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作者：王诗芬福建医科大学

学位级别：硕士

背景:慢性淋巴细胞白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia,CLL）是一种好发于老年人的常见惰性B淋巴细胞肿瘤,临床异质性大,目前缺乏特别有效的治疗方法。CLL的发生、发展中有多种信号通路参与,其中notch1信号通路对CLL疾病进展发挥重... 详细信息

背景:慢性淋巴细胞白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia,CLL）是一种好发于老年人的常见惰性B淋巴细胞肿瘤,临床异质性大,目前缺乏特别有效的治疗方法。CLL的发生、发展中有多种信号通路参与,其中notch1信号通路对CLL疾病进展发挥重要作用,notch1突变的CLL更易出现耐药和进展（如Richter综合症）,然而其中的分子机制仍有许多不明之处。目的:本研究通过构建ICN（notch1胞内结构域）的过表达质粒和突变质粒,建立ICN未突变和突变的细胞,研究ICN突变后notch1信号转录活性和下游趋化因子CCL17的变化及其调控机制。阐明ICN突变引起CLL侵袭性转化的关键分子,揭示notch1通路中新的核内调控机制,为探索新靶向药物治疗CLL提供研究基础。方法:（1）构建表达ICN野生型质粒和突变型质粒,将质粒电转到Ba F3细胞中,实验分为空载体组、过表达野生组和突变组等三组,采用q RT-PCR、Western Blot验证ICN的m RNA和蛋白表达;将三组质粒转染到293T细胞中,免疫荧光检测三组细胞的notch1蛋白在细胞中的定位情况。（2）构建CSL荧光素酶报告质粒,检测各组细胞notch1的转录活性;进行转录组二代测序,用GO分析和KEGG分析测序数据,q RT-PCR和ELISA检测CCL17、CCL22的表达;Transwell实验检测各组细胞上清诱导胸腺T细胞迁移能力的变化。（3）进行质谱检测并Co-IP验证各组ICN与MTA2/HDAC1的结合情况;GST pull down检测ICN突变体的蛋白结构域是否与MTA2/HDAC1有直接结合作用;Ch IP检测各组细胞MTA2/HDAC1与CCL17启动子的结合变化。结果:（1）构建ICN野生型和突变型质粒,PCR和WB显示ICN野生型和突变型两组细胞的m RNA和蛋白表达水平明显高于空载体组,而且突变型ICN的蛋白分子量比野生型ICN蛋白小;免疫荧光显示野生型组和突变型组的ICN都定位于细胞核;。（2）双荧光素酶报告系统显示野生型组和突变型组的CSL荧光素酶活性高于空载体组,而突变型组的CSL荧光素酶活性高于野生型组;表达谱分析和q RT-PCR显示野生型组和突变型组的CCL17表达高于空载体组,而突变型组的CCL17表达明显高于野生组;ELISA也显示突变型组细胞的CCL17蛋白分泌量明显增多;Transwell实验显示突变型组引起胸腺T细胞迁移数明显高于野生型组。（3）质谱和Co-IP显示野生型组的ICN与MTA2/HDAC1结合,但突变型组中它们的结合明显减弱;GST pull down显示ICN突变部分的蛋白结构域与MTA2/HDAC1有直接结合作用;Ch IP实验显示野生型组MTA2/HDAC1与CCL17启动子结合明显高于空载体组,突变型组MTA2/HDAC1与CCL17启动子结合明显低于野生型组。结论:notch1的活化形式ICN入核后与抑制性转录辅因子MTA2/HDAC1结合,对促进下游基因表达的ICN/CSL/Co A转录激活调控起平衡作用。CLL中ICN突变后产生C端截短的蛋白定位于细胞核内,由于与抑制性转录辅因子MTA2/HDAC1结合的位点缺失,导致其抑制性调控作用减弱,使得notch1通路活性增强并引起CCL17表达上调。CCL17的趋化功能促进胸腺T细胞迁移,增强对CLL细胞免疫调节进而促进肿瘤细胞的增殖。

关键词：慢性淋巴细胞白血病 notch1突变 CCL17 迁移 MTA2/HDAC1

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成人T细胞急性淋巴细胞白血病中notch1突变的特征研究

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中国实验血液学杂志 2013年第6期21卷 1403-1408页

作者：林忠琨张闰葛峥刘娟郭星乔纯吴雨洁仇海荣张建富李建勇南京医科大学第一附属医院江苏省人民医院血液科江苏南京210029

本研究旨在阐明notch1突变在成人T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中的特征及临床意义。通过对42例成人T-ALL患者外显子(exon)26/异二聚体N末端(HD-N)、exon27/异二聚体C末端(HD-C)、exon28和exon34/脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸(PEST)... 详细信息

本研究旨在阐明notch1突变在成人T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中的特征及临床意义。通过对42例成人T-ALL患者外显子(exon)26/异二聚体N末端(HD-N)、exon27/异二聚体C末端(HD-C)、exon28和exon34/脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸(PEST)区域进行扩增、克隆和测序,研究notch1突变的发生率、突变位点和类型、突变与临床和实验室指标的相关性及其预后意义。结果显示,本组成人T-ALL中notch1突变率66.7%(28/42),共发现45种notch1突变,最多见于HD-N(48.9%,22/45)和PEST(40.0%,18/45);HD-N结构域突变最多位于氨基酸位点1575(L1575P)(25.0%,7/28),PEST结构域突变最多位于氨基酸位点2443(14.3%,4/28);初诊时白细胞计数大于10×109/L者notch1突变组显著高于无突变组(91.7%vs 54.5%,P=0.021);骨髓原始及幼稚淋巴细胞比例超过50%者突变组显著高于无突变组(95.8%vs 57.1%,P=0.006);流式免疫表型CD10阳性表达率突变组显著高于无突变组(51.9%vs 0%,P=0.006)),CD15和CD11b阳性表达率突变组显著低于无突变组(分别为5.3%vs 42.9%,P=0.047和0%vs 57.1%,P=0.002)。结论:成人T-ALL的notch1突变具有不同于儿童的突变特征和预后意义,而且中国成人T-ALL的notch1突变与西方国家相比可能存在差异。

关键词：成人 T细胞急性淋巴细胞白血病 notch1突变

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IDH1-R123与notch1突变在儿童急性T淋巴细胞白血病中的作用机制

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中国现代医生 2020年第18期58卷 15-18,22页

作者：王晓丽刘永华江锦红浙江省丽水市人民医院血液科浙江丽水323000

目的探讨IDH1-R123与notch1双突变对儿童急性T淋巴细胞白血病(ALL)的作用及机制。方法选择2016年5月~2017年12月丽水市人民医院儿童ALL患者58例作为对象,所有患者入院后均完成IDH1-R123与notch1双突变基因测序,确定IDH1-R123与notch1双... 详细信息

目的探讨IDH1-R123与notch1双突变对儿童急性T淋巴细胞白血病(ALL)的作用及机制。方法选择2016年5月~2017年12月丽水市人民医院儿童ALL患者58例作为对象,所有患者入院后均完成IDH1-R123与notch1双突变基因测序,确定IDH1-R123与notch1双突变在儿童急性T淋巴细胞白血病中的突变率及突变特征,入组患者均给予诱导、巩固及维持治疗,两组治疗后均完成24个月随访,比较突变儿童与非突变儿童生化指标、临床特征及预后。结果58例儿童ALL患者中33例IDH1-R123与notch1双突变,突变率为56.90%;突变儿童血WBC计数、平均血红蛋白高于非突变儿童(P突变儿童平均血小板数低于非突变儿童(P突变25例,占43.10%,突变位于WD40区域,且均为点突变;notch1突变8例,占13.79%,突变位点主要位于HD区域和PEST结构域。其中,HD突变5例,占62.50%,均为氨基酸位点为233;PEST结构域3例,占37.50%;突变儿童与非突变儿童6个月、12个月生存率无统计学意义(P>0.05);突变儿童18个月、24个月生存率低于非突变儿童(Pnotch1双突变在儿童急性T淋巴细胞白血病中突变率较高,且与患者不良预后有关,有助于指导临床诊疗。

关键词： IDH1-R123突变 notch1突变儿童急性T淋巴细胞白血病临床特征

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成人T细胞急性淋巴细胞白血病中notch1基因突变的研究

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临床血液学杂志 2015年第1期28卷 22-25页

作者：徐执政徐静薛永权浙江省长兴县人民医院浙江湖州313100 苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所

目的:探讨notch1突变在成人T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中的特征及临床意义。方法:收集36例成人T-ALL患者初诊时骨髓单个核细胞,对其HD区及PEST区进行扩增、克隆和测序,研究notch1突变的发生率、突变位点和类型及其预后意义。结果:3... 详细信息

目的:探讨notch1突变在成人T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中的特征及临床意义。方法:收集36例成人T-ALL患者初诊时骨髓单个核细胞,对其HD区及PEST区进行扩增、克隆和测序,研究notch1突变的发生率、突变位点和类型及其预后意义。结果:36例T-ALL患者中有15例存在notch1基因突变,占41.7%。其中涉及到HD结构域突变有10例,占27.8%;涉及到PEST结构域突变有5例,占13.9%。对2例有突变的患者进行随访检测发现,初发时存在的点突变在完全缓解时消失,说明突变来自白血病恶性克隆。6例存在notch1基因突变的患者均取得完全缓解。结论:Noch1突变是成人T-ALL患者常见的分子学异常,且与其临床特点、疗效及预后有一定相关性。

关键词：白血病,淋巴细胞,急性,T细胞成人 notch1突变

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notch1底物特异性酶切抑制剂的筛选及其在T-ALL中的作用

Notch1底物特异性酶切抑制剂的筛选及其在T-ALL中的作用

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作者：闫慧上海交通大学

学位级别：硕士

目的:notch1通路的过度激活在T-ALL发病中起到关键作用。本研究旨在筛查我院T-ALL患儿的notch1基因突变谱,探索其发病机制,阐明notch1基因突变在儿童T细胞型急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中的特征及临床意义;制备抑制notch1酶切的底物特异... 详细信息

目的:notch1通路的过度激活在T-ALL发病中起到关键作用。本研究旨在筛查我院T-ALL患儿的notch1基因突变谱,探索其发病机制,阐明notch1基因突变在儿童T细胞型急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中的特征及临床意义;制备抑制notch1酶切的底物特异性抗体,并检测其特异性抑制notch1酶切的效用及其对T-ALL细胞的作用,以期开创针对T-ALL的新型、高特异性低毒副作用的辅助治疗手段。方法:随机入选2009年1月至2013年12月在上海儿童医学中心血液肿瘤科进行治疗的78例T-ALL患儿,利用PCR、Sanger测序法筛查notch1基因异二聚体(HD)区及脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸(PEST)区(涵盖26、27、28及34号外显子)的序列,研究我国T-ALL患儿中notch1基因突变的发生率、位点、类型及其与预后的相关性。通过Western blot方法检测T-ALL患儿中的notch1蛋白活性,并分析其临床相关性;针对notch1 S2酶切位点制备兔多克隆抗体,并检测其对T-ALL细胞的作用;利用杂交瘤单抗筛选技术,针对S2酶切位点筛选小鼠源性单克隆抗体,并检测其对T-ALL细胞的作用。结果:78例患儿中有43例发生notch1突变,总突变率为55.13%(43/78)。30例单独发生于HD区,3例单独发生于PEST区,10例同时发生于HD与PEST区。12例为既往未曾报道的新突变。所有随访患儿的一年短期缓解率为66.67%(46/69),突变组一年短期生存率为85.37%(35/41),无突变组的一年短期生存率为85.71%(24/28),两者之间无统计学差异(P=0.9678)。Western结果显示针对S2酶切位点制备的兔多抗可与notch1特异性相结合。流式结果显示该多抗可结合于经notch1配体DLL4预处理的T-ALL细胞系并促进其凋亡,表明兔多克隆抗体可特异性地、有效地抑制notch1酶切,从而抑制notch1通路的活性,阻碍T-ALL细胞增殖。同样地,针对S2酶切位点制备的鼠单克隆抗体Western blot结果和流式结果显示,该单抗具有特异性和有效性。结论:78例T-ALL患儿的notch1基因突变发生率高、位点多样;notch1突变与患儿临床疾病特征及预后相关,突变组初诊时疾病严重程度更高,短期总生存率与无突变组类似,尽管突变组短期复发率较低,但挽救治疗预后更差。针对S2酶切位点制备的兔多克隆抗体及鼠单克隆抗体均具有特异性与有效性。

关键词： T细胞型急性淋巴细胞白血病(T-ALL) notch1突变酶切抑制剂儿童

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