检索结果-南通市图书馆

中国农业科学 2019年第3期52卷 530-538页

作者：钟翠丽李国玲王豪强莫健新全绒张献伟李紫聪吴珍芳顾婷蔡更元华南农业大学动物科学学院/国家生猪种业工程研究中心温氏食品集团股份有限公司

【背景】随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞... 详细信息

【背景】随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维（porcine Fetal Fibroblasts,PFFs）细胞的转染效率有关。【目的】研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM;830/NEPA21/nucleofector;2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。【方法】使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×10;个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率。【结果】首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而nucleofector;2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM;830和nucleofector;2b转染PFFs的最佳质粒用量为12μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%（电转参数:脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次）和14.63%±3.21%（电转参数:U-023）,而NEPA 21使用10μg质粒转染PFFs时效率达到最高（6.09%±0.72%）。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。【结论】因此nucleofector;2b转染PFFs的最佳条件为:U-023程序、12μg超螺旋质粒;NEPA 21为:脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10μg超螺旋质粒;ECM;830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次条件下转染12μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是nucleofector;2b。

关键词：电转染大载体猪胎儿成纤维细胞 ECM 830 NEPA 21 nucleofector 2b

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树突状细胞抗原负载方法探讨

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临床检验杂志 2007年第1期25卷 26-27页

作者：郭文菁杨美香祁澜曲迅孔北华山东大学第二医院妇产科齐鲁医院临床基础研究所济南250012

目的探讨树突状细胞(DC)抗原负载方法。方法体外诱导培养外周血单核细胞来源的DC,分别用脂质体和Nucleo-fector转染试剂盒体外负载抗原,比较2种负载方法转染效率以及对DC表型的影响。结果nucleofector转染方法能够显著的提高转染效率,2... 详细信息

目的探讨树突状细胞(DC)抗原负载方法。方法体外诱导培养外周血单核细胞来源的DC,分别用脂质体和Nucleo-fector转染试剂盒体外负载抗原,比较2种负载方法转染效率以及对DC表型的影响。结果nucleofector转染方法能够显著的提高转染效率,2种转染方法对DC细胞的表型无显著影响。结论nucleofector转染是一种有效的DC抗原体外负载方法,为抗原修饰的DC细胞疫苗的改进提供了新的途径。

关键词：树突状细胞抗原负载脂质体 nucleofector

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大鼠胚胎原代海马神经元两种转染方法的比较

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神经解剖学杂志 2011年第6期27卷 689-692页

作者：郑红云李艳武汉大学人民医院检验科武汉430060

目的:原代海马神经元是原代细胞中比较难转染的细胞,为了得到比较高的转染效率,通过比较Li-pofectamine2000转染法和大鼠神经元核电转法(rat neuron nucleofector kit)转染效率及转染前后细胞的存活率,来探讨nucleofector Kit核电转法... 详细信息

目的:原代海马神经元是原代细胞中比较难转染的细胞,为了得到比较高的转染效率,通过比较Li-pofectamine2000转染法和大鼠神经元核电转法(rat neuron nucleofector kit)转染效率及转染前后细胞的存活率,来探讨nucleofector Kit核电转法的高效性。方法:选取胚胎18 d(E18)大鼠的海马神经元进行原代培养,获取海马神经元单细胞悬液后,于种植前和种植24 h后分别采用nucleofector Kit和Lipofectamine 2000转染红色荧光蛋白(red fluorescence protein,DsRed)质粒。神经元转染48 h后分别采用轴突标记物Tau-1进行免疫荧光染色鉴定神经元。神经元的存活率采用台盼兰进行检测。结果:Lipofectamine2000的基因转染率仅为5.34%,而大鼠神经元nucleofector Kit的转染率为44.54%,后者为前者的8.34倍。Lipofectamine2000转染细胞前后的存活率分别为98.56%和91.44%,而nucleofector Kit组分别为98.26%和74.02%。结论:大鼠神经元核电转法能高效稳定的转染原代海马神经元。

关键词：海马神经元转染 Lipofectamine2000 nucleofector Kit 红色荧光蛋白大鼠

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shh基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

shh基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

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作者：吴晓明中南大学

学位级别：硕士

背景：Sonic Hedeghog (SHH)基因通过上调多种血管生长因子的表达来参与血管发生。内源性的SHH途径在发生心肌缺血后也会被激活,由于SHH基因有促进血管新生的作用,因此SHH基因可能作为潜在的治疗策略应用于心肌缺血。骨髓间充质干细胞(M... 详细信息

背景：Sonic Hedeghog (SHH)基因通过上调多种血管生长因子的表达来参与血管发生。内源性的SHH途径在发生心肌缺血后也会被激活,由于SHH基因有促进血管新生的作用,因此SHH基因可能作为潜在的治疗策略应用于心肌缺血。骨髓间充质干细胞(MSC)可向肌性细胞和内皮细胞分化,在心肌缺血损伤后促进新生血管形成和心肌重构,改善心功能。此外MSC还可接受多种载体的基因转染并在体内分化后仍可保持良好的遗传稳定性,故还可作为基因治疗的靶细胞。目的：研究对大鼠MSC进行重组SHH基因修饰的可行性。为下一步基因与细胞联合干预心肌缺血大鼠模型做好准备。方法：克隆Wistar大鼠SHH基因并测序鉴定。构建PCDNA3.1-SHH真核表达载体,采用密度梯度离心一贴壁培养法获取Wistar大鼠MSC,流式细胞术测定细胞表面标志CD34、CD44、CD45和SH3。采用nucleofector电转染方法将PCDNA3.1-SHH真核表达载体转染至MSC,Western-Blot检测鉴定SHH在MSC中的表达情况。结果：RT—PCR扩增的大鼠SHH基因编码序列(CDS)片段,经酶切和测序鉴定与Genebank一致。采用密度梯度离心一贴壁培养法可获取大鼠MSC,检测结果CD44、SH3阳性,CD45、CD34阴性,Western-Blot检测证实nucleofector方法可将SHH基因转染进大鼠MSC,并获得有效表达,而转染空质粒的MSC未检测到表达。结论：重组真核表达载体PCDNA3.1-SHH可成功在大鼠MSC中表达,为进一步研究移植SHH基因修饰的MSC对心肌缺血大鼠心功能的影响提供了实验依据。

关键词： SHH 骨髓间充质干细胞 nucleofector

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