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铜绿假单胞菌IID 1001 （ATCC 27577）脂多糖o-抗原四糖重复片段的首次化学合成

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铜绿假单胞菌IID 1001 （ATCC 27577）脂多糖O-抗原四糖重复片段...

作者：赵庆鹏山东大学

学位级别：硕士

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一种革兰氏阴性杆菌,广泛存在于自然界中,是临床最常见的条件性致病菌之一,常引起呼吸道、尿路、伤口和烧伤等多种感染,其中呼吸道感染是该菌引起的最常见的感染,通常会导致肺炎和囊性纤维化。铜... 详细信息

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一种革兰氏阴性杆菌,广泛存在于自然界中,是临床最常见的条件性致病菌之一,常引起呼吸道、尿路、伤口和烧伤等多种感染,其中呼吸道感染是该菌引起的最常见的感染,通常会导致肺炎和囊性纤维化。铜绿假单胞菌是抗生素耐药性最严重的病原体之一,其耐药率在全球范围内不断增加,导致患者的死亡率和医疗成本不断提高,常规的抗生素治疗手段的效率正逐渐降低,临床上亟需研发有效的疫苗用于预防和治疗铜绿假单胞菌感染。脂多糖(LPS)是铜绿假单胞菌的主要毒力因子之一,其结构中的o-抗原不仅可以用来识别不同的血清型,而且具有一定的免疫原性。研究表明,天然的o-抗原与具有免疫原性的载体蛋白偶联制备得到的多糖蛋白结合疫苗,能够诱导机体产生免疫反应,表现出防治铜绿假单胞菌感染的潜力。基于上述研究背景,本论文以铜绿假单胞菌IID 1001(ATCC 27577)脂多糖o-抗原为研究对象,设计并化学合成基于其重复片段的四糖半抗原,以期待进行后续疫苗或诊断试剂的研究。具体内容包括:第一章中,我们概述了铜绿假单胞菌的血清型分型、流行病学、耐药性和天然o-抗原相关疫苗的研究进展,综述了相关稀有单糖模块的制备以及在寡糖合成中的应用。在对这些相关研究进行总结和分析的基础上,提出了本课题研究的依据、目标和具体实验方案。第二章中,重点介绍了铜绿假单胞菌IID 1001 LPS o-抗原四糖重复片段的合成,其结构为[→4)-α-L-GalpNAc3AcA-(1→3)-β-D-Bacp2NR4NAc-(1→2)-α-L-Rhap-(1→6)-α-D-GlcpNAc-(1→],R为(S)-3-羟基丁酰基。目标四糖2-1的合成具有较大的挑战性:(1)含有稀有糖模块D-Bac和L-GalNAcA,制备难度高且步骤繁琐;(2)两个1,2-cis-糖苷键的高立体选择性构建,尤其是L-GalNAcA的1,2-cis-糖苷键的构建仍未有文献报道;(3)多种不同的官能团修饰,如o-乙酰基、N-乙酰基、N-(S)-3-羟基丁酰基、自由氨基和羧基等。考虑到L-半乳糖醛酸作为糖苷化供体具有较低的反应活性,以及(S)-3-o-苄基-丁酰基脂肪链对相邻位点糖苷化反应可能产生的影响,本课题采用先糖苷化偶联后氧化和脂肪链修饰的策略以合成目标四糖分子。在具体合成中,首先设计并高效制备了单糖模块2-4、2-5、2-6和2-7。其中,2-4和2-7采用叠氮基作为氨基的潜在保护基,叠氮基具有较好的酸碱耐受性,并且其非邻基参与性有利于1,2-cis-糖苷键的构建。2-5中的2-o-Bz和2-6中的2-N-Troc保护基具有邻基参与效应,可用于控制相应1,2-trans-糖苷键的立体选择性构建。随后,将各单糖模块进行逐步糖苷化偶联,顺利得到四糖骨架2-3。以AgoTf/p-TolSCl为活化体系,依靠供体6-o-TBS的β-屏蔽效应和乙醚的溶剂效应协同控制D-葡萄糖胺的1,2-cis-糖苷键的构建。在NIS/TfoH的催化体系中,以二氯甲烷和乙醚(v:v=1:1)为溶剂,-10℃条件下,L-半乳糖胺的1,2-cis-糖苷键被立体专一性地构建得到,这是α-L-GalN糖苷键的首次合成,为后续其它含有该单糖模块的寡糖合成提供了可靠的依据。在得到四糖2-3后,首先在TBAF和AcoH的条件下脱除TBS保护基,然后应用本课题组优化的TEMPo/BAIB氧化策略及羧酸苄酯合成步骤,将L-GalN氧化为糖醛酸,得到羧酸苄酯中间体。接下来,通过两步连续反应,将3个叠氮基同时转化为乙酰氨基。脱除N-Troc保护基,新生成的自由氨基与(S)-3-o-苄基-丁酰氯进行偶联,顺利得到四糖分子2-2。最后,经过催化氢化反应脱除苄基和苄氧羰基,以八步反应29%的总收率得到铜绿假单胞菌IID 1001 LPS o-抗原四糖重复片段2-1及o-乙酰基迁移产物2-1a。o-乙酰基的迁移可能处于动态平衡过程并在室温下自发进行。本课题所涉及的各反应中间体及目标分子的结构由NMR和高分辨质谱数据进行确证。

关键词：铜绿假单胞菌 o-抗原糖苷化反应立体选择性

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绿脓杆菌o6血清型o-抗原的化学合成研究

绿脓杆菌O6血清型O-抗原的化学合成研究

作者：侯红丽江南大学

学位级别：硕士

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)是一类环境适应能力极强的条件致病菌,是引起医院感染的主要病原体之一,其感染可对囊性纤维化患者、艾滋病患者、化疗后的病人等免疫力低下人群造成致命伤害。由于该菌存在固有性、获得性和适应性抗药... 详细信息

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)是一类环境适应能力极强的条件致病菌,是引起医院感染的主要病原体之一,其感染可对囊性纤维化患者、艾滋病患者、化疗后的病人等免疫力低下人群造成致命伤害。由于该菌存在固有性、获得性和适应性抗药性的特征,加之人们对抗生素的滥用,导致其抗生素耐药性正不断增加,不断形成的多重抗生素耐药性使得绿脓杆菌疫苗的开发迫在眉睫。研究表明,人体免疫系统可对绿脓杆菌脂多糖o-抗原产生保护性免疫,因此o-抗原作为免疫靶点已广泛应用于绿脓杆菌疫苗的研发。由于化学合成法可制备结构明确、均一的致病菌表面糖链,对于其抗原性研究和免疫学评价至关重要,因此本论文以绿脓杆菌o6血清型o-抗原四糖重复单元为研究对象进行全合成研究,可为糖类疫苗的开发奠定基础。绿脓杆菌o6血清型o-抗原具有高度结构特异性,以其四糖重复单元[→3)-L-Rha-(α1→4)-D-Gal NAc3oAc AN-(α1→4)-D-Gal NFm A(α1→3)-D-Qui NAc-(α1→]为研究对象,设计了还原端装有氨基连接臂的目标四糖,便于后续生物学研究。以三乙酰D-葡萄糖烯为原料,经烯糖加成和C6位脱氧等反应步骤完成氨基脱氧糖的制备,后利用PhoP/TMSI的试剂作用在端基位立体选择性组装氨基连接臂,经过13步反应完成D-奎诺糖胺砌块的合成,总产率为20%;以三乙酰D-半乳糖烯为原料,利用烯糖加成在C2位引入叠氮基和利用TEMPo/BAIB氧化将C6位羟基氧化为羧基等反应步骤,分别经过11步反应完成两种2-氨基半乳糖醛酸砌块的合成,总产率分别为22%和26%。以L-鼠李糖中间体化合物为原料,经2步反应完成了L-鼠李糖砌块的合成,总产率为71%。利用得到的四种单糖砌块进行糖苷化反应,采用线性合成策略首先完成了还原端二糖的合成。同时发现C6位氧化后的半乳糖醛酸砌块其供体活性较低,导致其糖苷化反应产率较低,以至于无法实现还原端三糖的合成。上述原因促使我们调整合成策略,采用先进行糖苷化后氧化的策略,利用4,6-位苄叉基的构型锁定作用和乙醚的参与性溶剂作用进行糖苷化反应的立体选择性优化,以70%的产率得到单一α-构型的还原端二糖。常用的TEMPo/BAIB氧化方法无法高效实现二糖片段C6位羟基的氧化,经过多种氧化条件尝试,发现利用温和的Pinnick氧化法可实现还原端二糖的高效制备。最终,利用先糖苷化后氧化的策略完成了两种还原端三糖的高立体选择性合成。在还原端三糖的合成过程中,两个2-氨基半乳糖醛酸1,2-顺式糖苷键的高立体选择性构建和D-半乳糖胺C6位羟基的高效氧化等策略,可为其它含类似结构复杂寡糖的高效合成提供借鉴。

关键词：绿脓杆菌脂多糖 o-抗原立体选择性化学合成

大肠杆菌o141 o-抗原基因簇的破译及进化分析

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Acta Genetica Sinica 2004年第12期31卷 1448-1454页

作者：孔庆科郭宏杰赵广郭玺程剑松王磊南开大学生命科学学院微生物系泰达基因组研究中心天津300457

对大肠杆菌o14 1o 抗原基因簇进行测序 ,序列全长 15 6 0 1bp ,用生物信息学的方法进行序列分析 ,共发现 12个基因 :鼠李糖合成酶基因 (rmlB ,rmlD ,rmlA ,rmlC)、甘露糖合成酶基因 (manB ,manC) ,糖基转移酶基因(orf 6 ,orf 7,orf 9,or... 详细信息

对大肠杆菌o14 1o 抗原基因簇进行测序 ,序列全长 15 6 0 1bp ,用生物信息学的方法进行序列分析 ,共发现 12个基因 :鼠李糖合成酶基因 (rmlB ,rmlD ,rmlA ,rmlC)、甘露糖合成酶基因 (manB ,manC) ,糖基转移酶基因(orf 6 ,orf 7,orf 9,orf 10 )、o 抗原转运酶基因 (wzx)和o 抗原聚合酶基因 (wzy)。用PCR的方法筛选出了针对大肠杆菌o14 1的特异基因 ,可以用于基因芯片或PCR方法对大肠杆菌o14 1的快速检测。通过对大肠杆菌o14 1的o 抗原基因簇及甘露糖和鼠李糖合成酶基因的进化分析发现 :大肠杆菌o14 1o 抗原基因簇是低GC含量的片段 ,仅o 抗原特异的基因才出现在o 抗原基因簇 ;并且这些基因可能介导了o 抗原基因簇间的重组及以o14 1o

关键词：大肠杆菌 o-抗原特异基因甘露糖鼠李糖

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大肠杆菌o-抗原血清型鉴定研究进展

中国人兽共患病学报 2016年第10期32卷 928-933页

作者：刘璨颖张济培王丙云佛山科学技术学院佛山528231

大肠杆菌在一定条件下能引发宿主疾病,其表面o-抗原与毒力有关。o-抗原的化学组成和结构具有高度多样性,并且o-抗原血清型种类与大肠杆菌致病性有一定联系。因此,大肠杆菌o-抗原血清型鉴定对流行病学调查,防御和控制致病性大肠杆菌病有... 详细信息

大肠杆菌在一定条件下能引发宿主疾病,其表面o-抗原与毒力有关。o-抗原的化学组成和结构具有高度多样性,并且o-抗原血清型种类与大肠杆菌致病性有一定联系。因此,大肠杆菌o-抗原血清型鉴定对流行病学调查,防御和控制致病性大肠杆菌病有重要意义。传统的血清学分型方法耗时长、费用高、准确度不理想。随着科学技术的发展,研究者对大肠杆菌196种o-抗原基因簇进行了破译,比较分析了不同o-抗原基因簇序列,并针对基因簇中特异性DNA序列设计分子标记,运用PCR方法对o-抗原血清型进行分型,其中包括一般PCR、多重PCR、实时PCR、DNA芯片和微球悬浮列阵法。此外,还有rbf-限制性片段长度多态性分析法,磁性微球免疫分析法和基于全基因组序列预测法,这些方法丰富了o-抗原血清型鉴定方法,弥补了传统血清学分型方法的不足。本文概述了o-抗原合成基因簇序列和o-抗原血清型鉴定方法相关研究进展。

关键词：大肠杆菌 o-抗原血清型分型

大肠杆菌o96 o-抗原基因簇的破译和特异基因的鉴定

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南开大学学报（自然科学版） 2005年第2期38卷 54-59页

作者：夏秋雨王威韩巍青冯露王磊耿运琪南开大学生命科学学院天津300071

大肠杆菌o96血清型的大肠杆菌近年来频繁地出现于分离到的致病菌株中,在发展中国家和发达国家均有发现,有造成爆发性流行的可能.本文利用鸟枪法对大肠杆菌(o96o-抗原基因族进行测序,序列全长9415bp,用生物信息学的方法进行序列分析,共发... 详细信息

大肠杆菌o96血清型的大肠杆菌近年来频繁地出现于分离到的致病菌株中,在发展中国家和发达国家均有发现,有造成爆发性流行的可能.本文利用鸟枪法对大肠杆菌(o96o-抗原基因族进行测序,序列全长9415bp,用生物信息学的方法进行序列分析,共发现7个基因,分别是:吡喃型UDP-半乳糖变位酶基因(glf),o-抗原转运酶基因(wzx),o-抗原聚合酶基因(wzy)和糖基转移酶基因(4个).本文分析了大肠杆菌o96和K12(o16)的0-抗原基因族中吡喃型UDP-半乳糖变位酶基因和o-抗原转运酶基因的进化关系,确定了吡喃型UDP-半乳糖变位酶的基序;用PCR的方法筛选出了2个针对大肠杆菌o96的特异基因,可以用于基因芯片或PCR方法快速检测大肠杆菌o96.

关键词：大肠杆菌 o-抗原特异基因基因簇糖基转移酶基因鉴定破译抗原基因发展中国家生物信息学聚合酶基因 PCR方法半乳糖致病菌株发达国家序列分析进化关系快速检测基因芯片血清型鸟枪法爆发性吡喃变位酶

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犊牛腹泻大肠埃希菌o-抗原血清型鉴定

中国生物制品学杂志 2018年第1期31卷 55-58页

作者：蔺旭光马德慧康桂英李佳怡牛天明刘锴内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古通辽028000 内蒙古自治区肉牛疾病防控工程技术研究中心内蒙古通辽028000 通辽市扎鲁特旗园林管理局内蒙古通辽028000

目的对犊牛腹泻大肠埃希菌o-抗原血清型进行鉴定。方法收集内蒙古部分地区牛场患犊牛腹泻病的犊牛直肠内容物或粪便共165份,经细菌分离培养、动物致病性试验及16s RNA PCR检测,筛选出致病性大肠埃希菌,并进行o-抗原血清型鉴定。结果分... 详细信息

目的对犊牛腹泻大肠埃希菌o-抗原血清型进行鉴定。方法收集内蒙古部分地区牛场患犊牛腹泻病的犊牛直肠内容物或粪便共165份,经细菌分离培养、动物致病性试验及16s RNA PCR检测,筛选出致病性大肠埃希菌,并进行o-抗原血清型鉴定。结果分离的大肠埃希菌共165株,115株有致病性,除7株未能确定分型及3株自凝集外,其余105株鉴定为o-抗原血清型。结论大肠埃希菌o-抗原血清型鉴定对流行病学调查及疾病预防均有重要意义。

关键词：犊牛腹泻大肠埃希菌 o-抗原血清型流行病学调查

山东省鸡源致病性大肠杆菌o-抗原混合血清型分析

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中国兽医学报 2017年第9期37卷 1676-1679页

作者：冯敏燕林树乾房玉波李桂明杨世发赵增成黄中利傅剑商晶宋敏训山东省农业科学院家禽研究所山东济南250023 山东吴泰科技药业有限公司山东济南250023 山东省沂源县动物卫生监督所山东沂源256100

采用抗原抗体凝集反应,用常见的18种o因子血清测定从临床上分离鉴定的182株大肠杆菌的o抗原血清型。结果显示,山东地区鸡源大肠杆菌的优势血清型为o24,o15,o2,o127,o1,o18,o78,占检测菌株的41.21%,同时出现大量混合血清型,占检测菌株的2... 详细信息

采用抗原抗体凝集反应,用常见的18种o因子血清测定从临床上分离鉴定的182株大肠杆菌的o抗原血清型。结果显示,山东地区鸡源大肠杆菌的优势血清型为o24,o15,o2,o127,o1,o18,o78,占检测菌株的41.21%,同时出现大量混合血清型,占检测菌株的24.18%。这是国内首次报道检测到大量的大肠杆菌o因子混合血清型,印证了国外研究人员对o-AGC核苷酸序列研究的结果,有助于最终对o抗原血清型进行更加准确的分类以及大肠杆菌疫苗的研制。

关键词：大肠杆菌 o-抗原交叉反应混合血清型

水稻条斑病细菌(Xanthomolias oryzae pv.oryzicola)Wzt基因参与LPS o-抗原合成和影响细菌致病性

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自然科学进展 2005年第10期15卷 1195-1203页

作者：龙菊英张佳环王金生南京农业大学农业部病虫监测重点开放实验室南京210095

ABC-转运系统将同质o-抗原多糖链从细胞质内膜转运到细胞周质空间合成脂多糖(LPS)。通过功能互补和亚克隆序列分析在X. oryzae pv. oryzicola的基因组文库中发现了一个Wzt基因, 该基因编码产物是运输o-抗原的ABC-转运系统的疏水组成部分... 详细信息

ABC-转运系统将同质o-抗原多糖链从细胞质内膜转运到细胞周质空间合成脂多糖(LPS)。通过功能互补和亚克隆序列分析在X. oryzae pv. oryzicola的基因组文库中发现了一个Wzt基因, 该基因编码产物是运输o-抗原的ABC-转运系统的疏水组成部分,为ATP-结合蛋白。为区别基因来源将该基因命名为Wzt_(Xooc). Wzt_(Xooc)编码一个35.9 ku的蛋白质。通过分析发现,Wzt_(Xooc)与数据库中的其他细菌包括水稻白叶枯病菌的ABC-转运系统的ATP结合蛋白质不同。在Wzt_(Xooc)序列中仅发现ATP-结合蛋白中4个保守基序的3个,没有发现ATP-结合位点Walker A(ATP/GTP binding site motif A)。通过基因插入突变得到Wzt_(Xooc)基因突变体Mwzt。LPS分析表明:由于该基因突变使o- 抗原链不能转运通过细胞质膜,不能形成完整的LPS分子,突变体菌落表面丧失了产生大量胞外多糖的能力;突变细菌不产生鞭毛,丧失了游动性和生物膜形成的能力。重要的是突变体在水稻上的繁殖能力和致病性明显下降,证明Wzt_(Xooc)基因与LPS合成及致病性有关。

关键词： Xanthomonas oryzae pv.oryzicola ABC转运系统LPS致病性水稻白叶枯病菌基因组文库 o-抗原 LPS 致病性细菌

Burkholderia ambifaria菌脂多糖相关o-抗原二糖重复片段及其寡聚体的合成研究

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Burkholderia ambifaria菌脂多糖相关O-抗原二糖重复片段及其寡聚...

作者：王东岳山东大学

学位级别：硕士

洋葱伯克霍尔德复合菌群（Burkholderia cepacia complex,Bcc）是由一组基因型不同而表型相似的细菌构成,并且可以广泛地存在于自然环境中,不仅能降解环境污染物还能感染植物和人体。其中,Bcc菌作为人体条件致病菌而广受关注。它可诱发... 详细信息

洋葱伯克霍尔德复合菌群（Burkholderia cepacia complex,Bcc）是由一组基因型不同而表型相似的细菌构成,并且可以广泛地存在于自然环境中,不仅能降解环境污染物还能感染植物和人体。其中,Bcc菌作为人体条件致病菌而广受关注。它可诱发易感人群（如肺部囊性纤维化患者或慢性肉芽肿病的患者）产生不可控的坏死性肺炎和败血症,通常具有较高的死亡率。此外,Bcc还具有较高的耐药性,以及不明确的致病机制,使人群感染后难以治愈。因此,我们需要寻找和发展新的治疗和预防方法,用于Bcc感染的治疗。研究发现,细菌脂多糖相关o-抗原可以作为用于疫苗开发的抗原靶标。但这类多糖抗原属于非T细胞依赖性抗原,只能与B细胞作用,引起一个短暂的、亲和力较低的IgM抗体应答,并且在整个免疫过程中没有T细胞的参与,不会形成免疫记忆,因此对于2岁以下儿童、老人以及免疫缺陷者的免疫保护效果差。人们发现多糖-蛋白缀合物疫苗能够很好地解决上述问题。该类疫苗一般由细菌表面多糖抗原与具有免疫原性的载体蛋白如破伤风类毒素、白喉类毒素等共价缀合而成,可以诱导机体产生高亲和力的IgG抗体,且通常具有免疫记忆。目前,已上市的多糖-蛋白缀合疫苗有肺炎球菌多糖结合疫苗、流感嗜血杆菌b型（Haeophilus infuenzaetype b,Hib）多糖结合疫苗、脑膜炎球菌多糖结合疫苗等。它们都已被证实可以产生免疫记忆:当同种抗原再次出现时,能快速应答生成高亲和力的IgG抗体,同时生成能够存活更长时间的记忆B细胞。Bcc脂多糖的o-抗原是理想的候选疫苗靶标之一,但是来自于细菌表面的o-抗原具有结构复杂、成分不均一、结构不明确的特点,因而限制了 Bcc疫苗的发展。近年来随着化学合成技术的完善,科学家们已经运用化学的方法来合成多种纯度较高、成分均一和结构明确的寡糖分子（包括o-抗原）。因此,化学合成法已经成为糖抗原获取的一条新途径。本论文内容主要介绍Burkholderia ambaria菌脂多糖的o-抗原二糖重复片段及其寡聚体的合成。本论文所获得的不同长度的寡糖片段可以与具有免疫活性的载体蛋白或者载体小分子链接形成相应的糖缀合物,为后续各种生物免疫学研究提供材料,并且用于Burkholderia ambaria糖类疫苗的研究。主要包括以下两章内容:第一章对洋葱伯克霍尔德复合菌群的概况及其致病因子的研究现状以及抗药性等进行了简要介绍。第二章是基于Burkholderiaambifaria菌19182脂多糖相关o-抗原的二糖重复片段的结构,合成了二糖、四糖与六糖三个目标分子。其o-抗原的二糖重复片段是由D-鼠李糖以及6-脱氧-D-阿卓糖组成的。在目标产物中既存在α构型糖苷键,也存在β构型糖苷键。鉴于6-脱氧-阿卓糖的β构型糖苷键相对难以合成,同时为了优化合成步骤和提高总收率,我们首先设计合成β构型的二糖模块4,而后通过采用[2+2]和[2+2+2]的合成策略以α键的链接方式来构建目标四糖和六糖产物。为了提高二糖模块4合成产率以及β构型的立体选择性,我们在合成时选用了不同的溶剂以及不同的单糖供体6,并且在所有供体的3-o-位引入苯甲酰基,从而借助远程邻基参与反应来提高β构型糖苷键的构建。二糖模块4,即可以与叠氮丙醇反应,脱掉苯甲酰基得到二糖受体20,也可以作为供体来构建目标四糖2和六糖3。在合成过程中,我们同时也制备了相应的β键链接的副产物四糖2a和六糖3a。本章涉及的所有中间体化合物和目标化合物都通过核磁与质谱对其结构进行了确证。

关键词：洋葱伯克霍尔德复合菌群脂多糖 o-抗原寡糖化学合成