检索结果-南通市图书馆

作者：刘璐华中农业大学

学位级别：硕士

天然免疫是机体抵御外来病原微生物侵袭的第一道防线,模式识别受体(PRRs)与病原相关分子模式(PAMPs)之间的相互作用是激活天然免疫的关键。酮戊二酸脱氢酶(Oxoglutarate Dehydrogenas,ogdh)是α-酮戊二酸脱氢酶复合体的E1组件,位于线粒... 详细信息

天然免疫是机体抵御外来病原微生物侵袭的第一道防线,模式识别受体(PRRs)与病原相关分子模式(PAMPs)之间的相互作用是激活天然免疫的关键。酮戊二酸脱氢酶(Oxoglutarate Dehydrogenas,ogdh)是α-酮戊二酸脱氢酶复合体的E1组件,位于线粒体基质。α-酮戊二酸脱氢酶是三羧酸循环(TAC)中的第三个调节位点,能够催化α-酮戊二酸脱氢、脱羧,生成琥珀酰辅酶A。线粒体是真核生物细胞内提供能量的细胞器,线粒体同时还有多种机制参与信号通路,包括AMP/ATP 比率的改变,活性氧(ROS)和TAC代谢物的释放,以及定位于线粒体外膜的免疫调节蛋白的调控。本研究旨在探究ogdh是否参与Ⅰ型干扰素信号通路及其调控的具体机制,具体内容如下:***负向调控IFN-β的产生为了确定ogdh对IFN-β的调控效应,利用慢病毒包装系统获得过表达ogdh的细胞系,在此细胞系上用poly(I:C)处理12 h后收集细胞,通过Western-blot和实时荧光定量PCR评价过表达ogdh对IFN-β的影响。实验结果表明,与对照组相比,过表达ogdh能显著抑制IRF3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的磷酸化水平,下调IFN-β和ISG56的mRNA水平。双荧光素酶报告实验结果显示过表达ogdh能显著下调poly(I:C)所诱导的IFN-β的启动子活性。随后我们构建了能有效沉默内源性ogdh的shRNA,同样通过慢病毒包装系统获得沉默ogdh的细胞系,在此细胞系上用poly(I:C)处理12h后收集细胞,通过Western-blot和实时荧光定量PCR评价沉默ogdh对IFN-β的影响。实验结果表明沉默ogdh能上调IRF3的磷酸化水平并且促进IFN-β及ISG56的mRNA水平。双荧光素酶报告实验结果显示沉默ogdh能上调IFN-β的启动子活性。综上所述ogdh负向调控Ⅰ型干扰素的产生。***负向调控IFN-β产生的分子机制研究为了找到ogdh参与调控Ⅰ型干扰素所在通路互作的靶蛋白,本研究筛选了该通路中的常见接头分子,利用Co-IP实验确定了 ogdh仅与MITA(mediator of IRF3 activator,MITA)发生相互作用。激光共聚焦实验发现ogdh与MITA存在共定位现象,且定位于细胞质。将重组质粒pCAGGS-HA-MITA和pTRIP-ogdh-3Flag共转染至293T细胞,在此基础上,将仅转染空载体和仅转染pCAGGS-HA-MITA的组作为对照,24 h后收集细胞,随后通过实时荧光定量PCR来评价过表达ogdh对MITA所介导的IFN-β的影响,实验结果表明过表达ogdh能下调MITA所诱导的IFN-β和ISG56的mRNA水平。为了进一步探究ogdh靶向MITA调控干扰素信号通路的具体机制,将重组质粒pTRIP-3Flag/pTRIP-ogdh-3Flag 和 pCAGGS-HA-MITA 分别共转染至 293T 细胞,同时将重组质粒pTRIP-3Flag和pTRIP-ogdh-3Flag分别转染至293T细胞,24 h后收集细胞,western-blot实验结果表明ogdh能有效降解内源性MITA而不影响外源性MITA的表达。为了探究ogdh降解MITA是否具有剂量依赖效应,将不同剂量的重组质粒pTRIP-ogdh-3Flag转染293T细胞,24 h后收集细胞,Western-blot实验结果表明ogdh呈剂量依赖性地降解内源性MITA。为了探究ogdh降解MITA的具体途径,在转染重组质粒ogdh-3Flag的基础上,分别用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂NH4Cl处理细胞,10 h后收集细胞。Western-blot结果显示与对照组相比,溶酶体抑制剂NH4Cl处理组MITA的蛋白水平明显回升,这表明ogdh通过溶酶体途径降解内源性MITA。此外,通过ogdh的截短体的构建,我们发现ogdh的C1 domain(aa601-1023)是介导MITA降解的重要结构域。利用慢病毒包装系统获得沉默ogdh的293T细胞系和A549细胞系,通过Western-blot和实时荧光定量PCR评价下调内源性ogdh对MITA的影响,结果显示沉默内源性ogdh会导致MITA的蛋白水平及mRNA水平均显著上调。除此之外,沉默内源性ogdh能促进MAVS对MITA的招募。但是ogdh不与MAVS竞争结合MITA进而影响MAVS对MITA的招募。***对病毒复制的影响本研究分别选择了两种病毒伪狂犬病毒(PRV)以及水疱口炎病毒(VSV)作为研究对象,分别作为DNA病毒和RNA病毒的代表。分别通过Western-blot实验,空斑实验确定了过表达外源性OGD

关键词： ogdh MITA RIG-Ⅰ IFN-β信号通路

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IDH1 mutation inhibits differentiation of astrocytes and glioma cells with low oxoglutarate dehydrogenase expression by disturbingα-ketoglutarate-related metabolism and epigenetic modification

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Life Metabolism 2024年第2期3卷 24-37页

作者： Yuanlin Zhao Ying Yang Risheng Yang Chao Sun Xing Gao Xiwen Gu Yuan Yuan Yating Nie Shenhui Xu Ruili Han Lijun Zhang Jing Li Peizhen Hu Yingmei Wang Huangtao Chen Xiangmei Cao Jing Wu Zhe Wang Yu Gu Jing Ye State Key Laboratory of Holistic Integrative Management of Gastrointestinal Cancers Department of PathologyXijing Hospital and School of Basic MedicineFourth Military Medical UniversityXi’anShaanxi 710032China Department of Pathology Air Force Hospital of Southern Theater CommandGuangzhouGuangdong 510000China Department of Neurology Tangdu HospitalFourth Military Medical UniversityXi’anShaanxi 710038China Department of Clinical Diagnosis Tangdu HospitalFourth Military Medical UniversityXi’anShaanxi 710038China Department of Neurosurgery the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong UniversityXi’anShaanxi 710004China Department of Pathology School of Basic Medical SciencesNingxia Medical UniversityYinchuanNingxia 750004China Institute of Analytical Chemistry and Instrument for Life Science The Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of EducationSchool of Life Science and TechnologyXi’an Jiaotong UniversityXi’anShaanxi 710049China

Isocitrate dehydrogenase(IDH)mutations frequently occur in lower-grade gliomas and secondary *** IDHs exhibit a gain-of-function activity,leading to the production of D-2-hydroxyglutarate(D-2HG)by reducing α-ketoglutarate(α-KG),a central player in metabolism and epigenetic ***,the role ofα-KG homeostasis in IDH-mutated gliomagenesis remains *** this study,we found that low expression of oxoglutarate dehydrogenase(ogdh)was a common feature in IDH-mutated gliomas,as well as *** low expression of ogdh resultedin the accumulation of α-KG and promoted astrocyte ***,IDH1 mutation significantly reducedα-KG levels and increased glutaminolysis and DNA/histone methylation in *** metabolic and epigenetic alterations inhibited astrocyte maturation and led to cortical dysplasia in ***,our results also indicated that reduced ogdh expression can promote the differentiation of glioma cells,while IDH1 mutations impeded the differentiation of glioma cells with low ogdh by reducing the accumulation ofα-KG and increasing ***,we found that l-glutamine increasedα-KG levels and augmented the differentiation-promoting effects of AGI5198,an IDH1-mutant inhibitor,in IDH1-mutant glioma ***,this study reveals that low ogdh expression is a crucial metabolic characteristic of IDH-mutant gliomas,providing a potential strategy for the treatment of IDH-mutant gliomas by targetingα-KG homeostasis.

关键词： α-ketoglutarate IDH1 mutation ogdh l-glutamine gliomas

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TRIM15调控IFN-β产生的分子机制的研究

TRIM15调控IFN-β产生的分子机制的研究

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作者：周云华中农业大学

学位级别：硕士

天然免疫是宿主抵抗病原微生物感染的第一道防线,也是激活获得性免疫的基础,在机体清除病原微生物的免疫反应中起着关键的作用。TRIM(Tripartite motif)家族蛋白是一类宿主限制性因子,其可以直接影响病毒复制周期,或者通过调节免疫信号... 详细信息

天然免疫是宿主抵抗病原微生物感染的第一道防线,也是激活获得性免疫的基础,在机体清除病原微生物的免疫反应中起着关键的作用。TRIM(Tripartite motif)家族蛋白是一类宿主限制性因子,其可以直接影响病毒复制周期,或者通过调节免疫信号分子而在抗病原微生物天然免疫方面发挥重要作用。近年研究发现内源性TRIM15具有抗病毒和调节天然免疫的功能;在细胞中下调内源性TRIM15后能增强MLV和HIV-1的组装和释放。TRIM15依赖RIG-I信号通路正调控I型干扰素的产生且作用于接头蛋白MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)的上游,但是与RIG-1通路中的接头分子均没有相互作用,因此TRIM15调控IFN-β产生的分子机制目前尚不清楚。鉴于此,本研究通过免疫沉淀联合蛋白质质谱技术钓取与TRIM15互作的宿主蛋白并阐明其在TRIM15调控IFN-β的作用,具体研究内容如下:***15对I型干扰素产生的影响有研究表明沉默TRIM15下调IFN-β的产生,为了验证TRIM15对IFN-β的调控效应,利用双荧光素酶报告系统和荧光定量PCR实验进行验证,结果表明过表达TRIM15能增强IFN-βm RNA的转录水平;Western blot结果也表明TRIM15能增加IFN-β上游分子IRF3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的磷酸化水平。空斑实验表明过表达TRIM15能够抑制VSV的增殖;这些结果表明过表达TRIM15能有效促进IFN-β的产生。2.与TRIM15互作宿主蛋白的钓取与验证为了探讨TRIM15调控IFN-β的分子机制,利用慢病毒表达系统获得稳定表达TRIM15的293T细胞系,通过免疫沉淀和蛋白质质谱分析钓取与TRIM15发生相互作用的宿主蛋白。结果表明定位于线粒体的酮戊二酸脱氢酶(ogdh)可被重复钓取。利用CO-IP实验证实了TRIM15与ogdh存在相互作用;然而据报道ogdh定位于线粒体内膜,而TRIM15定位于细胞质。为了研究二者的空间定位,我们进行了线粒体分离实验,结果从线粒体中成功分离出TRIM15;激光共聚焦观察发现TRIM15与ogdh在细胞内存在共定位现象。互作结构域的实验表明TRIM15的PRY-SPRY结构域和卷曲螺旋结构域是TRIM15与ogdh发生互作的关键结构域;然而并未找到ogdh与TRIM15的互作结构域。***在TRIM15调控I型干扰素产生中的作用为了确定TRIM15和ogdh的相互作用是否影响蛋白表达量,在293T和A549细胞中过表达TRIM15,Western blot结果表明过表达TRIM15能降解内源性ogdh。但是将不同剂量的TRIM15-HA与ogdh-Flag共转染293T细胞后,Western blot结果表明TRIM15对外源性的ogdh没有降解作用。将TRIM15不同缺失体分别转染293T细胞,Western blot结果显示TRIM15的RING结构域不是降解ogdh的关键结构域,但其关键结构域尚未确定。TRIM蛋白的RING常具有E3泛素连接酶的活性,为了探究TRIM15的RING结构域是否具有E3泛素连接酶活性及此种活性是否影响ogdh的降解效应。我们检测了TRIM15和ogdh的泛素化功能。免疫沉淀实验表明TRIM15和ogdh都能发生自身泛素化,且缺失RING结构域会削弱TRIM15的泛素化程度。进一步研究结果显示TRIM15并不影响ogdh的泛素化程度,这表明TRIM15不是ogdh的E3泛素连接酶。为了进一步探讨TRIM15降解ogdh的途径,分别用蛋白酶体抑制剂(MG132)、自噬抑制剂(3-MA)和溶酶体抑制剂(NHCL)处理细胞,结果表明NHCL处理后将恢复TRIM15降解的ogdh,这表明TRIM15依赖溶酶体途径降解ogdh。TRIM15可降解ogdh,那么沉默ogdh在TRIM15调控干扰素中发挥怎样的作用呢?我们利用实时荧光定量PCR和双荧光素酶活性实验表明沉默ogdh能上调IFN-β的表达,Western blot实验表明沉默ogdh可显著上调p IRF3的表达。由此可见,沉默ogdh能上调IFN-β的产生。本研究结果表明,过表达TRIM15上调IFN-β的产生,且TRIM15依赖溶酶体途径降解其宿主蛋白ogdh,而沉默ogdh亦可上调IFN-β的产生。因此,我们猜测TRIM15可能通过降解ogdh进而上调IFN-β。

关键词： TRIM蛋白 IFN-β信号通路 TRIM15 ogdh

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头孢菌素发酵过程中关键酶及植物油作用机理研究

头孢菌素发酵过程中关键酶及植物油作用机理研究

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作者：任强齐鲁工业大学

学位级别：硕士

头孢菌素C是由顶头孢霉菌产生的β-内酰胺类抗生素。目前顶头孢霉菌的发酵主要以葡萄糖和植物油为碳源，但植物油利用率低下、价格偏高等问题一直制约着头孢菌素行业的发展。本课题从植物油对头孢菌素的影响、植物油预处理方案和植物油... 详细信息

头孢菌素C是由顶头孢霉菌产生的β-内酰胺类抗生素。目前顶头孢霉菌的发酵主要以葡萄糖和植物油为碳源，但植物油利用率低下、价格偏高等问题一直制约着头孢菌素行业的发展。本课题从植物油对头孢菌素的影响、植物油预处理方案和植物油代谢途径中的关键酶等三个角度出发，对提高植物油利用效率，增产头孢菌素的方法进行了研究。通过气质联用分析了橄榄油、花生油、大豆油和调和油的脂肪酸组成，比较了四种植物油脂肪酸组成的差异，发现调和油中的亚油酸含量明显高于其他三种油，而橄榄油中的油酸含量明显高于其他三种油。根据四种油对头孢菌素产量和菌体生物量的影响情况可以推测，在植物油包含的脂肪酸中，油酸可能具有提高顶头孢霉菌生物量的作用，而亚油酸则可能具有增产头孢菌素的作用。对植物油的酶解条件进行响应面分析得到了豆油酶解的最优条件，此时豆油的酶解率达到了83.29%。将在最优条件下酶解后的植物油添加到顶头孢霉菌的发酵培养基中，经过HPLC检测发现头孢菌素的产量提高了51%。在发酵培养基中添加双氧水后，检测了α-酮戊二酸脱氢酶和过氧化氢酶的酶活性，与头孢菌素和α-氨基己二酸变化曲线进行了对比，结果表明添加双氧水后α-酮戊二酸脱氢酶的酶活降低显著，过氧化氢酶活性提高4.8倍。头孢菌素和α氨基己二酸合成量明显增加。通过取样、提取总RNA、反转录和荧光定量PCR，检测了ogdh和pcbAB的基因表达量变化。结果发现双氧水的胁迫在一定程度上会降低了ogdh的表达。头孢菌素前体量的提高诱导了pcbAB基因的表达量。由此推测，双氧水的添加直接或间接的影响了α-酮戊二酸脱氢酶和过氧化氢酶体的状态，并最终提高了头孢菌素的产量。

关键词：头孢菌素C 植物油脂肪酶 ogdh 双氧水

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氧戊二酸脱氢酶的调控机制及其在不同疾病中的研究进展

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药物生物技术 2023年第4期30卷 426-433页

作者：郑慧琳李梦玮徐寒梅中国药科大学江苏省合成多肽药物发现与评价工程中心江苏南京211198

氧戊二酸脱氢酶ogdh是2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1亚基,主要定位于细胞线粒体,是多酶复合物ogdhc最重要的成分之一,与E2亚基二氢硫辛酰转移酶和E3亚基二氢硫辛酰脱氢酶DLD共同催化α-酮戊二酸生成琥珀酰辅酶A,同时释放一分子CO_(2)、一... 详细信息

氧戊二酸脱氢酶ogdh是2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1亚基,主要定位于细胞线粒体,是多酶复合物ogdhc最重要的成分之一,与E2亚基二氢硫辛酰转移酶和E3亚基二氢硫辛酰脱氢酶DLD共同催化α-酮戊二酸生成琥珀酰辅酶A,同时释放一分子CO_(2)、一分子的NADH和H^(+),但ogdh限制着ogdhc的整体转化效率。ogdh作为代谢途径中的关键催化酶之一,是细胞线粒体三羧酸循环和谷氨酰胺分解代谢的回补途径的关键节点,严重影响着细胞代谢的重编程。据报道ogdh活性的先天性缺陷会导致蛋白功能严重丧失,整体发育迟缓、乳酸升高、共济失调和癫痫发作,具有显著的线粒体疾病特征,并且最近的研究显示肿瘤、神经系统疾病和炎症损伤等多种病理状态下ogdh的活性或表达水平发生变化,影响细胞线粒体功能和能量的产生,影响细胞氧化还原状态、活性氧ROS产生水平和代谢重编程,从而最终决定细胞命运,对细胞的增殖、周期以及自噬等途径产生影响,这暗示人们关注关键代谢酶作为药物开发靶点的潜力。文章首先对ogdh和多酶复合物ogdhc的组成、结构和定位进行概述,然后从基因水平、转录调控水平、别构调节和翻译后修饰综述了影响ogdh酶活性的因素,并详细综述了近几年ogdh在肿瘤、神经系统疾病、炎症损伤和肌肉发育等不同生理和病理状态下的不同调控机制,以及ogdh特异性抑制剂琥珀酰膦酸酯或激动剂硫胺素二磷酸及其衍生物的潜在治疗作用,为ogdh对于不同疾病的诊断与治疗提供理论依据。

关键词： ogdh 琥珀酰膦酸酯硫胺素二磷酸肿瘤神经系统疾病炎症损伤

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