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黑龙江畜牧兽医 2023年第9期 67-72,79页

作者：刘栋薛少华龙凡利梁蓉娟吴剑梅郑新添李晓华龙岩学院生命科学学院福建龙岩364012 福建农林大学动物科学学院福州350000 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室福建龙岩364012 动物源性人兽共患病防控福建省高校工程研究中心福建龙岩364012

为探究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白(outer membrane prtein,omp)免疫刺激复合物(immune stimulating complexs,ISCOM)的抗原性,试验采用PCR方法扩增HPS的omp5基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,获得重组表达质粒pET-28a-omp5;进一步以QuilA、胆固醇和磷脂酰胆碱为原料,用透析法制备HPS omp5抗原免疫刺激复合物(ISCOM-omp5),用其免疫ICR小鼠后检测HPS抗体水平、细胞因子基因相对表达量及淋巴细胞增殖情况,以评价ISCOM-omp5的免疫增强效果。结果表明:构建的重组表达质粒能够成功表达目的蛋白,大小约为40 ku;制备的ISCOM-omp5具有ISCOM的典型蜂窝状结构,直径为30~40 nm,ISCOM-omp5蛋白的包封率达85.8%;用ISCOM-omp5对小鼠进行免疫,二免后14天即可在小鼠血清中检测到较高水平HPS抗体;ISCOM-omp5能极显著提高白细胞介素-10(IL-10)和γ干扰素(IFN-γ)基因的相对表达量(P5),极显著提高B淋巴细胞的增殖能力(Pomp5可有效诱导小鼠产生针对HPS的免疫应答,能显著增强免疫效果。

关键词：副猪嗜血杆菌免疫刺激复合物 omp5 小鼠细胞因子

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副猪嗜血杆菌omp5单克隆抗体的制备与鉴定

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中国兽医学报 2012年第10期32卷 1468-1472页

作者：秦翠丽高祥辉李春玲河南科技大学河南洛阳471003 广东省农业科学院兽医研究所广东广州510640 广东省兽医公共卫生公共实验室广东广州510640

用副猪嗜血杆菌(HPS)血清5型灭活菌液免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以HPS外膜蛋白5(omp5)为抗原,经间接ELISA法筛选阳性融合孔,并用有限稀释法对筛选的阳性孔进行亚克隆,获得2株分泌抗HPS omp5单克隆抗体的杂交瘤细... 详细信息

用副猪嗜血杆菌(HPS)血清5型灭活菌液免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以HPS外膜蛋白5(omp5)为抗原,经间接ELISA法筛选阳性融合孔,并用有限稀释法对筛选的阳性孔进行亚克隆,获得2株分泌抗HPS omp5单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2和8D9;间接ELISA法效价检测,1E2和8D9细胞培养上清抗体效价均为1∶2 560,纯化后腹水抗体效价分别为1∶204 800和1∶51 200;抗体型别鉴定,1E2和8D9分别分泌IgG2b、IgG2a型抗体;特异性检测表明,2株单抗均能特异识别omp5。将2株杂交瘤细胞反复冻融3次复苏后仍能稳定分泌抗体。2株抗HPS omp5单克隆抗体的成功制备,将为HPS感染快速检测方法的建立以及检测试剂的研制奠定基础。

关键词：副猪嗜血杆菌 omp5 单克隆抗体杂交瘤技术

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副猪嗜血杆菌病Neu、Lipo、omp5蛋白的原核表达及免疫原性分析

副猪嗜血杆菌病Neu、Lipo、OMP5蛋白的原核表达及免疫原性分析

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作者：刘俊琦湖南农业大学

学位级别：硕士

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)属于巴斯德菌科的嗜血菌属的革兰氏阴性菌,能引起猪的Glasser病,主要特征为纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。HPS感染猪,影响2周龄到4月龄的青年猪,主要在断奶前后和保育阶段发病,发病率一般在1... 详细信息

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)属于巴斯德菌科的嗜血菌属的革兰氏阴性菌,能引起猪的Glasser病,主要特征为纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。HPS感染猪,影响2周龄到4月龄的青年猪,主要在断奶前后和保育阶段发病,发病率一般在10%-15%,严重时患病猪死亡率可达50%,给养殖业造成巨大经济损失。目前预防该病注射的疫苗为灭活苗,但是副猪嗜血杆菌血清型多样且很大比例不能进行分型,菌株间毒力差异也较大,目前还没有一种灭活苗能同时对所有致病菌产生交叉保护。随着分子生物学技术的快速发展,疫苗的研究方向也转向基因工程疫苗。本实验通过将副猪嗜血杆菌的Lipo、Neu、omp5基因克隆及原核表达,并将三个蛋白分别免疫昆明小鼠研究其免疫原性。现将主要的工作及结果报道如下：(一)、根据GenBank中的副猪嗜血杆菌序列(登陆号：CP001321.1)设计特异性引物扩增Lipo基因,再将Lipo基因克隆到pMD18-T载体上。以pMDLipo为模板用PCR方法扩增Lipo成熟肽编码区。通过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切处理Lipo PCR回收产物与表达载体pBV220,将Lipo基因连接至pBV220中。SDS-PAGE电泳检测显示重组质粒pBV-Lipo在大肠杆菌Rosetta (DE3)中实现高效表达,lipo蛋白为可溶性表达,并通过硫酸铵沉淀纯化lipo蛋白。(二)、根据GenBank中的副猪嗜血杆菌鸟枪序列(登陆号：NZ-ABKM01000006)设计特异性引物扩增Neu全基因,再将Neu全基因克隆到pMD18-T载体上。以pMDNeu为模板PCR方法扩增Neu部分基因。通过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切处理Neu PCR回收产物与表达载体pET-28a(+),将Neu基因连接至pET-28a(+)中。将连接产物转入大肠杆菌DH5α,通过PCR和酶切挑选阳性质粒,再将阳性质粒转入Rosetta (DE3)进行诱导。SDS-PAGE检测显示pET-Neu在大肠杆菌Rosetta (DE3)中实现高效表达, Neu蛋白以包涵体形式表达,用tritonX-100等洗涤包涵体。(三)、根据GenBank中的副猪嗜血杆菌鸟枪序列(登陆号：NC-011852)设计引物扩增omp5全基因,再将omp5全基因克隆到pMD18-T载体上。通过摸索酶切条件,用EcoRⅠ和SalⅠ将pMDomp5质粒与表达载体pET-28a(+)进行双酶切,将omp5基因连接至载体质粒pET-28a(+)中。连接产物转入至大肠杆菌DH5α通过PCR和酶切挑选阳性质粒,再将阳性质粒转入Rosetta (DE3)进行诱导。SDS-PAGE检测显示pET-omp5在大肠杆菌Rosetta (DE3)中实现高效表达,omp5蛋白以包涵体形式表达,用tritonX-100等洗涤包涵体。(四)、将重组纯化的Lipo、Neu、omp5蛋白分别分两组,一组使用弗氏佐剂;另一组使用氢氧化铝佐剂。初次免疫后的14天和21天进行加强免疫,总共免疫3次,每次剂量为50μg/只;对照组未免疫任何蛋白,使用生理盐水。以致死量HPs对免疫小鼠和对照组小鼠进行攻毒。各实验组的攻毒保护结果如下：Neu-弗氏佐剂组的保护率为60%(6/10),Neu-氢氧化铝佐剂组的保护率为10%(1/10);omp5-弗氏佐剂组的保护率为30%(3/10),omp5-氢氧化铝佐剂组的保护率为11.1%(1/9);Lipo-弗氏佐剂组的保护率为86.6%(8/9),免疫Lipo和氢氧化铝佐剂组的保护率为50%(5/10);未免疫蛋白采用致死量攻毒的对照组小鼠,在攻毒后全部死亡;而未免疫蛋白注射灭活HPs的对照组小鼠,在注射4h内部分小鼠精神萎靡,但4h后很快恢复正常,精神转好。结果显示了这三个重组蛋白都能对小鼠起到保护作用,证明Lipo、Neu、omp5都具有一定的免疫源性,其中Lipo蛋白明显高于Neu、omp5,但是效果均不如灭活组。

关键词：副猪嗜血杆菌 Lipo Neu omp5 克隆表达免疫原性

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