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Delta1基因转染人牙髓干细胞牙本质形成能力的研究

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中国修复重建外科杂志 2007年第10期21卷 1133-1136页

作者：何飞杨峥嵘谭颖徽崔福斋廖素三第三军医大学附属新桥医院口腔科重庆400037 第三军医大学复合伤研究所清华大学材料科学与工程系

目的探讨notch配体Delta1基因转导的人牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)在裸鼠皮下牙本质的新生能力。方法以Delta1基因转染的第2代人DPSC作为实验组,空载体转染DPSC及单纯DPSC作为对照组,分别与纳米羟基磷灰石/胶原(nano-hydrox... 详细信息

目的探讨notch配体Delta1基因转导的人牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)在裸鼠皮下牙本质的新生能力。方法以Delta1基因转染的第2代人DPSC作为实验组,空载体转染DPSC及单纯DPSC作为对照组,分别与纳米羟基磷灰石/胶原(nano-hydroxyapatite/collagen,nHAC)复合物载体材料复合,倒置荧光显微镜和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长。将实验组和对照组细胞分化诱导后3d制成细胞悬液,按5×107/ml接种于材料表面(100μl/块),体外培养48h。将细胞-材料复合物移植于8只SPF级8周龄BAL B/C-nu/nu雌性裸小鼠背部皮下,术后8周以组织学、免疫组织化学等方法检测牙本质生成情况。结果倒置荧光显微镜观察实验组材料表面及其孔隙内大量细胞生长,表达明亮绿色荧光。扫描电镜观察实验组细胞在载体材料的多孔间隙内大量增殖,细胞伸展良好,分泌大量细胞外基质;而对照组载体内细胞数量则较少。体内移植实验组均可见牙本质-牙髓复合物形成,新生成牙本质样细胞牙本质涎磷蛋白表达阳性;对照组均以纤维结缔组织为主,仅2块移植物有少量牙本质样物质形成。结论DPSC可作为Delta1基因的受体细胞,与nHAC复合后具有成牙本质能力。

关键词： notch信号 Delta1基因牙髓干细胞转染

大鼠Delta1基因转染对树突状细胞生物学特性的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第9期26卷 846-848页

作者：郑凯谭建明吴卫真杨顺良南京军区福州总医院全军器官移植中心福建福州350025

目的:探讨大鼠delta1基因在树突状细胞(DCs)中的表达及其意义。方法:利用脂质体基因转染技术,将含大鼠delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/delta1转染入DCs中,采用流式细胞术(FCM)和混合淋巴细胞培养(MLR)等方法检测delta1基因转... 详细信息

目的:探讨大鼠delta1基因在树突状细胞(DCs)中的表达及其意义。方法:利用脂质体基因转染技术,将含大鼠delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/delta1转染入DCs中,采用流式细胞术(FCM)和混合淋巴细胞培养(MLR)等方法检测delta1基因转染对DCs生物学特性的影响。结果:比较实验组、空载体组和对照组DCs在超微结构、细胞周期和细胞生长速度上无明显差异。FCM检测显示,delta1并不影响DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHC-II类分子Iad的表达;但delta1基因转染的DCs分泌IL-12的水平明显降低(Pnotch信号表达的增加,不影响DCs的分化与成熟,对其免疫学功能起负性调节作用。Delta1的可能机制为其通过抑制DCs分泌IL-12,来促使Th1/Th2细胞亚群的分化倾向于Th2细胞方向。

关键词： notch信号树突状细胞免疫耐受器官移植

过表达notch1胞内域对c-Kit^+骨髓间充质干细胞分化的影响

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中国组织工程研究 2016年第6期20卷 785-792页

作者：哈艳平王振良雷洪丁然然蒋晓帆王可可申志华揭伟广东医学院病理学系广东省湛江市524023

背景:notch信号活化对干细胞分化有重要的影响,其效应具有细胞特异性,但有关notch信号与c-Kit^+骨髓间充质干细胞分化的相关报道较少。目的:分析notch1信号活化对c-Kit^+骨髓间充质干细胞分化的影响。方法:应用PCR从c DNA文库中调取Not... 详细信息

背景:notch信号活化对干细胞分化有重要的影响,其效应具有细胞特异性,但有关notch信号与c-Kit^+骨髓间充质干细胞分化的相关报道较少。目的:分析notch1信号活化对c-Kit^+骨髓间充质干细胞分化的影响。方法:应用PCR从c DNA文库中调取notch1受体胞内域(N1-ICD)序列,定向克隆入腺病毒穿梭质粒GV314构建重组质粒,与腺病毒辅助包装质粒p BHGlox?E1,3 Cre在HEK293T细胞进行同源重组,获得N1-ICD过表达腺病毒颗粒(N1-ICD-Ad)。分离SD大鼠股骨骨髓间充质干细胞,应用磁激活细胞分选法分选出c-Kit^+亚群并用流式鉴定其纯度。将N1-ICD-Ad腺病毒感染c-Kit^+骨髓间充质干细胞,8 d后定量RT-PCR或免疫荧光分析c-Kit^+骨髓间充质干细胞中notch1信号的活化及细胞的分化。结果与结论:(1)从c DNA文库中成功获得N1-ICD序列,将此序列成功克隆入线性化GV314载体,抗性克隆经测序证实无误;(2)在辅助包装质粒p BHGloxΔE1,3 Cre的协助下,成功获得滴度为2×10^(12)PFU/L重组腺病毒颗粒N1-ICD-Ad;(3)成功从SD大鼠骨髓间充质干细胞获得c-Kit^+细胞亚群,纯度达91.6%。包装的腺病毒能有效感染c-Kit^+骨髓间充质干细胞;(4)与空白对照组和阴性对照病毒组相比,N1-ICD-Ad感染c-Kit^+骨髓间充质干细胞后N1-ICD在胞质与胞核聚集,显著上调了notch下游基因Hes1的表达,显著诱导心肌细胞分化基因Nkx2.5和c Tn T的表达,显著上调内皮细胞分化基因v WF的表达,轻微上调平滑肌细胞分化基因SM22α的表达。(5)实验结果提示notch1信号的活化有助于c-Kit^+骨髓间充质干细胞的多向分化,N1-ICD过表达载体构建及腺病毒的包装并转染成功,为进一步研究notch1信号活化对于干细胞生物学功能的影响奠定了基础。

关键词：干细胞骨髓干细胞细胞分化 notch信号腺病毒载体病毒包装骨髓间充质干细胞 c-Kit 国家自然科学基金

敲除Pofut1不影响胚胎干细胞向神经元分化

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中国生物化学与分子生物学报 2014年第6期30卷 591-596页

作者：来丽丽王玉华姚雪莲王磊詹轶群葛常辉安徽医科大学合肥230032 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850 美国爱因斯坦医学院内分泌系纽约NY10461

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1(Pofut1)基因缺失可导致notch分子无法与配体结合并启动信号传递.为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞(ESC)向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体(EB)... 详细信息

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1(Pofut1)基因缺失可导致notch分子无法与配体结合并启动信号传递.为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞(ESC)向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体(EB)分化为神经细胞,计数分化为神经细胞的比例,采用细胞免疫组化染色和real-time PCR等方法,分析神经细胞特异性标志分子的表达.结果显示,Pofut1基因缺失后,对EBC生长没有明显影响,分化过程中形成的拟胚体数量明显增多,分化的神经样细胞以及神经标志物分子的表达也明显多于对照组;notch信号缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响,但可以促进ES细胞向神经细胞分化.

关键词： notch信号蛋白O-连接岩藻糖转移酶1 胚胎干细胞神经细胞分化

阿霉素诱导的骨髓瘤细胞化疗耐药的分子机制分析

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中国实验血液学杂志 2014年第5期22卷 1336-1340页

作者：卢燕燕肖翠容陈华英黄潇胡嘉升鹿全意厦门大学附属中山医院血液科、厦门市临床医学重点专科福建厦门361004

本研究旨在探讨阿霉素诱导的骨髓瘤细胞RPMI8226化疗耐药的分子机制,分析notch信号过度活化在化疗耐药机制中的作用。以浓度梯度递增法建立耐阿霉素的骨髓瘤细胞系RPMI8226/DOX,针对化疗耐药的瘤细胞RPMI8226/DOX,用RT-PCR法检测细胞耐... 详细信息

本研究旨在探讨阿霉素诱导的骨髓瘤细胞RPMI8226化疗耐药的分子机制,分析notch信号过度活化在化疗耐药机制中的作用。以浓度梯度递增法建立耐阿霉素的骨髓瘤细胞系RPMI8226/DOX,针对化疗耐药的瘤细胞RPMI8226/DOX,用RT-PCR法检测细胞耐药前后notch2、Jagged1、Jagged2、HES1基因表达变化;Western blot检测耐药细胞系与敏感细胞系P-170蛋白表达变化;ELISA方法分析IL-6、VEGF水平变化。结果显示,notch2、Jagged1、Jagged2基因随着耐药程度的增高表达逐渐增高,而HES1则相反,随着耐药程度增高表达逐渐减低。P-170蛋白随着耐药程度的增高表达逐渐增高。耐药细胞组培养上清中细胞因子VEGF和IL-6水平显著高于普通培养组。结论:建立的人骨髓瘤细胞系RPMI8226/DOX可以作为骨髓瘤耐药研究的有效模型,notch信号通路的活化与多发性骨髓瘤的耐药密切相关,notch信号通路有望成为多发性骨髓瘤治疗的新靶点。

关键词：多发性骨髓瘤阿霉素化疗耐药 notch信号

DAPT调节Treg/Th17细胞免疫平衡抑制动脉粥样硬化

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中国免疫学杂志 2017年第3期33卷 343-346页

作者：杨敬宁张素罗羽莎陈俊湖北医药学院免疫学教研室十堰442000 湖北医药学院附属东风医院心血管内科十堰442008

目的:观察notch信号抑制剂分泌酶抑制剂(γ-DAPT)对动脉粥样硬化小鼠病理改变及Treg/Th17细胞免疫平衡的影响。方法:将24只Apo E基因敲除C57BL小鼠随机分为空白组、模型组和DAPT组。空白组用普通饲料饲养,模型组和DAPT组用高脂饲料饲养... 详细信息

目的:观察notch信号抑制剂分泌酶抑制剂(γ-DAPT)对动脉粥样硬化小鼠病理改变及Treg/Th17细胞免疫平衡的影响。方法:将24只Apo E基因敲除C57BL小鼠随机分为空白组、模型组和DAPT组。空白组用普通饲料饲养,模型组和DAPT组用高脂饲料饲养。饲养5周后,DAPT组小鼠以100 mg/(kg·d)皮下注射DAPT(溶于DMSO中),其余两组皮下注射等量DMSO。5周后,采用病理染色分析各组小鼠动脉病理改变,ELISA检测血浆中IL-17水平,采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏Treg/Th17细胞比例。结果:HE染色结果显示,模型组有明显粥样斑块形成和泡沫细胞形成,DAPT组动脉病变程度比粥样动脉硬化模型组明显减轻。正常组、模型组和DAPT组各组血浆中IL-17水平分别为(293.94±28.59)、(454.05±172.68)和(335.40±89.57)pg/ml;DAPT降低AS小鼠血浆IL-17水平(P<0.05)。空白组、模型组和DAPT组各组小鼠Treg细胞百分比分别为(3.80±0.56)%、(2.54±0.38)%和(4.73±0.64)%;DAPT降低AS小鼠血浆IL-17水平(P<0.05)。空白组、模型组和DAPT组各组小鼠Th17细胞亚群分别为(3.46±0.23)%、(4.52±0.85)%和(1.38±0.37)%。结论:DAPT降低AS小鼠血浆IL-17的水平,抑制Th17细胞亚群分化,而促进Treg细胞分化,通过改变Treg/Th17细胞免疫平衡从而减轻动脉粥样硬化。

关键词：动脉粥样硬化 notch信号 DAPT 流式细胞术

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

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中国组织工程研究与临床康复 2010年第18期14卷 3331-3334页

作者：郑凯谭建明吴卫真杨顺良解放军南京军区福州总医院全军器官移植中心福建省福州市350025

背景:最近有数据表明,notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受。推测notch/notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用。目的:构建大鼠Delta1基因(notch配体)真核表达载体... 详细信息

背景:最近有数据表明,notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受。推测notch/notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用。目的:构建大鼠Delta1基因(notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上。利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达。结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的HindIII和XbaI双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Delta1送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确。转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Delta1的表达显著增高。实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白。

关键词：树突状细胞 notch信号 Delta1 免疫耐受移植大鼠

小鼠骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化中CBF1的作用

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基础医学与临床 2006年第4期26卷 409-414页

作者：王胜朝 KAWASHIMA Nobuyuki SAKAMOTO Kei KATSUBE Ken-Ichi SHINDO Kentaro SUDA Hideaki 史俊南第四军医大学口腔医学院牙体牙髓病科陕西西安710032 Pulp Biology andEndodontics Molecular Pathology Graduate School of Tokyo Medical and Dental University1-5-45YushimaBunkyo-kuTokyo 113-8549Japan

目的揭示CBF1在骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化过程中的作用。方法采用基因转染法建立CBF1稳定过表达细胞系Kusa-A1/CBF1,检测其成骨活性。指标包括细胞钙沉积能力、碱性磷酸酶活性、体外钙化结节(CN)形成、实时PCR测定细胞骨钙素(OC)和... 详细信息

目的揭示CBF1在骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化过程中的作用。方法采用基因转染法建立CBF1稳定过表达细胞系Kusa-A1/CBF1,检测其成骨活性。指标包括细胞钙沉积能力、碱性磷酸酶活性、体外钙化结节(CN)形成、实时PCR测定细胞骨钙素(OC)和骨桥蛋白(OPN)基因表达、蛋白印迹检测细胞RANKL蛋白。最后用报告基因法检测CBF1对HES1启动子活性的影响。结果经RT-PCR和Western blot鉴定,Kusa-A1/CBF1细胞建立成功。与对照细胞系Kusa-A1/host相比,Kusa-A1/CBF1细胞的钙沉积能力、CN形成能力均显著提高;Kusa-A1/CBF1细胞OC和OPN基因表达和RANKL蛋白水平明显高于对照细胞。瞬时转染notch的细胞内结构域NICD促进HES1的启动子活性,这一作用被CBF1强烈抑制。结论CBF1可以促进Kusa-A1的成骨分化,该作用至少部分是通过影响notch信号实现的。

关键词：转录调控因子CBF1(RBP-Jk) 骨髓基质细胞成骨分化 notch信号

高表达Delta4增加notch基因的表达

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基础医学与临床 2004年第6期24卷 651-656页

作者：马道新纪春岩赵建强郭农建张茂宏于书彦山东大学齐鲁医院血液学研究室济南市中心医院山东大学生理学研究所济南250012

notch信号传导系统在介导造血细胞增殖与分化过程中具有重要作用。通过分子克隆技术成功构建含标记基因FLAG的notch配基Delta4的高表达载体pTracer CMV Delta4 FLAG ,瞬时转染COS7细胞 ,4 8h后收获细胞并制备融合蛋白 ,SDS PAGE凝胶电... 详细信息

notch信号传导系统在介导造血细胞增殖与分化过程中具有重要作用。通过分子克隆技术成功构建含标记基因FLAG的notch配基Delta4的高表达载体pTracer CMV Delta4 FLAG ,瞬时转染COS7细胞 ,4 8h后收获细胞并制备融合蛋白 ,SDS PAGE凝胶电泳和Western blot证实后 ,将其稳定转染CHO细胞 ,Western blot鉴定并筛选高表达Delta4的Delta4 CHO1 4及Delta4 CHO1 5细胞株 ,利用Luciferase分析方法进行Delta4功能性研究。研究结果发现Delta4对notch1及notch2均具有信号功能活性 ,且对后者的活性功能水平大于前者 ,说明Delta4为notch1及notch2的配基。与其他配基功能比较 :对notch1,Delta4的功能活性高于Delta1及Jagged1,但略低于Jagged2 ;对notch2 ,Delta4的功能活性低于Delta1、Jagged1及Jagged2 ,但亦具有较强的活性水平。

关键词：高表达 notch基因功能活性配基 Western-blot notch信号分子克隆技术 COS7细胞 CHO细胞凝胶电泳