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nogo-66蛋白的免疫原性研究

中华眼科杂志 2008年第6期44卷 565-567页

作者：岳红云贺翔鸽谢琳第三军医大学大坪医院野战外科研究所眼科重庆400042

慢性高眼压导致的视网膜神经节细胞的损伤与中枢神经系统慢性变性的典型损伤反应过程相同，即损伤的视网膜神经节细胞介导了细胞内环境免疫损伤过程，导致进一步的神经细胞损伤。通过增强T淋巴细胞介导的免疫反应能够保护处于“边缘性... 详细信息

慢性高眼压导致的视网膜神经节细胞的损伤与中枢神经系统慢性变性的典型损伤反应过程相同，即损伤的视网膜神经节细胞介导了细胞内环境免疫损伤过程，导致进一步的神经细胞损伤。通过增强T淋巴细胞介导的免疫反应能够保护处于“边缘性损伤”的视网膜神经节细胞。

关键词：免疫原性研究 nogo-66 视网膜神经节细胞损伤过程慢性高眼压蛋白中枢神经系统神经细胞损伤

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nogo-66抑制神经元神经突生长的研究

中国现代医学杂志 2007年第18期17卷 2196-2198页

作者：王丰朱悦中国医科大学附属第一医院骨科辽宁沈阳110001

目的观察在神经干细胞分化过程中nogo-66对神经元神经突生长是否存在抑制作用。方法体外培养大鼠脊髓来源神经干细胞,在神经干细胞分化过程中加入nogo-66的活性片段nogo-p4,NSE抗体免疫荧光标记神经元,使用Image-ProPlus5.0软件测量神... 详细信息

目的观察在神经干细胞分化过程中nogo-66对神经元神经突生长是否存在抑制作用。方法体外培养大鼠脊髓来源神经干细胞,在神经干细胞分化过程中加入nogo-66的活性片段nogo-p4,NSE抗体免疫荧光标记神经元,使用Image-ProPlus5.0软件测量神经突长度。结果对照组神经干细胞分化第3天神经元神经突长度为(97.80±6.97)μm/cell,加入nogo-p4的实验组神经元神经突长度为(80.54±6.75)μm/cell。实验组和对照组神经元神经突长度差异有显著性,Pnogo-66对神经干细胞分化过程中形成的神经元具有神经突生长抑制作用。

关键词： nogo-66 神经干细胞

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nogo-66多克隆抗体的制备和鉴定

中华检验医学杂志 2005年第10期28卷 1064-1067页

作者：谢云峥于盼盼刘东银陆佩华黄立东第二医科大学神经生物学实验室上海200025

目的制备抗中枢神经系统(CNS)突起再生抑制因子nogo胞外段nogo-66的多克隆抗体,以进行nogo分子检测和功能研究。方法采用原核系统表达来源于大鼠的GST-nogo-66融合蛋白,经纯化后免疫新西兰兔制备多克隆抗体,采用免疫印迹、免疫组织化学... 详细信息

目的制备抗中枢神经系统(CNS)突起再生抑制因子nogo胞外段nogo-66的多克隆抗体,以进行nogo分子检测和功能研究。方法采用原核系统表达来源于大鼠的GST-nogo-66融合蛋白,经纯化后免疫新西兰兔制备多克隆抗体,采用免疫印迹、免疫组织化学和细胞培养技术对该抗体的特异性及生物学活性进行鉴定。结果获得了高效价的1∶10000兔抗大鼠nogo-66多克隆抗体,该抗体能够识别原核表达的nogo分子,大鼠脊髓切片的免疫组织化学结果显示,nogo分子在神经元和少突胶质细胞中有广泛表达;并能阻断nogo分子对PC12细胞突起生长的抑制作用,具有一定的生物学活性。结论制备了能识别天然nogo分子,并具有良好生物学活性的抗nogo-66多克隆抗体,为检测nogo分子和进一步研究其功能提供了有力的工具。

关键词：神经再生抗体,多克隆抗体,特异性 nogo-66

nogo-66拮抗性多肽的筛选及其对脊髓损伤大鼠轴突再生的影响

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神经解剖学杂志 2010年第1期26卷 88-92页

作者：陈金荣石增立杨成刘凤石磊刘巍袁文丹滨州医学院病理生理学教研室滨州256603 滨州医学院解剖学教研室滨州256603

目的:筛选与nogo-66特异性结合的多肽,并进行初步功能检测。方法:采用了核糖体展示技术,即体外人工合成引物和含36个随机序列的寡核苷酸,通过两轮PCR构建随机DNA文库,然后在体外进行偶联的转录和翻译,得到含随机12肽的核糖体文库,并利... 详细信息

目的:筛选与nogo-66特异性结合的多肽,并进行初步功能检测。方法:采用了核糖体展示技术,即体外人工合成引物和含36个随机序列的寡核苷酸,通过两轮PCR构建随机DNA文库,然后在体外进行偶联的转录和翻译,得到含随机12肽的核糖体文库,并利用含随机12肽的核糖体文库对nogo-66进行初步筛选。用ELISA方法检测筛选到的多肽与nogo-66的亲和力。同时制备大鼠T10节段挫伤模型,损伤后1d尾静脉注射筛选到的多肽(50g/50l),HRP逆行染色观察脊髓轴突再生情况,并通过BBB评分观察大鼠神经功能恢复。结果:经过10轮筛选,得到了可与nogo-66结合的氨基酸序列,合成相应的多肽NAPA,同时合成对照多肽NAPB。ELISA结果显示,NAPA与nogo-66的亲和力明显高于NAPB与nogo-66的亲和力(P(0.05)。NAPA尾静脉注射4、6周时,实验组大鼠BBB评分明显高于对照组(P(0.05),HRP逆行示踪显示NAPA治疗组的脊髓髓鞘染色清晰,排列规则。结论:筛选得到的nogo-66的配体多肽NAPA可以明显促进脊髓损伤动物的恢复及脊髓再生。多肽NAPA的筛选成功为脊髓损伤的修复提供新的治疗方法和药物选择。

关键词： nogo-66 核糖体展示技术亲和筛选轴突再生

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nogo-66融合蛋白的原核表达及鉴定

免疫学杂志 2005年第3期21卷 256-258页

作者：谢琳贺翔鸽苏踊跃陈渝 Xin-fu ZHOU 第三军医大学大坪医院眼科重庆 400042 第三军医大学西南医院全军烧伤研究所重庆 400038 澳大利亚Flinders大学人类生理学系神经科学中心阿德莱德南澳大利亚 5001

目的原核表达轴突再生抑制蛋白nogo-66,并对其进行鉴定。方法采用聚合酶链反应方法从含nogo-66编码序列的质粒DNA中扩增出nogo-66基因开放阅读框,构建原核表达载体,转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,裂解细菌抽提蛋... 详细信息

目的原核表达轴突再生抑制蛋白nogo-66,并对其进行鉴定。方法采用聚合酶链反应方法从含nogo-66编码序列的质粒DNA中扩增出nogo-66基因开放阅读框,构建原核表达载体,转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,裂解细菌抽提蛋白,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western免疫印迹鉴定。结果测序鉴定nogo-66开放阅读框成功插入pET-46-EK/LIC质粒;重组质粒在大肠杆菌中成功表达大鼠nogo-66蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量(Mr)约7000,WesternBlot结果证实表达产物融合有聚组氨酸标签。结论应用原核表达系统成功表达了nogo-66蛋白,为下一步制备nogo-66蛋白疫苗及疫苗功能研究打下了基础。

关键词： nogo-66 原核表达融合蛋白

RNA干扰技术抑制少突胶质细胞nogo-66表达的实验研究

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RNA干扰技术抑制少突胶质细胞nogo-66表达的实验研究

作者：刘凡同济大学

学位级别：硕士

脊髓损伤（SCI,spinal cord injury）,常对患者神经系统的功能产生巨大的损害甚至导致瘫痪。SCI的治疗一直都是困扰医务工作者及社会的重大难题之一。CNS所处的内环境中阻碍神经轴突再生的因素对抑制CNS再生起到至关重要的作用,研究发... 详细信息

脊髓损伤（SCI,spinal cord injury）,常对患者神经系统的功能产生巨大的损害甚至导致瘫痪。SCI的治疗一直都是困扰医务工作者及社会的重大难题之一。CNS所处的内环境中阻碍神经轴突再生的因素对抑制CNS再生起到至关重要的作用,研究发现少突胶质细胞产生的nogo蛋白对脊髓再生有抑制作用。如何抑制nogo蛋白及其受体的作用已成为SCI基因治疗研究的热点。近年来兴起的RNA干扰技术在分子生物学领域的运用越来越广泛。该技术的机制在于将双链RNA（double-standedRNA,dsRNA）分子引入细胞,使其在mRNA水平上关闭相应序列的基因表达或使其沉默的过程,即序列特异性的转录后基因沉默（posttranscription gene silencing,PTGS）。这一基于核苷酸序列的基因沉默方法较以往的方法在可靠性、有效性、特异性方面都有较大的提高。目的: 探讨小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）对少突胶质细胞中表达nogo—66的抑制作用。通过体外实验了解所用siRNA能否特异性沉默nogo—66基因及其作用的时效性。方法: 1、运用DNAman程序设计nogo—66基因PCR引物。在少突胶质细胞中扩增出nogo-66基因相应片段,建立扩增片段与T载体连接质粒,并测序。 2、运用脂质体将GAPDH siRNA转染入少突胶质细胞,以Western-blot法检测干扰后GAPDH蛋白量,从而探索siRNA作用的有效浓度及有效作用时间。 3、脂质体法转染设计的nogo-66 siRNA,运用荧光定量PCR（fluorescencequantitative PCR）、免疫荧光、Western-blot等方法检测干扰后nogo基因转录表达的变化,及不同时间点nogo-A蛋白表达情况。结果: 1、通过酶切及DNA测序方法鉴定所构建质粒序列正确。nogo—66 PCR扩增片段能用于后续实验。 2、通过转染GAPDH siRNA掌握siRNA作用有效浓度及相应作用起效时间。运用所掌握的方法转染nogo-66基因siRNA,提取转然后48h细胞总RNA,nogo-66PCR结果显示干扰成功。 3、荧光定量PCR结果显示干扰后nogo-66 mRNA含量明显降低,其nogo-66mRNA量占未干扰细胞的0.24%（P＜0.001）,而GAPDH含量无明显变化（P＞0.05）。免疫荧光显示干扰后细胞膜上nogo-A明显减少。以上结果说明RNA干扰效果具有有效性及特异性。Western-blot检测显示干扰48h时nogo-A量最低,干扰效果最佳,干扰120h时nogo-A量恢复到接近无干扰水平。结论: nogo-66 mRNA序列特异性siRNA的引入能高效、特异的减少细胞中相应靶基因mRNA的量,从而降低细胞nogo-66的表达。RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术有望成为脊髓损伤的有效治疗手段。

关键词：脊髓损伤 RNA干扰 RNA,小分子干扰 nogo-66 nogo-A 基因

nogo-66对弥漫性较低级别胶质瘤生物学作用的相关研究

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Nogo-66对弥漫性较低级别胶质瘤生物学作用的相关研究

作者：刘伟超华中科技大学

学位级别：硕士

研究目的胶质瘤（glioma）是成人最常见、致死率最高的颅内恶性肿瘤。弥漫性较低级别胶质瘤（diffuse lower grade glioma,DLGG）是指位于幕上的WHO II级和Ⅲ级成人胶质瘤,约占所有胶质瘤的15%,手术难以完全切除的主要原因是肿瘤细胞弥... 详细信息

研究目的胶质瘤（glioma）是成人最常见、致死率最高的颅内恶性肿瘤。弥漫性较低级别胶质瘤（diffuse lower grade glioma,DLGG）是指位于幕上的WHO II级和Ⅲ级成人胶质瘤,约占所有胶质瘤的15%,手术难以完全切除的主要原因是肿瘤细胞弥漫侵袭多个脑叶。因此,了解DLGG细胞侵袭和转移的相关机制是治疗DLGG的关键。本研究团队前期研究发现,中枢神经系统轴突生长抑制因子nogo-66及其受体NgR在胶质瘤中表达,并对胶质瘤的侵袭和转移产生影响。为了进一步研究nogo-66和NgR在DLGG中的作用及相关机制,我们进行了一系列实验,希望为胶质瘤的诊断和治疗提供新的思路。研究方法收集武汉协和医院2016年9月至2017年12月病理诊断为DLGG的标本共25例。1.将同一肿瘤标本分为两份,一部分进行免疫组化分析胶质瘤标本中nogo-66和NgR的表达情况,另一部分,提取DLGG原代细胞,经小分子干扰RNA（small interference RNA,SiRNA）转染抑制原代细胞中NgR基因的表达,SiRNA转染48h后提取RNA行q RT-PCR,SiRNA转染72h后行Western blot,检测DLGG原代细胞在转染前后NgR基因的表达情况。2.体外培养DLGG原代细胞,根据转染SiRNA的不同,以及nogo-66的有无,将原代细胞分为四组,第一组NC（SiRNA阴性对照）+nogo-66,第二组NC（SiRNA阴性对照）+PBS,第三组SiRNA+nogo-66,第四组SiRNA+PBS,分别进行划痕实验,transwell迁移和侵袭实验,显微镜拍照,并进行统计学分析。研究结果1.DLGG标本经分别经NgR和nogo-66抗体孵化后可见DLGG细胞有很高的NgR表达,而nogo-66高表达于肿瘤组织间质。2.DLGG标本免疫荧光共聚焦结果显示,DLGG细胞有很强的NgR表达,可见NgR和nogo-66共定位于MBP标记的白质纤维束旁,NgR阳性的DLGG细胞沿MBP标记的白质纤维束分布。3.q RT-PCR测定显示SiRNA转染48小时后,NgR基因m RNA表达量相对于阴性对照组显著下降,Western-blot实验证实SiRNA转染72小时后,NgR蛋白表达量相对于阴性对照组显著减少。4.划痕实验显示实验组（SiRNA+nogo-66组）细胞迁移数量低于对照组（NC+nogo-66组）,transwell迁移实验表明实验组（SiRNA+nogo-66组）细胞迁移数量显著低于对照组（NC+nogo-66组）（P＜0.05）。transwell侵袭实验显示实验组（SiRNA+nogo-66组）侵袭的细胞数量显著低于对照组（NC+nogo-66组）（P＜0.05）。研究结论上述研究结果提示DLGG细胞有很强的NgR表达,并从形态学角度证实DLGG细胞沿白质纤维束分布。体外实验显示nogo-66可促进DLGG细胞迁移、侵袭,RNA干扰使NgR基因沉默可抑制这一效应。

关键词： nogo-66 弥漫性较低级别胶质瘤 RNA干扰迁移侵袭

Soluble nogo receptor 1 fusion protein protects neural progenitor cells in rats with ischemic stroke

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Neural Regeneration Research 2019年第10期14卷 1755-1764页

作者： Hai-Wei He Yue-Lin Zhang Bao-Qi Yu Gen Ye Wei You Kwok-fai So Xin Li School of Medicine South China University of TechnologyGuangzhouGuangdong ProvinceChina Department of Emergency Medicine Department of Emergency and Critical Care MedicineGuangdong Provincial People’s HospitalGuangdong Academy of Medical SciencesGuangzhouGuangdong ProvinceChina Department of Physiology and Pathophysiology School of Basic Medical SciencesCapital Medical UniversityKey Laboratory of Remodelling- related Cardiovascular DiseasesMinistry of EducationBeijingChina School of Biomedical Sciences The State Key Laboratory of Brain and Cognitive sciencesLi Ka Shing Faculty of MedicineThe University of Hong KongHong Kong Special Administrative RegionChina

Soluble nogo66 receptor-Fc protein(sNgR-Fc)enhances axonal regeneration following central nervous system injury.However,the underlying mechanisms remain unclear.In this study,we investigated the effects of sNgR-Fc on the proliferation and differentiation of neural progenitor cells.The photothrombotic cortical injury model of ischemic stroke was produced in the parietal cortex of Sprague-Dawley rats.The rats with photothrombotic cortical injury were randomized to receive infusion of 400μg/kg sNgR-Fc(sNgR-Fc group)or an equal volume of phosphate-buffered saline(photothrombotic cortical injury group)into the lateral ventricle for 3 days.The effects of sNgR-Fc on the proliferation and differentiation of endogenous neural progenitor cells were examined using BrdU staining.Neurological function was evaluated with the Morris water maze test.To further examine the effects of sNgR-Fc treatment on neural progenitor cells,photothrombotic cortical injury was produced in another group of rats that received transplantation of neural progenitor cells from the hippocampus of embryonic Sprague-Dawley rats.The animals were then given an infusion of phosphate-buffered saline(neural progenitor cells group)or sNgR-Fc(sNgR-Fc+neural progenitor cells group)into the lateral ventricle for 3 days.sNgR-Fc enhanced the proliferation of cultured neural progenitor cells in vitro as well as that of endogenous neural progenitor cells in vivo,compared with phosphate-buffered saline,and it also induced the differentiation of neural progenitor cells into neurons.Compared with the photothrombotic cortical injury group,escape latency in the Morris water maze and neurological severity score were greatly reduced,and distance traveled in the target quadrant was considerably increased in the sNgR-Fc group,indicating a substantial improvement in neurological function.Furthermore,compared with phosphate-buffered saline infusion,sNgR-Fc infusion strikingly improved the survival and differentiation of grafted neural progenitor cells.Our findings show that s

关键词： neural regeneration nogo-66 receptor nogo66 receptor-Fc protein neural progenitor cells proliferation differentiation stroke photothrombotic cortical injury transplantation neurological function nerve regeneration

nogo-66调节神经细胞β淀粉样蛋白代谢的机制

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神经药理学报 2018年第2期 41-42页

作者：曹巧玉黄依韵谢青青罗焕敏肖飞郑青暨南大学基础医学院暨南大学药学院

目的:本文重点研究nogo-66对β淀粉样蛋白（Aβ）代谢的调节作用及其分子机制,对nogo-66作用机制进行完善;同时,探讨抑nogo-66作用对延缓和阻止AD进程的影响。方法:（1）体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,加入不同浓度的nogo-66处... 详细信息

目的:本文重点研究nogo-66对β淀粉样蛋白（Aβ）代谢的调节作用及其分子机制,对nogo-66作用机制进行完善;同时,探讨抑nogo-66作用对延缓和阻止AD进程的影响。方法:（1）体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,加入不同浓度的nogo-66处理,观察细胞形态及定量分析突起生长状况。（2）通过ELISA检测不同浓度nogo-66作用原代皮质神经元后,Aβ的变化情况。提取新生大鼠原代皮质神经元后,培养两天,加入不同浓度的nogo-66处理,继续培养48 h,收集上清培养基,检测细胞分泌的Aβ;和Aβ;含量。（3）体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,分别加入不同浓度的nogo-66受体阻断剂NEP1-40、受体下游信号分子ROCK（rho-associated coiledcoil-containing protein kinase）的抑制剂Y-27632预保护1 h后,用终浓度为1μmol·L;的nogo-66处理细胞,继续培养48 h,收集上清培养基,检测细胞分泌的Aβ;和Aβ;含量。（4）体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,用2μmol·L;的NEP1-40和100μmol·L;的Y-27632进行预保护,采用1μmol·L;的nogo-66处理细胞造模,Western Blotting检测nogo-66下游信号ROCK通路上各相关蛋白的表达及其磷酸化水平。结果:（1）形态学观测结果显示,当浓度为4μmol·L;、16μmol·L;时,神经元具有明显损伤。MAP2免疫荧光结果显示,nogo-66能显著性抑制突起再生,0.25μmol·L;、1μmol·L;各剂量组皮质神经元平均突起长度显著性降低,具有效关系。表明nogo-66能抑制原代皮质神经元突起的再生。（2）ELISA结果显示,nogo-66能促进Aβ;和Aβ;含量。其中0.5μmol·L;、1μmol·L;的nogo-66能显著增加原代皮质神经元培养基中的Aβ;和Aβ;含量,具有量效关系。（3）加入nogo-66受体阻断剂NEP1-40、ROCK抑制剂Y-27632后,ELISA结果显示,与nogo-66模型组相比,2μmol·L;的NEP1-40能拮抗nogo-66,显著性降低原代皮质神经元培养基中的Aβ;的含量;50μmol·L;、100μmol·L;的Y-27632能拮抗nogo-66,显著性降低培养基中的Aβ;和Aβ;的含量,但量效关系不明显。筛选出NEP1-40和Y-27632最佳作用浓度分别为:2μmol·L;、100μmol·L;。（4）ELISA结果显示,nogo-66模型组（只加nogo-66,不加抑制剂）能显著增加原代皮质神经元和N2a过表达细胞株（由澳门科技大学馈赠）培养基中Aβ;和Aβ;的含量。nogo-66受体阻断剂NEP1-40和ROCK抑制剂Y-27632能拮抗nogo-66,显著性降低培养基中的Aβ;和Aβ;的含量。（5）Western Bolt结果显示,0.5μmol·L;、1μmol·L;的nogo-66能显著性增加原代皮质神经元细胞和N2a过表达细胞株的ROCK2和磷酸化的CRMP2的表达水平,且具有明显的剂量依赖性。结论:（1）nogo-66能抑制原代皮质神经元突起再生,且促进皮质神经元分泌Aβ;和Aβ;;（2）nogo-66是通过激活nogo-66受体及下游信号分子ROCK2和p-CRMP2抑制原代皮质神经元突起再生并促进分泌Aβ;和Aβ;。

关键词：淀粉样神经元突起 nogo-66 新生大鼠