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nifa蛋白的N末端结构域决定肺炎克氏杆菌和阴沟肠杆菌中nifa蛋白的温度敏感性

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中国科学（C辑） 2000年第1期30卷 65-71页

作者：顾剑颖俞冠翘朱家璧沈善炯中国科学院上海植物生理研究所分子遗传研究室上海200032

nifa蛋白是固氮基因的中心调节物 .它激活nif基因转录时依赖于σ5 4 RNA聚合酶全酶 .肺炎克氏杆菌 (Klebsiellapneumoniae ,Kp)nifa蛋白由 3个结构域组成 ,即功能不明的N末端结构域 ,具有ATP酶活性的中心催化结构域和C末端DNA结合结构域... 详细信息

nifa蛋白是固氮基因的中心调节物 .它激活nif基因转录时依赖于σ5 4 RNA聚合酶全酶 .肺炎克氏杆菌 (Klebsiellapneumoniae ,Kp)nifa蛋白由 3个结构域组成 ,即功能不明的N末端结构域 ,具有ATP酶活性的中心催化结构域和C末端DNA结合结构域 .Kpnifa蛋白对温度敏感 ,而阴沟肠杆菌 (Enterobactercloacae ,Ec)nifa蛋白的温度敏感性不如Kpnifa蛋白 .

关键词： nifa蛋白温度敏感肺炎 N末端结构域克氏杆菌

巴西固氮螺菌中杂合双组分蛋白Org35与nifa的相互作用

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农业生物技术学报 2010年第3期18卷 580-585页

作者：崔艳华伍丽娴洪媛媛陈三凤中国农业大学农业生物技术国家重点实验室哈尔滨工业大学食品科学与工程学院

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)可以与玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)等重要作物联合固氮,是重要的潜在生物肥料。nifa蛋白是所有固氮基因转录所必需的激活蛋白。本研究利用融合蛋白下拉分析,探讨了Org35蛋白与nifa... 详细信息

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)可以与玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)等重要作物联合固氮,是重要的潜在生物肥料。nifa蛋白是所有固氮基因转录所必需的激活蛋白。本研究利用融合蛋白下拉分析,探讨了Org35蛋白与nifa蛋白的相互作用。研究表明二者存在互作。Org35蛋白由3个独立结构区域组成,即PAS结构域、组氨酸蛋白激酶结构域和应答调节蛋白区域。本研究采用融合蛋白下拉分析了Org35蛋白三个结构域与nifa的互作关系,结果表明Org35蛋白与nifa蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的。

关键词：巴西固氮螺菌 nifa蛋白 PAS结构域杂合双组分蛋白融合蛋白下拉

PAS结构域介导Org35蛋白与nifa之间相互作用

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科学通报 2006年第8期51卷 985-988页

作者：涂然崔艳华陈三凤李季伦中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京100094 中国农业大学教育部农业微生物环境和资源重点实验室北京100094 中国农业大学生物学院

在巴西固氮螺菌中,氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子,即高浓度的氧和铵抑制固氮作用．nifa蛋白(nifa基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白。目前,在该菌中,氧和铵对nifa蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚．本... 详细信息

在巴西固氮螺菌中,氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子,即高浓度的氧和铵抑制固氮作用．nifa蛋白(nifa基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白。目前,在该菌中,氧和铵对nifa蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚．本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因,将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较,结果表明,Org35蛋白属于杂合双组分调节系统,包括3个结构域,即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR)．并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与nifa蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的．

关键词：巴西固氮螺菌酵母双杂交系统 nifa蛋白 PAS结构域杂合双组分调节系统

巴西固氮螺菌nifa与P_Ⅱ蛋白之间的相互作用

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科学通报 2002年第23期47卷 1820-1823,T001页

作者：陈三凤杜金萍伍丽娴赵银锁李季伦中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室北京100094

利用酵母双杂合系统研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasielense)nifa与PⅡ蛋白之间的相互作用.结果表明:PⅡ蛋白能和完整nifa蛋白自身或其N-端结构域特异结合,不能与nifa的中间或C-端结构域相互作用;与PⅡ蛋白高度同源的Pz蛋白(即Gl... 详细信息

利用酵母双杂合系统研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasielense)nifa与PⅡ蛋白之间的相互作用.结果表明:PⅡ蛋白能和完整nifa蛋白自身或其N-端结构域特异结合,不能与nifa的中间或C-端结构域相互作用;与PⅡ蛋白高度同源的Pz蛋白(即GlnK)也不能与nifa结合.将编码PⅡ蛋白的glnB基因进行移码突变后,突变的PⅡ蛋白失去了与nifa蛋白结合的功能.这说明nifa确实可与PⅡ蛋白特异地结合,但它们之间相互作用的机制尚待进一步研究分析.

关键词：相互作用巴西固氮螺菌酵母双杂合系统 PⅡ蛋白 nifa蛋白特异结合作用机制基因突变

施氏假单胞菌固氮调控蛋白nifa调节电子传递体rnf1基因簇的表达

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中国农业科技导报 2018年第8期20卷 39-45页

作者：黄义刘伟陆超陆伟战嵛华张维燕永亮中国农业科学院生物技术研究所北京100081 浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所杭州310021

施氏假单胞菌A1501中电子传递体基因簇rnf1位于固氮基因岛上,该基因簇的突变造成固氮酶活显著下降。在rnf1基因簇的启动子区含有固氮调控蛋白Nif A的保守结合序列,实时定量qRT-PCR分析证实了nif A突变株中rnf1基因簇的表达量与野生型相... 详细信息

施氏假单胞菌A1501中电子传递体基因簇rnf1位于固氮基因岛上,该基因簇的突变造成固氮酶活显著下降。在rnf1基因簇的启动子区含有固氮调控蛋白Nif A的保守结合序列,实时定量qRT-PCR分析证实了nif A突变株中rnf1基因簇的表达量与野生型相比急剧下调,暗示着Nif A直接参与rnf1基因簇的表达调控。细菌单杂交系统的体内互作实验表明,在大肠杆菌体内Nif A与rnf1基因簇启动子存在直接相互作用;进一步的凝胶阻滞试验证明原核表达纯化的Nif A蛋白与rnf1基因簇启动子序列存在体外直接结合。上述结果从分子水平上给出了两者间相互作用的直接证据,为深入研究联合固氮基因的表达调控网络奠定了基础。

关键词：生物固氮电子传递体基因簇 nifa蛋白凝胶阻滞试验

固氮施氏假单胞菌调控蛋白nifa和GlnK与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作研究

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固氮施氏假单胞菌调控蛋白NifA和GlnK与碳信号分子α-酮戊二酸的...

作者：王珊珊中国农业科学院

学位级别：硕士

生物固氮是高耗能的过程,每还原1分子N2消耗16分子ATP,因此,固氮基因的表达受到胞内严谨的调控,能量合成是影响固氮基因表达的重要因素。中心碳代谢是生物体所需能量的主要来源,α-酮戊二酸是胞内碳状态的信号分子。研究表明,微生物中... 详细信息

生物固氮是高耗能的过程,每还原1分子N2消耗16分子ATP,因此,固氮基因的表达受到胞内严谨的调控,能量合成是影响固氮基因表达的重要因素。中心碳代谢是生物体所需能量的主要来源,α-酮戊二酸是胞内碳状态的信号分子。研究表明,微生物中氮代谢调控蛋白GlnK可通过与α-酮戊二酸结合从而感知体内碳信号并调控氮代谢基因的表达,通过直接分子对话介导碳氮代谢偶联调控。此外,研究发现某些固氮菌中,固氮特异调节蛋白nifa也具有感知并结合α-酮戊二酸的能力,表明固氮基因的表达可直接响应胞内碳信号水平。施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri A1501)是一株水稻根际联合固氮菌,该菌在低氮、微好氧条件具有固氮能力,该菌的固氮基因表达调控机制研究比较深入,但氮代谢调控系统对碳信号的感应传递模式及调控机制仍不清楚。本研究分析了 A1501菌中氮代谢调控蛋白GlnK和nifa的蛋白序列特征,并通过同源建模、位点突变、蛋白表达及蛋白-小分子互作等方法,测定了 A1501菌中GlnK和nifa蛋白与α-酮戊二酸的分子互作,比较了 nifa蛋白与突变蛋白对固氮基因表达的影响,研究结果为深入解析A1501菌的碳氮代谢偶联机制提供理论支持。取得的主要结果如下:1.序列比较及系统发育树分析表明,A1501菌的GlnK和nifa蛋白均与棕色固氮菌中的同源蛋白亲缘关系最近。A1501菌的GlnK蛋白与棕色固氮菌和肺炎克雷伯菌的同源蛋白中均含有已报道的结合α-酮戊二酸的相同氨基酸位点G89(甘氨酸)。nifa蛋白具有与棕色固氮菌结合α-酮戊二酸相同的氨基酸位点F119(苯丙氨酸)。结构域同源建模表明,A1501菌的nifa蛋白第119位点位于无规则卷曲上,该位点突变为S(丝氨酸)后的蛋白无序性显著变化,暗示该位点可能对蛋白构象及对应的调控功能具有重大影响。2.分别构建了 GlnK野生型和第89位氨基酸点突变蛋白(GlnK-G89A,由甘氨酸变为丙氨酸)的表达载体,在大肠杆菌中诱导表达和纯化;采用微量热泳动实验(microscale thermophoresis,MST)测定了 GlnK和GlnK-G89A蛋白与α-酮戊二酸的体外结合。结果表明,GlnK与α-酮戊二酸可以结合,解离常数Kd值为9.75±4.72 μM,没有检测到GlnK-G89A蛋白与α-酮戊二酸的体外结合,表明GlnK第89位点的甘氨酸残基可能在GlnK与α-酮戊二酸的结合中具有重要作用。3.分别构建了 nifa野生型和第119位氨基酸点突变蛋白(nifa-F119S,由苯丙氨酸变为丝氨酸)的表达载体,在大肠杆菌中诱导表达和纯化;采用MST实验测定了 nifa和nifa-F119S蛋白与α-酮戊二酸的体外结合。结果表明,nifa与α-酮戊二酸可以结合,解离常数Kd值为3.42±3.12μM,nifa-F119S蛋白与α-酮戊二酸没有结合能力,表明119位的苯丙氨酸残基可能在GlnK与α-酮戊二酸结合中具有重要作用。4.采用野生型nifa基因及表达nifa-F119S蛋白的突变基因分别回补nifa突变株,固氮酶活性测定表明:两个基因均能回补nifa突变株的固氮活性,其中野生型nifa基因回补菌株的固氮酶活为A1501的155%,而突变nifa基因回补只有野生型的30%左右;荧光定量结果表明,两个回补株中nifa基因均高水平表达,突变nifa基因回补nifH基因表达相对于野生型nifa基因回补下调约35%;Western Blot结果表明,突变nifa基因回补株中NifH表达量相比于野生型下降明显;以上结果表明,119位的苯丙氨酸残基在nifa激活nifH基因的转录调控中发挥重要作用。综上所述,A1501的GlnK、nifa蛋白均具有与α-酮戊二酸体外结合的能力,GlnK的G89位点与nifa蛋白的F119位点可能是A1501菌感应胞内碳信号并启动下游基因表达中的重要活性位点。

关键词：生物固氮施氏假单胞菌A1501 GlnK蛋白 nifa蛋白 α-酮戊二酸

nifa中心结构域多聚功能结构基础的突变分析

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中国科学（C辑） 2001年第1期31卷 71-77页

作者：杨成涛俞冠翘沈善炯朱家壁中国科学院上海植物生理研究所分子遗传室上海200032

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumonia, Kp)nifa中心结构域C3区的点突变型(Thr-290?Val)丧失了激活nif基因转录的功能, 说明这个Thr残基对nifa中心结构域的转录激活功能是关键的. 该点突变型蛋白被用于部分二倍体实验以检测nifa中心结构... 详细信息

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumonia, Kp)nifa中心结构域C3区的点突变型(Thr-290?Val)丧失了激活nif基因转录的功能, 说明这个Thr残基对nifa中心结构域的转录激活功能是关键的. 该点突变型蛋白被用于部分二倍体实验以检测nifa中心结构域的多聚功能. 实验结果表明, nifa中心结构域含有决定nifa蛋白单体间聚合的聚合决定子. 通过构建nifa蛋白的一系列缺失突变型以确定中心结构域中对单体间聚合起关键作用的区域, 证明 252～453氨基酸残基序列参与了Kp nifa中心结构域的多聚功能.

关键词： nifa蛋白中心结构域聚合决定子固氮基因突变分析