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流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

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中国兽医科学 2007年第6期37卷 465-468页

作者：杨春华邱昌庆曹小安中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增,得到了1条完整的基因,大小为642 bp;测序分析证明,它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGE... 详细信息

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增,得到了1条完整的基因,大小为642 bp;测序分析证明,它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约50 ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Western-blotting试验证明,表达蛋白omp25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。

关键词：流产布鲁氏菌 omp25基因克隆原核表达

宁夏地区布鲁氏菌临床分离株omp25基因序列特征分析

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中国病原生物学杂志 2013年第12期8卷 1069-1073页

作者：马学平高建炜詹军李丽宁夏回族自治区疾病预防控制中心宁夏银川750004

目的采用PCR法扩增宁夏地区布鲁氏菌临床分离株omp25基因并测序,分析omp25基因序列特征,为布鲁氏菌鉴定以及基因克隆与表达研究提供参考。方法参考GenBank公布的布鲁氏菌外膜蛋白omp25基因序列设计1对引物,采用PCR法从宁夏地区分离株布... 详细信息

目的采用PCR法扩增宁夏地区布鲁氏菌临床分离株omp25基因并测序,分析omp25基因序列特征,为布鲁氏菌鉴定以及基因克隆与表达研究提供参考。方法参考GenBank公布的布鲁氏菌外膜蛋白omp25基因序列设计1对引物,采用PCR法从宁夏地区分离株布鲁氏菌基因组中扩增omp25基因并进行双向测序,测序结果用Contig Express软件拼接,采用DNAstar软件进行分析。结果经鉴定,两分离株布鲁氏菌均为羊种3型,测序获得omp25基因全长序列为638bp,编码212个氨基酸,核苷酸序列与GenBank公布羊种布鲁氏菌omp25基因同源性为99.9%,氨基酸序列同源性为99.7%。系统进化树显示,分离株与参考株布鲁氏菌亲缘关系相近,与羊种布鲁氏菌为同一个分枝。结论宁夏地区布鲁氏菌分离株omp25基因序列与参考菌株序列同源性高,且与羊种布鲁氏菌在同一分枝,表明omp25基因序列是一个保守序列。该研究结果可为布鲁氏菌的分子生物学鉴定和诊断试剂的研制提供参考。

关键词：布鲁氏菌 omp25基因序列特征分析

羊种布氏杆菌3型omp25基因序列及其表达蛋白生物信息学分析

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江苏农业科学 2016年第4期44卷 25-28页

作者：贺容张生珍王超刁正鹏薛红梅徐立青李增魁青海大学农牧学院动物医学系青海西宁810000 青海省地方病预防控制所青海西宁810000

为进一步研究外膜蛋白omp25的结构和功能,以羊种布氏杆菌3型青海省海晏县自然株为研究对象,通过基因的克隆测序,采用生物信息学方法对外膜蛋白omp25基因及其编码的氨基酸序列的理化性质、分子结构、分子表面可能性、柔韧性、亲水性、抗... 详细信息

为进一步研究外膜蛋白omp25的结构和功能,以羊种布氏杆菌3型青海省海晏县自然株为研究对象,通过基因的克隆测序,采用生物信息学方法对外膜蛋白omp25基因及其编码的氨基酸序列的理化性质、分子结构、分子表面可能性、柔韧性、亲水性、抗原指数、B细胞抗原表位进行了详细分析。结果显示:羊种布氏杆菌3型omp25分子一级结构的氨基酸序列的各项参数存在5段共同区段,其中59~74、93~112、182~202位氨基酸的各项生物信息学参数尤为突出,是其B细胞表位优势区的可能性很大。

关键词：羊种布氏杆菌3型 omp25基因序列测定生物信息学分析

布鲁氏菌omp25基因缺失株的构建及对细胞自噬的影响

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布鲁氏菌omp25基因缺失株的构建及对细胞自噬的影响

作者：陈瑞花石河子大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病是一种人畜共患的慢性传染病，动物感染该病后的表现为母畜的流产和公畜的睾丸炎，对人而言，感染该病后可引起人的波浪热，关节炎以及肌肉疼痛等。布鲁氏菌（Brucella）作为布鲁氏菌病的病原菌，其在宿主内的生存机制一直都... 详细信息

布鲁氏菌病是一种人畜共患的慢性传染病，动物感染该病后的表现为母畜的流产和公畜的睾丸炎，对人而言，感染该病后可引起人的波浪热，关节炎以及肌肉疼痛等。布鲁氏菌（Brucella）作为布鲁氏菌病的病原菌，其在宿主内的生存机制一直都是研究的热点。布鲁氏菌本身不产生内毒素，其逃避宿主的免疫系统的杀伤作用主要是通过各种毒力因子实现的，外膜蛋白就是布鲁氏菌的重要毒力因子之一，因此本文从布鲁氏菌的外膜蛋白基因omp25基因入手，通过以下三个实验在细胞水平和个体水平上探讨布鲁氏菌在侵袭宿主时，omp25基因缺失株的毒力和对细胞自噬的影响。 1根据GenBank中发表的布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的基因序列，设计一对引物，通过PCR方法扩增omp25基因的DNA片段，将扩增片段克隆至T载体中，构建克隆载体pMD-T-omp25，经PCR筛选出阳性克隆菌并测序鉴定，分别将pET28a-GFP质粒和测序成功的pMD-T-omp25质粒用限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，并将回收的omp25基因片段、pET28a-GFP片段进行连接，构建原核表达载体pET28a-GFP-omp25，将表达载体转化至表达菌***21(DE3)中，并纯化出带有绿色荧光的omp25蛋白，进行Westernblot分析可知，omp25蛋白具有良好的反应原性。 2根据GenBank中发表的布鲁氏菌omp25基因序列的上下游基因序列设计两对上下臂引物，通过PCR方法分别扩增上下臂基因序列，然后用融合PCR的方法将回收的上下游基因片段融合并扩增。以枯草芽孢杆菌的SacB基因设计特异性引物并扩增SacB基因序列。然后将融合片段与SacB基因序列分别连接到克隆载体pMD19-Tsimple上，上下游融合片段经XholI与SacI双酶切后连接至自杀载体pGEM-7zf+上，得到pGEM-7zf-omp25自杀载体，再将SacB基因经SacI单酶切连接到带目的基因的自杀载体中，获得pGEM-7zf-omp25-SacB自杀质粒，将自杀质粒电转化至布鲁氏菌2308感受态细胞，经过在细菌内部同源重组后，分别经100mg/L氨苄抗性筛选和8%蔗糖敏感性筛选，获得omp25基因突变株，突变株在无抗性布鲁氏菌培养基上传15代，成功获得遗传稳定的2308omp25株。用2308omp25侵染人胚胎滋养层细胞（HPT-8），进行胞内细菌CFU计数，在细胞水平上对2308omp25进行毒力评价;用2308omp25感染小鼠，进行小鼠脾脏CFU计数，在个体水平上对2308omp25进行毒力评价，发现缺失株的毒力介于强毒株2308与疫苗株RB51之间。 3分别用基因缺失株2308omp25、流产布鲁氏菌（***）强毒株2308，以及疫苗株RB51侵染胚胎滋养层细胞HPT-8，选用兔抗人LC3一抗、兔抗人Beclin1一抗和羊抗兔IgG荧光二抗，用免疫组织化学方法制备细胞免疫荧光切片，通过激光共聚焦显微镜观察细胞免疫荧光切片，记录各个细胞免疫荧光切片的平均荧光强度，分析各菌株对细胞自噬的作用程度，同时在各菌株侵染胚胎滋养层细胞HPT-8后，提取细胞总RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板，运用实时定量PCR方法，检测细胞内的自噬相关基因LC3和Beclin1的表达量，分析2308omp25对细胞自噬的影响。综合分析发现△omp25对细胞自噬有较大的影响。

关键词：布鲁氏菌 omp25基因自噬胚胎滋养层细胞

慢病毒介导的过表达omp25基因对小胶质细胞的影响及其分子机制

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慢病毒介导的过表达Omp25基因对小胶质细胞的影响及其分子机制

作者：马晓娟宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的通过慢病毒介导的omp25基因转染小鼠小胶质(BV2)细胞,观察omp25蛋白的表达情况,探索布鲁氏杆菌毒力因子omp25过表达对BV2细胞的炎症反应作用,为进一步揭示0mp25基因在布鲁氏杆菌中枢神经系统感染中的分子致病机制提供理论基础。方... 详细信息

目的通过慢病毒介导的omp25基因转染小鼠小胶质(BV2)细胞,观察omp25蛋白的表达情况,探索布鲁氏杆菌毒力因子omp25过表达对BV2细胞的炎症反应作用,为进一步揭示0mp25基因在布鲁氏杆菌中枢神经系统感染中的分子致病机制提供理论基础。方法选取处于对数期生长的BV2细胞,实验分为三组:感染omp25重组慢病毒过表达载体(LV-omp25-GFP组)作为实验组,感染慢病毒阴性载体组(LV-GFP组)作为阴性对照组,另设空白对照组。感染72h后:在荧光显微镜下观察荧光表达情况,判断慢病毒转染效率,同时流式细胞仪荧光分选稳定表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的BV2细胞,用于以下实验:(1)电子透射电镜:观察慢病毒感染组及空白对照组细胞结构,观察细胞在感染前后超微结构的变化。(2)分别提取各组RNA、DNA,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测细胞中omp25基因mRNA和蛋白的表达水平,从转录水平和蛋白水平验证omp25表达成功与否。(3)分别收集LV-omp25-GFP组、LV-GFP组、空白对照组细胞上清液,用ELISA试剂盒检测细胞炎性因子TNF-α、IL-6、NO的分泌。(4)NF-κB信号通路特异性抑制剂BAY11-7082 5um预处理BV2细胞60min后,加入MOI值为50的LV-omp25-GFP 50ul感染BV2细胞,同时设置对照组,72h后收集实验组及对照组细胞及培养上清液,RT-PCR及ELISA检测炎性因子mRNA水平和蛋白水平的表达情况。多组均数间的比较采用单因素方差分析,Pomp25-GFP组荧光显微镜下可见GFP的表达,约有超过85%的细胞发出绿色荧光,空白对照组由于未感染慢病毒,荧光显微镜下未见GFP的表达。(2)ELISA结果显示,感染72h后,LV-omp25-GFP组与空白组及LV-GFP组比较差异均有统计学意义(P﹤0.05),LV-GFP与空白对照组比较无统计学意义(P>0.05)。(3)定量PCR结果显示:以空白对照组为1进行比较,慢病毒组omp25基因的mRNA表达水平明显上调,其表达量较空白对照组和GFP组明显上调,差异均具有明显的统计学意义(P0.05)。表明BV2细胞成功过表达omp25基因。(4)Western blot结果:LV-omp25-GFP组较对照组所检测灰度值升高,提示omp25慢病毒感染BV2细胞后omp25蛋白成功过表达。(5)电子透射电镜结果显示:LV-omp25-GFP组较对照组细胞内可见长且丰富的伪足,大量的脂质空泡、髓样小体,线粒体嵴被大量破坏,细胞胞质内有一些大小不等的吞噬泡,其中含多少不等的慢病毒颗粒凝聚,溶酶体增多。(6)BV2细胞用BAY11-7082预处理60min后转染LV-omp25-GFP,72h收集细胞和培养上清,荧光定量及ELISA分别从mRNA和蛋白水平检测TNF-α、IL-6、NO的表达。结果显示加入信号通路抑制剂后能够明显抑制omp25过表达慢病毒诱导TNF-α、IL-6、NO的产生,证明NF-κB信号通路可能参与诱导促炎因子TNF-α、IL-6、NO的产生。结论建立omp25慢病毒过表达载体转染BV2细胞的模型,推测BV2细胞通过内吞将omp25过表达慢病毒颗粒吞噬进入细胞内,改变细胞超微结构,进而影响细胞内环境,可能导致细胞凋亡;omp25过表达可激活NF-κB信号通路导致BV2细胞促炎因子TNF-α、IL-6、NO分泌增多,其可能是神经型布鲁氏杆菌病的分子机制之一。

关键词：布鲁氏杆菌 omp25基因慢病毒 BV2细胞 NF-κB信号通路

长沙人间布鲁菌分离株omp25基因扩增和系统进化分析

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中国热带医学 2017年第8期17卷 761-765页

作者：苏良裴瑞青杨柳青欧新华申晓君孙边成长沙市疾病预防控制中心湖南长沙410004

目的了解长沙地区人间布鲁菌omp25基因的序列特征并阐明其系统进化关系,为布鲁菌病防控以及omp25基因克隆与表达研究提供参考。方法根据Gen Bank公布的羊种布鲁菌16M的omp25基因序列设计1对PCR引物,采用PCR法从长沙地区布鲁菌分离株基... 详细信息

目的了解长沙地区人间布鲁菌omp25基因的序列特征并阐明其系统进化关系,为布鲁菌病防控以及omp25基因克隆与表达研究提供参考。方法根据Gen Bank公布的羊种布鲁菌16M的omp25基因序列设计1对PCR引物,采用PCR法从长沙地区布鲁菌分离株基因组中扩增omp25基因,产物用凝胶电泳进行分析后进行双向核苷酸序列测定,测序结果用DNAstar 7.1进行分析,将测序结果提交Gen Bank,并利用Mega 7软件构建布鲁菌长沙分离株系统进化树。结果 41株布鲁菌成功扩增出omp25基因片段,片段长度约640 bp,通过测序后Blast同源性分析,证实41株菌株均为羊种布鲁菌,长沙分离株与10株羊种布鲁菌序列100%相同,进化树显示长沙分离的布鲁菌和国内外羊种布鲁菌位于同一进化分支上,同广西的LA1105参考株亲缘关系最近。结论长沙地区人间布鲁菌分离株omp25基因序列与参考菌株序列同源性高,且与羊种布鲁菌在同一分支,表明omp25基因序列是一个保守序列。该研究结果可为布鲁菌的分子生物学鉴定和诊断试剂的研制提供参考。

关键词：布鲁菌病布鲁菌 omp25基因进化分析

新疆地区绵羊布鲁氏菌omp25基因PCR扩增研究

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动物医学进展 2005年第7期26卷 74-76页

作者：柳建新陈创夫王远志石河子大学动物科技学院

根据GenBank发表的绵羊布鲁氏菌标准菌株(63/290)的omp25基因序列设计引物,以新疆地区绵羊布鲁氏菌(80/019)基因组DNA为模板,探索PCR反应的各种条件以确定最适PCR反应条件。结果扩增出清晰的omp25目的基因片段,为今后进行omp25的分子生... 详细信息

根据GenBank发表的绵羊布鲁氏菌标准菌株(63/290)的omp25基因序列设计引物,以新疆地区绵羊布鲁氏菌(80/019)基因组DNA为模板,探索PCR反应的各种条件以确定最适PCR反应条件。结果扩增出清晰的omp25目的基因片段,为今后进行omp25的分子生物学特性的研究奠定基础。

关键词：绵羊布鲁氏菌 omp25基因 PCR

环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测布鲁氏杆菌

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食品与生物技术学报 2017年第12期36卷 1276-1282页

作者：李秀梅梁智选李颖郭恋王健春赵静王红军天津市动物疫病预防控制中心天津300402 天津市畜牧业发展服务中心天津300384

将环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)联合应用,建立了一种快速、便捷的布鲁氏杆菌检测方法。针对布鲁氏杆菌omp25基因设计4条特异性引物和1条异硫氰酸... 详细信息

将环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)联合应用,建立了一种快速、便捷的布鲁氏杆菌检测方法。针对布鲁氏杆菌omp25基因设计4条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针。生物素标记LAMP扩增产物能够特异性地与FITC标记的探针杂交,杂交产物经LFD检测。优化后的扩增温度和时间为63℃反应50 min,加上样品的前处理,完成检测仅需80 min。LAMP-LFD方法可特异性地检出布鲁氏杆菌,其最低检测限为5.4×100CFU/mL,是利用外引物建立的PCR方法的100倍。试验结果表明,本研究建立的LAMP-LFD方法能够快速、特异地检测布鲁氏杆菌;简单经济,不需要其他辅助仪器,结果即可直观判断;适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用,具有较高的推广价值。

关键词：布鲁氏杆菌 omp25基因环介导等温扩增横向流动试纸条检测

乳牛布鲁氏菌病PCR诊断试剂盒的实验室评估

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中国兽医科技 2005年第9期35卷 712-717页

作者：曹小安邱昌庆周继章杨春华高双娣程淑敏中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃兰州730046

对前期研制的布鲁氏菌omp25基因-PCR试剂盒的保存期、特异性和可重复性进行了测定,并应用该试剂盒对采自宁夏、甘肃、内蒙古、山西、黑龙江、新疆省(区)的98头血清凝集试验(SAT)阳性乳牛的6批98份乳样和350头SAT阴性乳牛的2批350份乳样... 详细信息

对前期研制的布鲁氏菌omp25基因-PCR试剂盒的保存期、特异性和可重复性进行了测定,并应用该试剂盒对采自宁夏、甘肃、内蒙古、山西、黑龙江、新疆省(区)的98头血清凝集试验(SAT)阳性乳牛的6批98份乳样和350头SAT阴性乳牛的2批350份乳样进行了检测。检测结果显示,PCR试剂盒与SAT的阳性符合率为100%(98/98),阴性符合率为97.71%(342/350);从SAT阴性乳牛的乳样中,用PCR试剂盒检出8份阳性,表明其敏感性高于SAT;对2株田间野毒Br-gs和Br-nmg株进行了克隆与测序,二者与标准菌株序列的同源性分别为99.8%和100%。试验结果证实,本试剂盒的可重复性良好,特异性较高,-20℃下的有效保存期为5个月。

关键词：流产布鲁氏菌 PCR试剂盒 omp25基因乳样实验室评估