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羊传染性脓疱病毒ORF120蛋白以剂量依赖性方式抑制宿主细胞非POU结构域八聚体结合蛋白(nono)的表达

中国兽医学报 2023年第5期43卷 979-985页

作者：于昭辉周艳龙吕丽君刘兴源徐梦实方梓煜李卓梅关继羽高丰赵魁吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062

羊传染性脓疱病毒(ORFV)是重要的人兽共患病病原,能够通过劫持宿主蛋白等多种策略逃避机体的抗病毒免疫反应,导致重复感染的发生。非POU结构域八聚体结合蛋白(nono)是一种多功能核蛋白,参与mRNA剪切、DNA损伤修复、肿瘤发生以及炎症反... 详细信息

羊传染性脓疱病毒(ORFV)是重要的人兽共患病病原,能够通过劫持宿主蛋白等多种策略逃避机体的抗病毒免疫反应,导致重复感染的发生。非POU结构域八聚体结合蛋白(nono)是一种多功能核蛋白,参与mRNA剪切、DNA损伤修复、肿瘤发生以及炎症反应等多种生物学过程。本研究首先利用酵母双杂交、免疫共沉淀(Co-IP)等技术证实ORF120蛋白与宿主蛋白nono存在相互作用。借助于激光共聚焦显微镜观察病毒ORF120蛋白和宿主nono蛋白的定位分布,发现ORF120蛋白与nono蛋白在细胞核内存在共定位,进一步证实ORF120蛋白和nono蛋白存在互作。此外,利用Western blot方法证实ORF120蛋白和nono蛋白之间存在相互抑制作用,且呈剂量依赖性。上述结果表明,ORF120蛋白与宿主nono蛋白存在剂量依赖性的相互抑制作用,该结果将为更好地理解ORFV免疫逃逸分子机制及开发新的抗病毒手段提供重要依据。

关键词：羊传染性脓疱病毒 ORF120蛋白 nono蛋白蛋白互作剂量依赖性抑制

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nono蛋白在丁酸钠诱导小鼠红白血病细胞分化过程中的表达

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解剖学报 2014年第4期45卷 516-520页

作者：桑婷婷胡江江薛建有戚武林赵辅昆张世馥浙江理工大学生命科学学院杭州310018

目的探讨nono蛋白在丁酸钠诱导小鼠红白血病(MEL)细胞向红细胞系分化过程中的表达变化。方法利用联苯胺染色观察丁酸钠诱导MEL细胞红细胞系分化情况,通过Western blotting、免疫细胞化学检测nono蛋白在丁酸钠诱导MEL细胞分化的过程中表... 详细信息

目的探讨nono蛋白在丁酸钠诱导小鼠红白血病(MEL)细胞向红细胞系分化过程中的表达变化。方法利用联苯胺染色观察丁酸钠诱导MEL细胞红细胞系分化情况,通过Western blotting、免疫细胞化学检测nono蛋白在丁酸钠诱导MEL细胞分化的过程中表达量的变化,PCR技术检测nono基因在RNA水平上的表达变化,免疫细胞化学技术检测nono蛋白在MEL细胞中的定位。结果发现nono在丁酸钠诱导MEL细胞向红细胞系分化过程中在基因水平和蛋白水平上均上调表达,nono蛋白在MEL细胞中定位于细胞质和细胞核。结论nono蛋白与丁酸钠诱导MEL细胞分化密切相关。

关键词： nono蛋白小鼠红白血病细胞丁酸钠红细胞系分化免疫组织化学免疫印迹法

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nono蛋白与冠状动脉粥样硬化性心脏病关系的临床研究

NONO蛋白与冠状动脉粥样硬化性心脏病关系的临床研究

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作者：王荣山东大学

学位级别：硕士

背景目前,全世界每年约有2千万人死于急性心血管事件,其中有一半以上为冠状动脉粥样硬化性心脏病。近年来,随着人们生活水平的提高、饮食习惯的改变以及生活压力的增大,冠心病表现出年轻化、高发病率、高致残率和高死亡率的特点。故... 详细信息

背景目前,全世界每年约有2千万人死于急性心血管事件,其中有一半以上为冠状动脉粥样硬化性心脏病。近年来,随着人们生活水平的提高、饮食习惯的改变以及生活压力的增大,冠心病表现出年轻化、高发病率、高致残率和高死亡率的特点。故而,对其进行深入研究,以期开发早期诊断和早期治疗的具体措施具有重要的科学和临床意义。当前,寻找冠心病的早期预警指标,使其防患于未然,也成为当今冠心病领域研究的热点。冠心病的主要病理生理学基础为冠状动脉的粥样硬化斑块形成,而斑块的稳定性改变是急性心血管事件发生的主要原因。动脉粥样硬化斑块的稳定性主要依赖于细胞外基质的支持,其中最主要的成分是胶原纤维,主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。胶原代谢主要是由胶原的合成与降解维持相对平衡来调节的。4羟基-脯氨酸羟化酶（P4H）包括2个α亚基（P4Hα1,P4Ha2）和2个p亚基(P4Hβ1, P4H（32）,两者构成四聚体,是胶原合成过程中的重要限速酶。P4H过表达将会导致胶原合成增多,而抑制了P4H的产生,则可导致胶原代谢的不稳定和降解。我们实验室的前期研究发现：TNF-a通过作用于ASK1-MKK4-JNK1-nono这条信号通路,抑制了P4Ha1的表达,从而抑制了胶原的生成;敲除nono蛋白之后,60%以上的TNFa对P4HalmRNA的抑制作用消失。这表明,nono蛋白在胶原的合成的过程中发挥着重要的作用,并有可能参与斑块易损性的调节。本研究中,拟通过分析稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者外周血中nono蛋白的表达水平,明确该蛋白在冠心病发病过程中的作用,并进而通过分析其在不同患者的表达差异,评价其作为早期预警指标的临床应用价值。目的（1）明确nono蛋白在不同冠心病人群中的表达差异,以评价其作为早期预警指标的可行性。（2）明确nono蛋白在动脉粥样硬化斑块易损中作用的分子机制。方法 1病例资料的收集收集病人和正常人的外周静脉血标本120例,其中男性72例,女性48例。年龄年龄38～73岁,平均55岁,分成4组：正常组30例,急性心肌梗死组30例,不稳定型心绞痛组30例,稳定型心绞痛组30例。入选标准：正常组为经系统查体和冠状动脉CT检查排除冠心病的正常人;冠心病患者按照世界卫生组织WHO的冠心病的诊断标准进行分组。2血中单核细胞的分离所有患者均采集肘静脉血10ml,入EDTA抗凝管,用等体积的淋巴细胞分离液进行分离,在培养箱里培养2-3个小时,显微镜下观察到的贴壁细胞80%为单个核细胞。3免疫荧光染色在分离出来的单核细胞中,分别加入一抗和荧光标记二抗,在激光共聚焦下观察nono蛋白在细胞中的位置。 4实时定量PCR技术通过RNA的提取,逆转录,实时定量PCR的方法检测nono蛋白在不同组之间mRNA水平的表达。 5Western Blot 通过提取蛋白,凝胶电泳,转膜,标记一抗和二抗,显色等步骤观察nono在不同组之间蛋白水平的表达。 6统计学分析所有的数据均采用mean±SEM表示。采用SPSS13.0分析软件,计量资料应用方差分析,三组以上均数差异有统计学意义时,进行两两比较Newman-Keuls（SNK）/q检验。以P＜0.05为有统计学意义。结果 1一般资料：收集正常人和患者的血糖、血脂、血压、心肌酶、吸烟情况等资料。急性心肌梗死组患者的血清中心肌酶的指标均增高;四组患者的吸烟史差别无统计学意义;与正常组相比较,急性心梗组的甘油三酯和LDL明显升高,不稳定组的LDL升高,差别有统计学意义;急性心梗组和不稳定心绞痛组的的收缩压、舒张压较正常组明显升高,差别有统计学意义;急性心梗组的甘油三酯水平明显高于不稳定组和稳定组,急性组的LDL水平明显高于稳定组（P均＜0.05）。其余组间数据,差别无统计学意义。 2免疫荧光染色：在激光共聚焦显微镜下观察,正常组和疾病组单核细胞的细胞核内都有nono蛋白的表达。 3实时定量PCR检测：与正常组相比较,疾病组nono蛋白mRNA水平表达均有不同程度的增高,其中,不稳定型心绞痛组nono蛋白的mRNA水平表达增高最明显（P＜0.01）,其次是急性心肌梗死组（P＜0.05）;不稳定型心绞痛组与稳定型心绞痛组相比,差别有统计学意义（P＜0.05）,其他组间mRNA表达差别无统计学意义。（图3：单因素方差分析,F3.167, df3,75, P＜0.05）4Western-Blot检测：与正常组相比较,不稳定型心绞痛组nono蛋白的表达量明显增高（P＜0.05）,其他组间nono蛋白的表达差异不明显,无统计学意义。（图4：单因素方差分析,F3.154, df3,40, P＜0.05）。结论（1） nono蛋白在不稳定型心绞痛组的表达显著增高,提示nono蛋白可以作

关键词：动脉粥样硬化性疾病 nono蛋白单核细胞

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nono在红系分化过程中的功能研究

NonO在红系分化过程中的功能研究

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作者：桑婷婷浙江理工大学

学位级别：硕士

从受精卵发育成为多细胞的生物个体经历了细胞的增殖、分化、凋亡和迁移过程。在细胞的增殖过程中伴随着细胞的分化,人们越来越认识到肿瘤不仅是细胞异常增生的结果,也是细胞分化障碍的结果,有人认为肿瘤本身就是一种分化疾病。肿瘤细... 详细信息

从受精卵发育成为多细胞的生物个体经历了细胞的增殖、分化、凋亡和迁移过程。在细胞的增殖过程中伴随着细胞的分化,人们越来越认识到肿瘤不仅是细胞异常增生的结果,也是细胞分化障碍的结果,有人认为肿瘤本身就是一种分化疾病。肿瘤细胞与正常细胞相比结构、功能和代谢异常,细胞停止分化且具有异常增殖能力。研究细胞分化和去分化（癌变）是生命科学领域重要的研究内容,因为对其机理的探究能够为我们了解肿瘤的发生机理和肿瘤的防治提供重要的依据。小鼠红白血病（Murine erythroleukemia, MEL）细胞系保留了红系分化的潜能,不表达血红蛋白。但在体外可以被丁酸钠（SB）、二甲基亚砜（DMSO）和六甲基烯二乙酰胺（HMBA）诱导向红系细胞分化,表达血红蛋白,该过程与正常祖细胞的红系分化类似,因此是研究细胞分化的最佳模型。小鼠胎肝是作为研究体内红系分化的良好模型。本课题组前期的胎肝差异蛋白质组学研究中发现nono蛋白的表达量是有差异的,故我们推测nono蛋白可能与小鼠的红系分化有关。通过文献资料的查阅我们进一步发现nono蛋白与黑色素瘤、乳突状肾细胞癌、前列腺癌以及乳腺癌等多种肿瘤的发生密切相关,尤其是在相关的文献中也报道了nono蛋白与红白血病的形成有关。因此我们希望通过在红系系统中研究该蛋白的作用机制为进一步探讨该蛋白与肿瘤的发生提供重要的线索,这对于研究肿瘤的发生和防治具有非常重要的生物学意义。本文以诱导剂丁酸钠诱导MEL细胞分化模型为研究对象,利用瑞氏染色和联苯胺染色检测丁酸钠诱导MEL细胞分化的情况。Western blot和免疫细胞化学检测nono蛋白在诱导分化过程中的表达变化,以及nono蛋白在MEL细胞中的定位,同时检测nono与红系相关调控因子的共定位。为了进一步研究高表达nono对MEL细胞增殖分化的影响,应用慢病毒包装构建稳定高表达nono的MEL细胞株,经过嘌呤霉素筛选得到稳定株后检测nono高表达对MEL细胞的增殖活力、分化的影响。结果表明nono蛋白在丁酸钠诱导MEL细胞分化的过程中表达是上调的,提示nono蛋白的上调表达可能与细胞的分化和恶性白血病细胞的逆转有关。首次通过免疫细胞化学技术分析在MEL细胞中nono蛋白与红系负调控因子PU.1是共定位的,由于PU.1是红系负调控因子,PU.1在红细胞中过度表达会导致红细胞分化终止。提示nono蛋白与红系细胞分化有关。此外,我们通过高表达实验发现在MEL细胞中高表达nono蛋白是不能够直接引起MEL分化的,但能够促进丁酸钠诱导MEL分化,表明在丁酸钠药物处理过程中有其他的因子参与该过程。高表达nono蛋白能够抑制细胞的增殖活力,引起红系正调控因子GATA1的表达量变化,c-Myc表达量下调,这些都表明了nono是红系分化过程中的重要调控因子。

关键词： nono蛋白红系分化丁酸钠 MEL细胞

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