋白,属于脂蛋白-16-超家族。另外,有研究表明,在PAO1中提取的外膜泡囊(OMVs)破碎后,并对相关蛋白进行微阵列分析,在这些蛋白中发现有PA4639编码的假定脂蛋白。因此PA4639编码的假定脂蛋白可能与OMVs有关。通过检测细胞外β-内酰胺酶的活性发现过表达PA4639-4638使β-内酰胺酶在胞外的活性升高;进一步通过纸片协同实验和检测AampC(pAK4639-4638)胞外β-内酰胺酶活性,表明过表达PA4639-4638主要是增加了胞外AmpC的活性而不是ESBLs和MBLs。另一方面,通过纸片扩散实验发现,与PAO1 ΔampC(pAK1900)相比,PAO1 ΔawpC(pAK4639)对碳青霉烯类抗生素仍有抗性,说明过表达PA4639除了增加了AmpC的活性还通过其他途径增加了耐药性。已有研究表明缺少脂蛋白时外膜泡囊(OMVs)的产量会升高,而OMVs中包裹有大量的毒性因子。通过植物侵染模型发现,过表达PA4639会降低毒性。这可能与PA4639编码的假定脂蛋白影响了OMVs的形成有关。

关键词：铜绿假单胞菌耐药性 β-内酰胺类抗生素脂蛋白 OMVs AmpC

CRISPR/Cas9的外膜囊泡转运与无乳链球菌清除

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

热带生物学报 2018年第3期9卷 295-301页

作者：侯国锋曾家伟羊熙春王爱媛刘亚欣曾纪锋郭桂英杨诺李迁郑继平海南大学热带农林学院海口570228 海南大学教务处海口570228 海南大学网络与教育技术中心海口570228

人工核酸内切酶技术CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)/Cas9是当前最有效的基因编辑工具。外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)是细菌主动分泌和吸收的双层膜结构,具有运载DNA、蛋白等多种物质的能力。为探究以OMVs为CRISPR编辑工具的转运载体、用于病原菌清除的可行性,本研究以高致病性无乳链球菌(Streptococcus agalactiae or Group B Streptococcus,GBS)为材料,在原有CRISRR质粒p Cas9的基础上,通过分子克隆,构建穿梭质粒p Cas9-2. 0和具有靶向剪切无乳链球菌cfb基因的毒性质粒p Cas9-cfb,将质粒p Cas9-cfb转入asd缺陷型大肠杆菌X6097后,一方面进行重组菌的OMVs制备、电镜观察和DNA分析,另一方面与GBS混合培养,最后在选择平板上对GBS菌落计数。结果显示,重组了质粒p Cas9-cfb的X6097能够分泌OMVs且内含质粒;实验组平板上没有GBS菌落产生;对照组平板上菌落经鉴定皆为含p Cas9-2. 0的GBS,且菌落数量随共培养时间的延长和卡那霉素(Kan)的浓度升高而增多。综上可见,OMVs可以运载CRISPR为染色体剪切工具、并实现对靶向病原菌的定向清除,但受OMVs分泌量的限制消除效率较低。同传统的预防性疫苗相比,本研究为病原菌清除提供了一个新的研究方向;同当前以噬菌体为载体的研究思路相比,本方法更简便、成本更低。另外,本研究也为难以进行电击转化的菌株提供了一个更简单的质粒转化方法。

关键词： CRISPR OMVs 无乳链球菌病原菌清除质粒转化

The lytic mechanism of Escherichia coli α-hemolysin associated to outer membrane vesicles

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

Health 2010年第5期2卷 484-492页

作者： Vanesa Herlax Maria Florencia Henning Ana María Bernasconi Felix María Goni Laura Bakas Instituto de Investigaciones Bioquimicas La Plata (INIBIOLP) CCT-La Plata CONICET UNLP Facultad de Ciencias Medicas

Alpha-hemolysin (HlyA) is an extracellular toxin secreted by Escherichia coli, targeting to plasma membranes of eukaryotic cells. Recently it was found that this toxin is released to external media associated to bacterial outer membrane vesicles (OMVs), but the hemolytic mechanism in this way has not been studied yet. Our results report that HlyA is the only protein present in OMVs that is responsible for erythrocyte lysis, and show that no fusion event is involved in the lytic mechanism of OMVs-HlyA. Furthermore, the specific hemolytic activity is approximately 10 fold higher than that of purified free-HlyA, showing the same relative lysis efficiency and specificity for erythrocytes from different species. OMVs could be an important auxiliary way of secretion, acting mainly as a concentration mechanism of HlyA near the target cells. Cell lysis would occur after toxin transfer from OMVs to target membranes, as demonstrated by hemolysis kinetic studies, lipid mixing and western blot assays.

关键词： OMVs Toxin Lipid Mixing Hemolytic Activity Erythrocytes