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o型口蹄疫病毒免疫层析试纸条检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2008年第1期39卷 60-65页

作者：蒋韬梁仲陈涓何继军吕律马维民田宏刘在新刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室兰州730046

为建立一种快速、准确检测o型口蹄疫病毒(FMDV)抗原的胶体金免疫层析方法,将兔、豚鼠抗o型FM-DV多抗用DEAE-Sephose层析柱纯化。胶体金标记o型豚鼠口蹄疫抗体,形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上。兔抗o型FMDV抗体和羊抗豚鼠IgG分别标... 详细信息

为建立一种快速、准确检测o型口蹄疫病毒(FMDV)抗原的胶体金免疫层析方法,将兔、豚鼠抗o型FM-DV多抗用DEAE-Sephose层析柱纯化。胶体金标记o型豚鼠口蹄疫抗体,形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上。兔抗o型FMDV抗体和羊抗豚鼠IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带,各部件按顺序装配形成快速诊断试纸条。如果待检样品中含有o型FMDV,它将与玻璃纤维上的胶体金探针和兔抗o型FMDV抗体形成夹心复合物,并在检测带被固定,沉集反应形成肉眼可见的红色条带。在田间试验中,53份试验样本分别用试纸条和反向间接血凝试验进行检测,2种方法的阳性率分别为95.45%和90.91%。评价试验证实,本研究建立的胶体金免疫层析方法简便、快速,具有良好的特异性和敏感性,非常适于基层兽医实验室诊断时使用。

关键词： o型口蹄疫病毒试纸条胶体金免疫层析法

o型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及纳米样结构观察

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解剖学报 2018年第1期49卷 118-123页

作者：郭玉堃明胜利郭婉莹杨国宇郭豫杰河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室郑州450002

目的本实验旨在高效表达可溶性的o型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒。方法根据o型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV o/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135... 详细信息

目的本实验旨在高效表达可溶性的o型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒。方法根据o型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV o/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Fn)基因片段,将o型口蹄疫病毒VP1蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒VP1蛋白-铁蛋白基因片段,命名为Se Fnt16798。构建了Se Fnt16798融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、Ce HSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选高效可溶性表达的Se Fnt16798融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测。结果实验成功构建9个Se Fnt16798表达载体;9个标签中,MBP与Se Fnt16798蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-Se Fnt16798重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-Se Fnt16798形成了纳米样颗粒。结论本实验建立了稳定获得Se Fnt16798重组蛋白质的方法。

关键词： o型口蹄疫病毒 VP1蛋白铁蛋白融合标签纳米颗粒电子显微镜大肠埃希菌

o型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株P1和3A基因的差异分析

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畜牧兽医学报 2017年第5期48卷 881-888页

作者：姚怀兵赵毅王金泉刘梦丽刘宏任方黄炯新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 天康生物股份有限公司动物用生物制品技术国家地方联合工程实验室乌鲁木齐830000 新疆畜牧科学院兽医研究所动物临床医学研究中心乌鲁木齐830000

为了明确o型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株P1和3A基因位点的差异性,研究其遗传变异趋势,找出不同宿主适应毒株在P1和3A基因水平上位点的变异情况,将o型口蹄疫病毒o/XJ/10-11株分别接种于牛、乳鼠、猪及BHK-21细胞,获得相应的宿主适应毒株... 详细信息

为了明确o型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株P1和3A基因位点的差异性,研究其遗传变异趋势,找出不同宿主适应毒株在P1和3A基因水平上位点的变异情况,将o型口蹄疫病毒o/XJ/10-11株分别接种于牛、乳鼠、猪及BHK-21细胞,获得相应的宿主适应毒株,提取RNA,反转录并扩增P1和3A基因,目的片段产物经琼脂糖凝胶电泳回收,并将其克隆到pMD19-T载体上,筛选阳性菌落,测序并分析其基因序列。结果表明:牛、乳鼠、猪、BHK-21细胞四种宿主适应毒株,核苷酸和氨基酸序列均未发生缺失,主要抗原位点稳定;P1基因发生了部分变异,变异程度依次为VP1、VP2>VP3>VP4,VP4基因最为保守;3A基因较稳定,变异较少;不同宿主适应毒株的变异程度依次如下:猪适应毒株>BHK-21细胞适应毒株>牛适应毒株>鼠适应毒株。o型口蹄疫病毒在不同宿主传代过程中造成VP1基因的变异,但主要抗原位点稳定;VP2基因的变异均位于抗原表位上;鼠适应毒株作为口蹄疫原始毒种的保存更为有利。

关键词： o型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株基因位点差异性

o型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子基因的融合表达

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中国兽医科技 2005年第7期35卷 503-506页

作者：张灿韩春来柏亚铎汪明中国农业大学动物医学院北京100094

将o型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子(GMCSF)成熟肽基因共同克隆到原核表达载体pGEX6P1中,转化RS21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白BoGMCSF/VP1在大肠埃希氏菌RS21中的高效表达,表达产物经SDSPAGE和Westernblotting分析,重组的蛋... 详细信息

将o型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子(GMCSF)成熟肽基因共同克隆到原核表达载体pGEX6P1中,转化RS21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白BoGMCSF/VP1在大肠埃希氏菌RS21中的高效表达,表达产物经SDSPAGE和Westernblotting分析,重组的蛋白质分子质量约为66ku,与预期大小相符。表达蛋白占菌体总蛋白的30%,表达产物以包涵体形式存在;包涵体提取物经变性复性,用透析方法提纯,得到高纯度的表达蛋白。

关键词： o型口蹄疫病毒 VP1基因牛集落刺激因子基因融合表达

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o型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达

中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 185-188页

作者：梁特杨德成刘蒙蒙周国辉孙超魏萍于力东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达o型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组杆状病毒,本研究将FMDV o/YS/CHA/05株的P12A和3C基因克隆于pFastBac1载体中,构建重组转移质粒pFast-P12A3C,将其转化DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rBacmid-P12A3C。将该重组杆粒转染Sf9... 详细信息

为构建表达o型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组杆状病毒,本研究将FMDV o/YS/CHA/05株的P12A和3C基因克隆于pFastBac1载体中,构建重组转移质粒pFast-P12A3C,将其转化DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rBacmid-P12A3C。将该重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒rBV-P12A3C。间接免疫荧光试验(IFA)检测表明,获得的重组杆状病毒在Sf9细胞中能够表达o型FMDV衣壳蛋白。Western blot分析显示,FMDV的衣壳蛋白和3C蛋白酶均获得表达,并且3C蛋白酶对结构蛋白进行了正确切割。重组蛋白表达的动力学分析显示,表达的FMDV衣壳蛋白具有良好的反应原性,并且在重组杆状病毒感染Sf9细胞后第4 d蛋白表达量达到最大。该重组杆状病毒的构建,为研究FMDV空衣壳的体外组装以及o型FMDV空衣壳疫苗的开发建立了实验基础。

关键词： o型口蹄疫病毒衣壳蛋白杆状病毒表达

o型口蹄疫病毒血清抗体竞争ELISA检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2020年第4期33卷 438-444页

作者：杨志元白满元张韵闻晓波孙世琪郭慧琛冉旭华黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疾病病原生物学国家重点实验室oIE/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

目的建立o型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证。方法采用o型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法。对方法的抗原包被... 详细信息

目的建立o型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证。方法采用o型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法。对方法的抗原包被浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/mL)、抗原包被温度及时间(4℃过夜、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h、37℃2.5 h、37℃3 h)、血清稀释度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释)、HRP-IgG稀释度(1∶10000~1∶20000稀释)、封闭液种类(不封闭、1%BSA封闭、2%BSA封闭、5%脱脂乳封闭)、封闭液作用时间(30、60、90、120 min)、血清与HRP-IgG作用时间(30、60、90、120、150 min)、底物TMB作用时间(10、15、20、25、30 min)进行优化。同时验证方法的交叉反应、特异性及敏感性、精密性。采用建立的方法及o型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒分别检测未知血清背景的138份猪和牛血清,计算两者的符合率。结果方法最适检测条件为:抗原包被浓度0.5μg/mL,抗原包被温度及时间为4℃过夜,血清稀释度为1∶4;HRP-IgG稀释度为1∶18000;封闭液为1%BSA,封闭液作用时间为30 min;HRP-IgG与血清作用时间为30 min;底物作用时间为10 min。21份不同猪病的阳性血清中,除3份o型FMD阳性血清为阳性外,其他血清样品为阴性,该方法无交叉反应;敏感性为90.4%,特异性为95.7%;批内和批间精密性试验变异系数(CV)均口蹄疫o型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的符合率为97%。结论建立的方法具有良好的特异性及精密性,且操作简便,可用于o型FMDV血清抗体的检测。

关键词： o型口蹄疫病毒病毒样颗粒血清抗体竞争ELISA法

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o型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

华南农业大学学报 2004年第1期25卷 92-95页

作者：林瑞庆罗满林黄毓茂刘镇明辛朝安华南农业大学兽医学院广东广州510642

以o型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET 32a中,分析比较不同地区o型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础.经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中... 详细信息

以o型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET 32a中,分析比较不同地区o型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础.经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS PAGE和Western blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好.

关键词： o型口蹄疫病毒 VP1基因基因克隆基因表达

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o型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备和鉴定

中国预防兽医学报 2009年第4期31卷 325-328页

作者：宋帅林彤邵军军丛国正独军政高闪电常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室/国家口蹄疫参考实验室兰州730046

利用o型口蹄疫病毒(FMDV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选和7次亚克隆后获得2株能稳定分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。经间接ELISA检测,2株杂交瘤细胞株(3E1、7E6)的腹水效价分别为1∶25600、1... 详细信息

利用o型口蹄疫病毒(FMDV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选和7次亚克隆后获得2株能稳定分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。经间接ELISA检测,2株杂交瘤细胞株(3E1、7E6)的腹水效价分别为1∶25600、1∶102400。间接免疫荧光试验和特异性试验表明2株McAb可与不同株的o型FMDV反应,而不与其他血清型的FMDV反应。Western blot和叠加试验表明2株单抗可识别o型FMDV结构蛋白VP1上的同一个抗原表位。此特异性McAb的获得将为o型FMDV疫苗的研制和诊断方法的建立奠定基础。

关键词： o型口蹄疫病毒单克隆抗体间接ELISA

o型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

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蚕业科学 2008年第1期34卷 148-153页

作者：张韵易咏竹李志勇张志芳柳纪省甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046 中国农业科学院蚕业研究所江苏镇江212018

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进o型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取o型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并... 详细信息

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进o型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取o型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示o型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。

关键词： o型口蹄疫病毒基因工程疫苗 P1-2A3C基因家蚕杆状病毒表达系统