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内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

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生物技术通讯 2006年第6期17卷 859-861页

作者：孙世惠周艳荣陈红星林艳丽黄培堂邓继先军事医学科学院生物工程研究所

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P40... 详细信息

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。

关键词： neo基因猪血清白蛋白基因 RT-PCR

通过胚胎干细胞途径获得的嵌合体小鼠中neo基因在各组织中的分布

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Acta Genetica Sinica 2001年第12期28卷 1116-1119,T001页

作者：姚玉成熊俊王新民李建秀胡以平第二军医大学细胞生物学教研室上海200433

为探讨小鼠胚胎干细胞参与早期胚胎发育的潜能 ,以neo基因作为目的基因进行了胚胎干细胞的转染 ,经G41 8的筛选 ,获得表达neo基因的单克隆细胞 ,挑取部分克隆扩大 ,进行小鼠囊胚腔注射 ,再重新植入小鼠子宫 ,共注射了 60个囊胚 ,分别回... 详细信息

为探讨小鼠胚胎干细胞参与早期胚胎发育的潜能 ,以neo基因作为目的基因进行了胚胎干细胞的转染 ,经G41 8的筛选 ,获得表达neo基因的单克隆细胞 ,挑取部分克隆扩大 ,进行小鼠囊胚腔注射 ,再重新植入小鼠子宫 ,共注射了 60个囊胚 ,分别回输到 5只假孕小鼠 ,在子代中得到了携带有neo基因的嵌合体小鼠。通过对嵌合体小鼠各组织PCR分析发现 ,neo基因可以在皮肤、肝脏。

关键词：胚胎干细胞 neo基因嵌合体小鼠组织分布

转基因猪中抗生素标记基因neo漂移风险评估

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中国畜牧兽医 2015年第10期42卷 2720-2725页

作者：王庆庆高鹏飞李和刚马德尊蔡春波钱丽丽姜声旺崔文涛中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室北京100193 青岛畜牧兽医研究所青岛266100

本试验旨在研究转基因猪中抗生素标记基因neo漂移的可能性。利用Southern blotting鉴定F1代仔猪的显隐性,结果发现6头仔猪中有3头为转基因仔猪,3头为阴性仔猪。通过PCR技术对试验仔猪血液和消化道组织中neo基因进行检测,结果发现neo基... 详细信息

本试验旨在研究转基因猪中抗生素标记基因neo漂移的可能性。利用Southern blotting鉴定F1代仔猪的显隐性,结果发现6头仔猪中有3头为转基因仔猪,3头为阴性仔猪。通过PCR技术对试验仔猪血液和消化道组织中neo基因进行检测,结果发现neo基因没有在血液水平和消化道组织中发生漂移。通过PCR技术对试验仔猪肠道细菌中neo基因进行检测,在肠道细菌基因组中没有检测到neo基因的存在。检测结果表明,仔猪血液、肠道细菌和消化道组织等都没有发生neo基因的漂移。

关键词：转基因仔猪 neo基因基因漂移

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究

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军事医学科学院院刊 2004年第3期28卷 209-211,224页

作者：刘志刚林建波张国强安怀杰徐桂清俞炜源军事医学科学院生物工程研究所北京100071

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn U... 详细信息

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。

关键词：真核表达载体 neo基因 CHO/dhfr^-细胞重组蛋白高表达

人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

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中国疼痛医学杂志 2005年第3期11卷 167-170页

作者：安珂田玉科杨辉高峰王鹏华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室

目的构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法采用DNA重组技术将质粒***中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE和空质粒pcD... 详细信息

目的构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法采用DNA重组技术将质粒***中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST)。经G418(600μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养。采用免疫细胞化学法、RTPCR和放射免疫法检测转染细胞亮氨酸脑啡肽(LEK)的表达及分泌,同时检测neo基因的存在以证实转染成功。结果重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和950bb片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE亚克隆成功。neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST中,筛选获得IAST/hPPE和IAST/neo两个细胞株,LEK免疫染色均阳性,但平均光密度结果显示IAST/hPPE的LEK表达明显强于IAST/neo和IAST(Pneo和IAST细胞相比,hPPEmRNA表达水平和培养上清液中LEK的分泌量明显增高(Pneo细胞相比无显著性差异(P>0.05)。结论成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE),为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础。

关键词：前脑啡肽原星形胶质基因修饰细胞株永生化大鼠 pcDNA3.1(+) DNA重组技术免疫细胞化学法重组质粒真核表达载体脂质体介导法亮氨酸脑啡肽 RT-PCR L-EK mRNA表达免疫法检测 neo基因平均光密度培养上清液显著性差异

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山羊Myostatin基因打靶载体的构建

中国草食动物 2006年第3期26卷 10-13页

作者：潘求真孙书锋陆泉枝王海连正兴杨宁李宁谭景和中国农业大学动物科技学院北京锦绣大地农业股份有限公司东北农业大学

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1·4kb、4·5kb。将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源... 详细信息

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1·4kb、4·5kb。将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%。对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建表达neo、Tk基因的哺乳动物双标记转基因载体,并命名为ploxp-M。

关键词： neo基因 Tk基因 ploxP质粒聚合酶链式反应

大肠杆菌-酿酒酵母启动子探针穿梭载体的构建

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大肠杆菌-酿酒酵母启动子探针穿梭载体的构建