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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp4和nsp12多克隆抗体的制备与鉴定

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中国兽医科学 2014年第6期44卷 636-640页

作者：田恬王海刘星王先炜姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)两种非结构蛋白nsp4和nsp12的多克隆抗体,将nsp4基因和nsp12基因分别克隆至pET-32a(+)和pGEX-6P-1,并转化至BL21(DE3),用IPTG诱导表达,经过Ni-NTA镍离子亲和层析和包涵体洗液纯化,获得纯化的重组... 详细信息

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)两种非结构蛋白nsp4和nsp12的多克隆抗体,将nsp4基因和nsp12基因分别克隆至pET-32a(+)和pGEX-6P-1,并转化至BL21(DE3),用IPTG诱导表达,经过Ni-NTA镍离子亲和层析和包涵体洗液纯化,获得纯化的重组蛋白,然后用它们分别免疫BALB/c小鼠制备抗血清。SDS-PAGE和Western-blot鉴定结果显示,nsp4和nsp12分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,大小分别为42ku和44ku,均具有良好的反应原性。Western-blot和IFA结果显示,制备的抗血清均与PRRSV发生特异性反应,ELISA抗体效价均可达1∶32 000。本研究结果为PRRSV nsp4和nsp12的生物学功能研究奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp4 nsp12 多克隆抗体

猪流行性腹泻病毒nsp12与宿主RNF7蛋白相互作用的研究

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中国预防兽医学报 2021年第5期43卷 461-467页

作者：赵雄伟李慧春陈鹏飞周书亭吴瑕劳梦琴童武高飞虞凌雪刘长龙孔宁单同领于海姜一峰童光志周艳君中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 上海交通大学农业与生物学院上海200240 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-nsp12与猪小肠绒毛... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞(IECs)cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,获得的阳性克隆经过测序鉴定证实为环指蛋白7(RNF7),将pGBKT7-nsp12与p GADT7-RNF7进行酵母回复验证,结果显示二者共转化后能分解SD/-4/X/A中的X-α-Gal形成蓝色菌落,表明nsp12与RNF7蛋白在酵母中存在相互作用。同时,构建p CAGGS-nsp12-HA和p CAGGS-Flag-RNF7真核表达载体,利用针对不同标签的抗体进行正向和反向免疫共沉淀鉴定,进一步证实PEDV nsp12蛋白与RNF7蛋白之间存在直接相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现nsp12蛋白和RNF7蛋白在细胞质中存在共定位现象。为了分析宿主细胞中RNF7蛋白异常表达对PEDV增殖的影响,将构建的RNF7真核表达质粒pcDNA3.1-RNF7转染LLC-PK1细胞后,再用PEDV感染过表达RNF7的LLC-PK1细胞,通过western blot检测LLC-PK1细胞中PEDV N蛋白表达量,荧光定量PCR检测PEDV N基因转录水平,采用TCID50方法检测病毒滴度,结果显示,过表达RNF7后LLCPK1细胞内PEDV N蛋白表达量和N基因拷贝数均下降,其子代病毒滴度也明显低于正常对照组,表明过表达RNF7蛋白可以抑制PEDV的增殖。而利用si RNA-178敲低宿主细胞内源性RNF7蛋白的表达,再以MOI 0.01的PEDV感染后,对感染后不同时间的细胞样品进行western blot检测和病毒滴度检测,结果显示在PEDV感染后24 h,细胞内PEDV N蛋白表达量明显增加,PEDV的滴度在感染后18 h和24 h时分别是对照组的1.10倍和1.17倍。本研究结果首次证实了宿主细胞中RNF7蛋白表达对PEDV的复制发挥负调控作用,为深入探究PEDV复制调控的分子机制奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 nsp12 RNF7 蛋白相互作用

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp12的原核表达及间接ELISA方法的建立

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动物医学进展 2021年第11期42卷 48-52页

作者：张小波冯鹏赵钦周恩民西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

nsp12作为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白,其诱导产生的抗体能作为检测野毒感染的良好指标。用RT-PCR方法获得PRRSV nsp12的基因,用原核表达系统pET-32a(+)在BL21(DE3)细胞中表达nsp12,通过亲和层析纯化蛋白。用表达的Ns... 详细信息

nsp12作为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白,其诱导产生的抗体能作为检测野毒感染的良好指标。用RT-PCR方法获得PRRSV nsp12的基因,用原核表达系统pET-32a(+)在BL21(DE3)细胞中表达nsp12,通过亲和层析纯化蛋白。用表达的nsp12建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。结果显示,获得了nsp12基因及原核表达nsp12,建立了检测抗nsp12抗体的间接ELISA方法,阴性、阳性临界值为OD 450 nm值为0.227,92份血清样品的检测结果表明建立的ELISA方法特异性较好,为猪场监测PRRSV野毒感染提供了技术支持。

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 nsp12 原核表达间接ELISA

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp12蛋白的表达与鉴定

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中国动物传染病学报 2018年第1期26卷 32-36页

作者：张文超虞凌雪姜一峰高飞黄勤峰李丽薇李慧春陈鹏飞杨德强刘欢童光志杜雅楠周艳君内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010018 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

本研究扩增了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Hu N4株的nsp12基因,将其克隆于pCold-Ⅰ载体中,获得重组质粒pCold-Ⅰ-nsp12,并转化于***/BL21感受态细胞,在16℃条件下用1 mmol/L的IPTG诱导20 h后,用SDS-PAGE电泳检测表达产物,结果显示在大约18 kDa处出现目标蛋白。用PRRSV特异性阳性猪血清对表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示该蛋白可以被PRRSV阳性猪血清识别。将重组nsp12蛋白纯化后,免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。在MARC-145细胞中,对获得的nsp12多抗血清分别进行Western blot和间接免疫荧光检测(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定,结果显示本研究制备的nsp12多抗血清均可与感染的MARC-145细胞的PRRSV Hu N4株以及在MARC-145细胞中特异表达的nsp12蛋白发生免疫反应。PRRSV nsp12蛋白的表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究nsp12在病毒感染过程中的作用奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp12 原核表达多抗

猪流行性腹泻病毒nsp12互作蛋白的鉴定及作用分析

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猪流行性腹泻病毒Nsp12互作蛋白的鉴定及作用分析

作者：李慧春中国农业科学院

学位级别：硕士

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea Virus,PEDV)是目前严重威胁养猪业发展的重要病原之一,主要感染哺乳仔猪,可造成哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水和死亡。该病最早在1971年发生,并广泛流行,2010年以后,在中国、东南亚和美国等相继大... 详细信息

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea Virus,PEDV)是目前严重威胁养猪业发展的重要病原之一,主要感染哺乳仔猪,可造成哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水和死亡。该病最早在1971年发生,并广泛流行,2010年以后,在中国、东南亚和美国等相继大规模爆发由变异PEDV毒株引起的腹泻疫情,并造成了巨大的经济损失。PEDV在宿主体内感染的靶细胞是猪小肠上皮细胞(swine small intestinal epithelium cell,IECs)。为了研究PEDV在体内与宿主细胞内蛋白之间的互作关系,便于揭示其致病机理,本研究以IECs细胞为研究对象,提取了IECs细胞的总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化后,将其与pGADT7-Rec和carrier DNA共同转化至酵母Y187菌株,经过选择性培养基(SD/-Leu)筛选以及文库容量及质量的鉴定,结果显示,本研究构建的IECs-cDNA文库其库容量为1.3×108pfu/mL,随机挑取35个文库菌落对其进行PCR检测,结果显示,插入cDNA片段长度主要位于250-2500bp范围内,文库阳性率达100%,证实该文库具有较好的多态性。PEDV编码的非结构蛋白nsp12是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp),是病毒实现复制、增殖的关键复制酶。为了研究PEDV nsp12与其宿主细胞IECs内蛋白的互作关系,以本研究构建的IECs-cDNA文库为基础,构建了包含nsp12基因的诱饵质粒pGBKT7-nsp12,将诱饵质粒转化到Y2HGold菌株进行自激活和毒性鉴定,并运用酵母双杂交方法从IECs-cDNA文库筛选与nsp12进行互作的宿主细胞蛋白,同时对其进行回复杂交验证。结果显示:单独表达nsp12无法同时激活His3/Ade2/AUR1-C/MEL1报告基因的表达,且pGBKT7-nsp12对酵母菌株无毒性;经过筛选,我们获得了9个呈现蓝斑的菌落,回复杂交结果证实,其中有4个菌落表达的基因分别能够与nsp12共同激活His3/Ade2/AUR1-C/MEL1报告基因的表达,即:环指蛋白7(RING finger Protein7,RNF7),核糖体蛋白S20(Ribosomal Protein S20,RpS20),半乳糖凝集素1(galectin-1,Lgals1)和二肽基肽酶8(Dipeptidyl pepdiase8,DPP8)。有研究表明RpS20,Lgals1,RNF7和DPP8都能影响病毒的复制,其中,RNF7属于E3泛素连接酶,在真核生物细胞内的泛素蛋白酶体途径中发挥重要作用。为了进一步探讨RNF7与nsp12是否有互作关系,我们构建了nsp12和RNF7的真核表达质粒,利用Co-IP和激光共定位等方法鉴定nsp12与RNF7是否存在互作,结果显示,nsp12和RNF7存在免疫共沉淀现象,且二者在Vero细胞的细胞质和细胞核内均存在共定位现象。为了探究RNF7是否会影响PEDV的复制,我们在Vero细胞上过表达RNF7蛋白后,在感染PEDV FJzz1/2011株,对感染后不同时间细胞上清进行病毒滴度测定,同时将PEDV FJzz1/2011株感染Vero细胞,对感染后不同时间细胞内RNF7蛋白表达情况进行检测,结果显示,RNF7蛋白过表达后,在早期能够促进PEDV FJzz1/2011株在Vero细胞中的复制;PEDV感染后,与未感染对照细胞相比,细胞内源性的RNF7蛋白表达被上调。本研究构建了PEDV感染的靶细胞IECs-cDNA文库,并利用该文库筛选和鉴定出与PEDV nsp12蛋白互作的宿主细胞蛋白RNF7,证实RNF7蛋白过表达能够影响PEDV的复制,上述研究结果为今后研究PEDV在宿主细胞内感染和复制的致病机理奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 IECs-cDNA文库 nsp12 RNF7

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp12与宿主细胞互作蛋白的筛选及鉴定

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猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP12与宿主细胞互作蛋白的筛选及鉴定

作者：张文超内蒙古农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍、哺乳仔猪的呼吸道疾病和高死亡率为特征的一种病毒性传染病。PRRSV感染引起机体的免疫抑制,从而形成持续感染。研究表明,PRRSV的许多非结构蛋白在拮抗宿细胞先天性免疫与调控病毒复制方面起着重要作用,为了探究PRRSVnsp12的功能,本研究从蛋白相互作用的角度探究nsp12在病毒感染中的作用,本试验以HP-PRRSVHuN4毒株nsp12为研究对象,构建PGBKT7-nsp12诱饵质粒,通过酵母双杂交系统筛选与nsp12相互作用的宿主细胞蛋白,并且对筛选结果进行验证与分析。为了建立nsp12的研究基础,首先利用原核表达系统成功表达nsp12,得到特异性较好的nsp12的鼠源多克隆抗体;经Western-blot和间接免疫荧光鉴定,证明本研究所制备的多克隆抗体能够特异性识别PRRSV病毒nsp12及真核表达的nsp12蛋白,为后续试验提供辅助材料。随后,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-nsp12,验证无毒性与自激活现象后,通过酵母双杂交系统筛选PAMcDNA文库中与nsp12相互作用的宿主细胞蛋白;经筛选与回复杂交试验验证,结果显示:共筛选到8种能够与nsp12相互作用的宿主细胞蛋白,根据BLAST序列比对与GO分析,筛选到的蛋白主要为一些伴侣蛋白如FTH1、ZNF598和介导细胞凋亡过程的相关蛋白 LGALS3、UCP2 等。为了对酵母双杂交系统筛选到的阳性结果进行验证,本试验研究进一步利用免疫共沉淀和激光共聚焦等试验验验证了 CD63、LGALS3两种蛋白与nsp12的相互作用。结果表明:nsp12能将LGALS3沉淀下来,且明显的共定位于胞浆;nsp12与CD63蛋白也有共定位现象,说明nsp12与这两种蛋白的确存在相互作用。单独体外过表达LGALS3后感染PRRSVHuN4病毒,不同时间收取细胞上清,测定病毒TCID50,与对照组相比结果表明:LGALS3对PRRSV增殖有抑制作用。上述研究结果为深入解析PRRSV病毒感染机制提供了新的理论依据。

关键词： PRRSV nsp12 PAM细胞酵母双杂交免疫共沉淀

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp12抑制I型干扰素表达作用机理的研究

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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12抑制I型干扰素表达作用机理的研究

作者：李先斌中国农业科学院

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种易于发生变异和重组的RNA病毒,PRRSV感染后可造成持续性感染和免疫抑制,对养猪业危害极为严重。天然免疫反应是宿主抗病毒感染的重要方式,PR... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种易于发生变异和重组的RNA病毒,PRRSV感染后可造成持续性感染和免疫抑制,对养猪业危害极为严重。天然免疫反应是宿主抗病毒感染的重要方式,PRRSV能够利用其编码蛋白拮抗宿主天然免疫应答,逃避宿主免疫监测。nsp12是PRRSV复制相关的非结构蛋白,其是否参与拮抗宿主天然免疫反应尚未解析,本研究重点围绕HP-PRRSV HuN4株nsp12在抑制I型IFN信号通路中的作用机理展开研究。在实验室前期研究发现HuN4株nsp12能够抑制IFN-I表达的基础上,为了探究nsp12抑制IFN-I表达的分子途径,本研究利用双荧光素酶报告系统、荧光定量PCR等分析了HuN4株nsp12对IFN-β转录启动活性的影响,结果显示,HuN4株nsp12能够抑制IFN-β的转录和启动子活性,而且这种抑制作用呈明显的剂量依赖性。HP-PRRSV与经典毒株nsp12存在4个氨基酸差异,但这些差异氨基酸均不影响nsp12抑制IFN-β启动子的活性。将nsp12经过系列截短后分析其抑制IFN-I表达的主要功能域,结果显示nsp12抑制IFN-I表达的主要区域位于其N端结构域。为了确定nsp12抑制IFN-β的信号通路,我们检测了nsp12对RIG-I信号通路和TLR3通路的影响,结果显示,nsp12对RIG-I及其接头蛋白MAVS诱导的IFN-β产生了明显的抑制作用,但对TRIF刺激的IFN-β产生没有抑制作用,表明nsp12是通过RIG-I信号通路抑制IFN-β表达,而非TLR3信号通路。由于IFN-β的表达可受转录因子IRF3和NF-κB的调节,我们检测了nsp12对IRF3和NF-κB结合域的启动子活性,结果显示,nsp12能够抑制转录因子NF-κB结合域的启动子活性。而且nsp12还可以抑制由TNF-α刺激引起的p65蛋白核迁移。以上研究结果证实HP-PRRSV HuN4株nsp12能够通过NF-κB的激活途径抑制IFN-β的表达。为了继续探究nsp12蛋白的功能,我们将前期通过酵母双杂交筛选出的与nsp12互作的宿主细胞蛋白半乳糖凝集素3(LGALS3),利用免疫共沉淀和激光共聚焦试验进行鉴定,结果证实nsp12和LGALS3存在相互作用,并确定了LGALS3与nsp12相互作用的区域位于LGALS3(125aa-166aa)。将LGALS3过表达后,可使HuN4株在Marc-145细胞中的增殖受到明显抑制,而在LGALS3缺失细胞系Marc-145中则可促进HuN4株的增殖。有趣的是,我们发现在Marc-145细胞中LGALS3过表达不仅能够抑制IFN-β的启动子活性,而且可以抑制RIG-I诱导的IFN-β产生,同时还能够抑制转录因子NF-κB结合域的启动子活性。在Marc-145缺失细胞系中,由poly(I:C)刺激诱导的IFN-β启动子活性明显强于正常的Marc-145细胞;nsp12虽然在两种细胞系中均能抑制IFN-β启动子的活性,但其在Marc-145缺失细胞系中的抑制程度明显弱于正常Marc-145细胞。上述研究表明,互作蛋白LGALS3可能在nsp12抑制IFN-β表达的过程中发挥了协同作用,但nsp12抑制IFN-β表达并非完全依赖于互作蛋白LGALS3。综上所述,本研究证实了PRRSV nsp12能够通过RIG-I/NF-κB通路抑制IFN-I的表达,其互作蛋白LGALS3也能够协助nsp12通过RIG-I/NF-κB通路发挥抑制作用,为阐明PRRSV免疫抑制机理提供了新的理论依据。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp12 半乳糖凝集素3 I型干扰素

HP-PRRSV nsp2和nsp12单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定

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HP-PRRSV Nsp2和Nsp12单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定

作者：毕彩鸿中国农业科学院

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)给养猪业造成严重的经济负担,主要症状表现为母猪的繁殖障碍和各年龄猪的呼吸系统疾病。该病首次报道于20世纪80年代,现已成为养猪业中最重要的疾病之一。该病... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)给养猪业造成严重的经济负担,主要症状表现为母猪的繁殖障碍和各年龄猪的呼吸系统疾病。该病首次报道于20世纪80年代,现已成为养猪业中最重要的疾病之一。该病的病原是PRRS virus(PRRSV)。PRRSV是一种正链RNA病毒,属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员。PRRSV基因组的ORF1a和ORF1b编码复制酶多聚蛋白pp1a和pp1ab,它们最终酶解为14种非结构蛋白:nsp1α,nsp1β,nsp2/3/4/5/6,nsp7α,nsp7β以及nsp8/9/10/11/12。其中nsp2比较特殊,它是PRRSV基因组编码的最大蛋白,最容易发生突变,在病毒复制周期中执行着不同的生物学功能。非结构蛋白nsp12是病毒复制所必须的,而对于它如何发挥功能还并不清楚。本研究首先通过聚合酶链式反应(PCR)扩增HP-PRRSV HuN4毒株nsp2(1-233aa)和nsp12的cDNA,并将其克隆到pET-28a载体上,命名为pET-28a-nsp2(1-699bp)和pET-28a-nsp12。然后表达并纯化His-nsp2(1-233aa)和His-nsp12两种重组蛋白,利用这两个蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠并制备了三株抗PRRSV nsp2的单抗(分别命名为4A12,4G8,8H11)和一株抗PRRSV nsp12的单抗(命名为1E5)。Western blot和IFA实验结果表明:4A12,4G8,8H11可以识别外源性表达的Flag-nsp2(1-233aa)和内源性表达的HP-PRRSV HuN4 nsp2;1E5单克隆抗体可以识别外源性表达的Flag-nsp12和内源性表达的HP-PRRSV HuN4 nsp12。通过Western blot和ELISA的方法鉴定了4A12和1E5的识别的B细胞表位。研究结果显示:4A12识别的B细胞表位是ELSDDSNRPV。1E5识别的B细胞表位是KANATSMRFH。通过从NCBI数据库得到的不同PRRSV毒株间序列的比较发现,ELSDDSNRPV在2型PRRSV的HP-PRRSV毒株中相对保守,而KANATSMRFH在2型PRRSV的HP-PRRSV毒株中高度保守,但在2型PRRSV的经典毒株以及1型PRRSV中却不保守。总之,本项研究通过细胞融合技术制备了3株抗HP-PRRSV nsp2单克隆抗体和1株抗nsp12的单克隆抗体,为进一步研究nsp2和nsp12的的功能奠定了基础。我们的研究结果表明,1E5可以被用来建立一种检测HP-PRRSV感染的新方法,对于PRRSV的系统进化分析和流行病学调查研究都具有重要的价值。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征 nsp2 nsp12 单克隆抗体抗原表位

PRRSV nsp12原核表达及其在检测猪血清中猪蓝耳病抗体的应用

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PRRSV Nsp12原核表达及其在检测猪血清中猪蓝耳病抗体的应用

作者：张小波西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种严重影响养猪业的疾病之一。PRRSV为单股、正链RNA病毒,其基因组全长约为15.1～15.5 kb,包含有11个开放阅读框(Open Reading Frame,ORFs),ORF1编码非结构蛋白nsp1-nsp12,其中nsp12为目前研究较少的非结构蛋白,已有研究证实nsp12是PRRSV复制所必须的,参与病毒RNA的合成,且nsp12高度保守,通过研究PRRSV感染猪只后体内产生抗PRRSV nsp12抗体的消长规律,可以进一步了解猪场PRRSV感染情况,对猪场PRRS防控具有重要意义。本课题利用原核表达系统,表达PRRSV非结构蛋白nsp12,然后,利用表达纯化的nsp12蛋白包被ELISA板,用于检测猪血清中抗蓝耳病的抗体,为评价PRRSV感染猪只后体内产生抗PRRSV nsp12抗体的消长规律提供支持。课题实施的具体过程简述如下:*** nsp12的原核表达及纯化以提取的PRRSV的RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增编码PRRSV nsp12蛋白的基因,扩增产物大小约为480bp;然后,通过酶切,连接将nsp12基因序列克隆至原核表达载体p ET-32a中,得到p ET32-nsp12重组质粒;随后,将重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中,诱导后进行SDS-PAGE分析,表达产物大小约为40k Da(包括表达载体的标签蛋白和融合蛋白),反复摸索确定诱导nsp12表达的最佳IPTG浓度和培养温度,然后利用Ni柱对表达的nsp12进行亲和层析纯化,将纯化的nsp12蛋白通过透析复性。2.猪血清中猪蓝耳病抗体检测利用纯化的重组nsp12蛋白包被ELISA板,利用“棋盘法”摸索ELISA反应条件,对不同猪场采集的的92份血清样品(33份临床确诊病例)进行检测,结果显示,阳性32份((均为临床确诊病例样本)),阴性60份。本研究成功表达了PRRSV的nsp12蛋白,且表达的nsp12蛋白可用于检测猪血清中抗蓝耳病的抗体,为进一步研究评价抗PRRSV nsp12抗体在PRRSV感染猪只中的消长规律提供了支持。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp12 原核表达抗体检测