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The ubiquitin ligase nedd4-2 mediates the regulation of PepT2 by mTORC1 in bovine mammary epithelial cells

Animal Nutrition 2022年第3期10卷 12-18页

作者： Caihong Wang Fengqi Zhao Jianxin Liu Hongyun Liu College of Animal Science Zhejiang UniversityHangzhou310058China Department of Animal Science and Veterinary Sciences University of VermontBurlingtonVT05405USA

Peptide transporter 2(PepT2)transports short peptides from the blood into bovine mammary epithelial cells(BMEC)to stimulate milk protein synthesis.Despite the fact that the effect of PepT2 is acknowledged in BMEC,little is known about its regulation.This study was completed to investigate the role of mammalian target of the rapamycin(mTOR)signaling in regulating the expression and function of PepT2 in BMEC.The regulation of PepT2 by mTOR in BMEC was studied in vitro using peptide transport assay,gene silencing,Western blot.The membrane expression of PepT2 and the uptake of b-Ala-Lys-N-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid(b-Ala-Lys-AMCA),a model dipeptide,in BMEC were reduced by rapamycin(a mTOR inhibitor)and silencing of either mTOR complex 1(mTORC1)or mTOR complex 2(mTORC2),stimulated by DEP domain-containing mTOR-interacting protein(DEPTOR,endogenous inhibitor of mTORC1 and mTORC2)silencing.The trafficking of PepT2 to the membrane and the uptake of b-Ala-Lys-AMCA was promoted by neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated 4 isoform 2(nedd4-2)silencing.The effects of knockdown of mTORC1,but not mTORC2,on cell membrane expression and transport activity of PepT2 was abolished by nedd4-2 silencing.With immunofluorescence staining,PepT2 was identified to be interacting with nedd4-2.The nedd4-2 expression and the interaction between PepT2 and nedd4-2 was increased through mTORC1 knockdown,indicating an increased ubiquitination of PepT2.The results revealed that mTORC1 can regulate the expression and function of PepT2 through nedd4-2 in BMEC.

关键词： mTORC1 mTORC2 nedd4-2 PepT2 Peptide uptake BMEC

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SGK3以及nedd4-2参与调节OK细胞中NPT2a的分布及活性

SGK3以及Nedd4-2参与调节OK细胞中NPT2a的分布及活性

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作者：刘松华中科技大学

学位级别：硕士

目的:探究SGK3以及nedd4-2对OK细胞中NPT2a分布及活性的影响,初步探讨血清糖皮质激素诱导激酶3(SGK3)、nedd4-2在PTH介导的OK细胞中NPT2a的分布及活性变化中的作用。方法:选用肾脏近曲小管的细胞培养模型(OK细胞)作为研究对象,分别用SGK... 详细信息

目的:探究SGK3以及nedd4-2对OK细胞中NPT2a分布及活性的影响,初步探讨血清糖皮质激素诱导激酶3(SGK3)、nedd4-2在PTH介导的OK细胞中NPT2a的分布及活性变化中的作用。方法:选用肾脏近曲小管的细胞培养模型(OK细胞)作为研究对象,分别用SGK3灭活型质粒SGK3 K191M、nedd4-2野生型质粒瞬时转染OK细胞,提取OK细胞膜成分,用免疫印迹法检测膜上NPT2a表达;提取OK细胞总蛋白,用免疫印迹法检测SGK3、nedd4-2及总蛋白中NPT2a的表达,用放射免疫技术检测OK细胞对Pi的摄取,评价NPT2a活性。并用浓度100n M的重组人甲状旁腺素(1-34)即PTH(1-34)刺激OK细胞0、30min、2h,通过测定OK细胞对放射性Pi的摄取检测磷的转运,评价NPT2a活性;提取OK细胞膜成分用免疫印迹法检测膜上NPT2a表达,提取OK细胞总蛋白用免疫印迹法检测NPT2a的表达变化及SGK3、nedd4-2磷酸化水平。结果:1)SGK3灭活型质粒SGK3 K191M、nedd4-2野生型质粒瞬时转染OK细胞后,OK细胞膜上NPT2a表达减少,细胞总蛋白中NPT2a表达未见明显变化,OK细胞对Pi的摄取减少;2)PTH刺激后,NPT2a在OK细胞膜上的表达减少,细胞总蛋白中NPT2a表达未见明显变化,OK细胞对Pi的摄取减少,SGK3、nedd4-2磷酸化水平降低。结论:SGK3以及nedd4-2参与调节OK细胞中NPT2a的分布及活性;SGK3、nedd4-2可能参与调节PTH介导的OK细胞中NPT2a的分布及活性变化。

关键词： OK细胞 NPT2a 血清糖皮质激素诱导激酶3 nedd4-2 PTH

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nedd4-2/ClC-2泛素化信号通路在大鼠内侧颞叶癫痫发病机制中的作用

Nedd4-2/ClC-2泛素化信号通路在大鼠内侧颞叶癫痫发病机制中的作用

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作者：杨萍中南大学

学位级别：硕士

目的：研究内侧颞叶癫痫（mesial temporal lobe epilepsy,mTLE）大鼠模型以及阻断泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）后各个时期海马组织的病理学改变,分析泛素（Ubiquitin, Ub）、 nedd4-2、ClC-2的表达变化,探讨... 详细信息

目的：研究内侧颞叶癫痫（mesial temporal lobe epilepsy,mTLE）大鼠模型以及阻断泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）后各个时期海马组织的病理学改变,分析泛素（Ubiquitin, Ub）、 nedd4-2、ClC-2的表达变化,探讨nedd4-2/ClC-2泛素化信号通路在mTLE发病机制中的作用。方法：25日龄SD大鼠75只（清洁级）,随机分为3组,对照组、模型组、MG-132（蛋白酶体抑制剂）预处理组。模型组及预处理组大鼠分别予以相应药物（匹罗卡品、氯化锂、MG-132等）腹腔注射进行造模,诱导出现癫痫持续状态（Status epilepticus, SE）,对照组用等量生理盐水代替。造模成功后,根据SE后获取标本的时间不同将各组分别随机分为3个亚组,即急性期组、潜伏期组、慢性期组。（1）对照组、模型组的各亚组：应用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-Ip）技术、免疫荧光双标结合激光共聚焦技术分析大鼠海马中Ub与nedd4-2是否存在相关性;（2）对照组、模型组、MG-132预处理组的各亚组：对各组大鼠模型进行行为学观察;对各组大鼠脑组织切片行HE染色、尼氏染色,观察各组神经元的丢失,Timm染色观察苔藓纤维出芽（Moss fiber sprouting, MFS）;采用Western blot技术检测各组大鼠海马中Ub、nedd4-2、CIC-2的表达水平。结果：对照组大鼠行为学及组织病理学均无改变。氯化锂-匹罗卡品腹腔注射造模成功率为90.0%,死亡率为24.1%,有73.7%的大鼠在8周后出现慢性自发发作。模型组大鼠海马神经元丢失明显,可见MFS, MG-132预处理组病理改变较模型组更为明显,两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 Co-IP及免疫荧光双标结合激光共聚焦技术证明Ub与nedd4-2是有相互关系的蛋白。Western bolt检测模型组和MG-132预处理组Ub、nedd4-2、CIC-2表达均存在变化。Ub结果：模型组与对照组比较表达无明显变化;MG-132预处理组与对照组及模型组比较,急性期及潜伏期中表达上升,慢性期中表达下降（P＜0.05）;nedd4-2结果：模型组与对照组比较,急性期及潜伏期中表达下降,慢性期中表达上升（P＜0.05）;MG-132预处理与对照组比较,三个时期表达均下降（P＜0.05）,与模型组比较,在急性期、慢性期表达下降,潜伏期表达上升（P＜0.05）;CIC-2结果：模型组和对照组的比较与nedd4-2一致;MG-132预处理组与对照组比较,在急性期及慢性期表达降低,在潜伏期升高（P＜0.05）,与模型组的比较与Ub相同。结论：（1）在正常及mTLE大鼠模型的海马中均存在Ub介导的信号通路,nedd4-2是这一途径中的一种关键的泛素-蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligases, E3s）,CIC-2是nedd4-2的靶蛋白之一;（2）nedd4-2/CIC-2泛素化信号通路参与对mTLE发生的调控;而阻断这一通路可促进mTLE的发生及发展,进一步说明nedd4-2/C1C-2泛素化信号通路在mTLE发病机制中起到重要作用。

关键词：内侧颞叶癫痫泛素 nedd4-2 CIC-2 大鼠

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nedd4-2介导Kir4.1通道蛋白泛素化修饰对癫痫发病机制的研究

Nedd4-2介导Kir4.1通道蛋白泛素化修饰对癫痫发病机制的研究

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作者：张贺博中国医科大学

学位级别：硕士

目的:神经前体细胞表达发育下调基因4(nedd4-2),编码泛素连接酶E3。近期研究发现,部分癫痫患者中nedd4-2基因发生突变,并指出nedd4-2通过介导AMPA受体的亚基Glu A1的泛素化,影响神经元的活动和癫痫发作易感性。近年来研究表明,癫痫的发... 详细信息

目的:神经前体细胞表达发育下调基因4(nedd4-2),编码泛素连接酶E3。近期研究发现,部分癫痫患者中nedd4-2基因发生突变,并指出nedd4-2通过介导AMPA受体的亚基Glu A1的泛素化,影响神经元的活动和癫痫发作易感性。近年来研究表明,癫痫的发生与离子通道、神经递质、突触连接等有着密切联系。泛素化修饰的底物中有很多是影响中枢神经兴奋性的离子通道蛋白,泛素化修饰通过调控这些通道蛋白表达水平,进一步影响神经元的兴奋性,与癫痫的发生密切相关。然而是否还有其它未知与癫痫相关的nedd4-2的底物有待进一步的研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术,构建了nedd4-2基因敲除(nedd4-2+/-)小鼠模型,该模型中nedd4-2长亚型和短亚型在脑中表达水平均减半。本研究通过戊四唑(PTZ)诱导实验组nedd4-2+/-(KO)小鼠与对照组nedd4-2+/+(WT)小鼠发生癫痫,采用Label-free蛋白组学检测和体内体外实验等方法,比较KO与WT小鼠海马组织蛋白质表达差异,以期发现新的nedd4-2靶蛋白,揭示nedd4-2参与癫痫发生的新机制。方法:1、nedd4-2基因敲除小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司构建。2、小鼠每天给于PTZ 35mg/kg腹腔注射一次,癫痫发作评分按Racine分级。3、采用Label-free-LC-MS/MS技术检测PTZ诱导癫痫成功点燃的KO小鼠与WT小鼠海马体组织中的差异表达的蛋白质,并进行Cluster,GO和KEGG生物信息分析,筛选出与癫痫相关的差异蛋白。4、提取鼠尾DNA,PCR鉴定小鼠基因型。5、实时荧光定量PCR检测nedd4-2和Kir4.1表达6、小鼠海马,皮质和髓质Western Blot检测nedd4-2和Kir4.1的表达。7、尼氏染色检测小鼠脑组织中神经元数量的变化。8、免疫组织学方法检测Kir4.1在小鼠脑组织中的表达。9、Co-IP检测脑组织内nedd4-2与Kir4.1以及Kir4.1与Ub的结合。10、细胞转染,Western Blot检测nedd4-2和Kir4.1的表达,Co-IP验证转染后Kir4.1的泛素化程度变化。11、Kir4.1表达载体和突变载体转染细胞,Co-IP验证nedd4-2与Kir4.1的结合。12、Kir4.1表达载体和Kir4.1突变体T312A转染细胞,给于放线菌酮(100μg/ml)处理,Western Blot检测Kir4.1表达变化。13、14-3-3表达载体转染细胞,给于R18处理,Western Blot检测Kir4.1表达变化,Co-IP验证nedd4-2与Kir4.1的结合程度变化。14、Kir4.1表达载体分别和nedd4-2表达载体或空载体共转染HEK293细胞,Kir4.1表达载体和Kir4.1突变体T312A分别转染HEK293细胞,记录Ba2+敏感的内向钾离子电流。结果:1、Rt-qPCR和Western Blot结果显示,KO小鼠与WT小鼠相比,nedd4-2在海马,皮质和髓质m RNA和蛋白表达水平均下降约一半。2、小鼠经PTZ注射后,根据Racine评分标准,结果显示KO小鼠癫痫发作评分持续高于WT组。脑组织的尼氏染色结果显示,KO小鼠与WT对照组小鼠相比,尼氏体数量减少,说明神经元损伤更明显。3、海马体蛋白组学分析鉴定的3379个蛋白中,与WT小鼠对照相比,有55个蛋白被认为在KO小鼠中发生改变,其中内向整流k+通道Kir4.1上调了1.83倍。4、分别提取KO小鼠与WT小鼠海马、皮质和髓质总蛋白进行Western Blot实验,结果显示,与对照组WT小鼠相比,nedd4-2表达明显降低(P4.1表达明显增高(P4.1表达升高。6、Co-IP结果显示,与WT组小鼠相比,KO小鼠海马中Kir4.1的泛素化修饰水平明显下调(Pnedd4-2与Kir4.1存在相互作用,另外,与WT组相比,KO组中Kir4.1与nedd4-2结合程度明显减弱(Pnedd4-2干扰载体,与对照组相比,Kir4.1蛋白表达升高。Co-IP结果显示,Kir4.1的泛素化水平明显降低。9、Kir4.1表达载体以及三种突变载体,分别和nedd4-2共转染c6细胞,CoIP实验结果显示,Kir4.1突变体T312A与nedd4-2相互作用明显减弱。10、T312A突变的Kir4.1表达载体和野生Kir4.1表达载体分别和nedd4-2表达载体共转染c6细胞,给于Cycloheximide处理,与WT组相比,突变的Kir4.1仍保持较高水平(P4-3-3与Kir4.1存在相互作用。c6

关键词： nedd4-2 Kir4.1 泛素化癫痫蛋白组学

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