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蛋白酶抑制子nbsipi6在植物抗PVY病毒中的作用

蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用

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作者：刘敏浙江师范大学

学位级别：硕士

植物病毒病由于严重影响作物正常生长发育,发病后又难以防治,造成巨大经济损失,如何有效防治病毒病一直是制约农业生产的重要问题。病毒在侵染寄主植物后,需利用寄主组分,进行复制和移动,因此如何抑制其复制与移动是防治植物病毒病的两... 详细信息

植物病毒病由于严重影响作物正常生长发育,发病后又难以防治,造成巨大经济损失,如何有效防治病毒病一直是制约农业生产的重要问题。病毒在侵染寄主植物后,需利用寄主组分,进行复制和移动,因此如何抑制其复制与移动是防治植物病毒病的两个重要环节。植物蛋白酶抑制子（Plant Protease Inhibitor,PPI）是植物重要的防御组分,调控植物对病、虫与草等的抗性,但PPI对病毒的抗性研究还相对较少。nbsipi6是一个被胁迫诱导表达的大豆胰蛋白酶抑制子家族成员,实验室前期研究发现烟草nbsipi6可抑制PVX病毒的长距离移动,增强本氏烟对PVX的抗性。本实验想进一步探究nbsipi6是否拮抗PVY,以此丰富PPI类基因对抗病毒的认识。本实验利用nbsipi6融合GFP的转基因材料,分析nbsipi6本氏烟对PVY病毒的抗性,并为亚细胞定位和后续免疫沉淀提供基础。此外,分析了nbsipi6响应病毒与水杨酸（Salicylic acid,SA）的表达模式以及nbsipi6对病毒基因沉默抑制子活性的影响,为探索蛋白酶抑制子在抗病毒中的相关作用机制提供依据。主要研究结果如下:1.构建nbsipi6 C端超表达载体与关键氨基酸点突变nbsipi6m融合GFP载体,遗传转化本氏烟。经GFP检测和Hyg抗生素筛选,分别获得3株与7株独立阳性株系。通过实时荧光PCR检测,发现阳性株系中nbsipi6表达量明显高于野生型2.蛋白质发挥作用需要正确折叠为前提,有时融合蛋白会影响蛋白质正确折叠而使靶蛋白丧失功能。因此拟通过验证nbsipi6-GFP转基因植株是否具有抗病毒功能,来确证转基因植物材料的可用性。利用获得的T1代转基因材料,接种PVX-INF1和PVY,与突变株系和野生型相比,超表达nbsipi6-GFP植株显著抑制了病毒的扩散,抗病毒能力明显提高。这说明,nbsipi6 C端融合GFP不改变nbsipi6抑制病毒移动的功能,可以用于后续研究;第二,nbsipi6对病毒抑制不仅局限于PVX,也可提高对PVY的抗性。3.为明确nbsipi6的细胞定位,将质膜Marker mCherry在nbsipi6-GFP超表达株系叶片中瞬时表达,激光共聚焦检测发现,（1）瞬时表达部分区域呈现黄色,表明nbsipi6与mCherry重合,即定位于细胞膜;（2）在细胞内其它区域还有清晰的绿色呈现,表明nbsipi6不仅存在于细胞质膜,在细胞其他区域也有分布;（3）水杨酸或PVX处理后,nbsipi6表达量显著高于对照,说明nbsipi6的表达能够响应水杨酸与PVX。4.基因沉默是植物抵御病毒的重要方式,病毒常常利用基因沉默抑制子来抑制植物的基因沉默作用。因此我们想探究nbsipi6是否具有拮抗病毒沉默抑制子功能。将实验室前期构建的nbsipi6-1300和nbsipi6m-1300等超表达载体分别与病毒沉默抑制子Hc-Pro和P19组合,再与GFP-1300共注射16c本氏烟,通过检测绿色荧光有无和强度,评价nbsipi6对沉默抑制子的作用。研究发现,nbsipi6与Hc-Pro或P19组合中,绿色荧光呈现出与注射Hc-Pro/P19沉默抑制子的相似强度,推测nbsipi6可能不具有抑制病毒沉默抑制子。

关键词： nbsipi6 PVY病毒本氏烟抗病性

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