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水生生物学报 2020年第5期44卷 1087-1096页

作者：张琴琴周莉李志甘瑞海俞兆曦桂建芳汪洋中国科学院水生生物研究所种子创新研究院淡水生态与生物技术国家重点实验室武汉430072 中国科学院大学北京100049 宁夏回族自治区水产研究所(有限公司) 银川750001

为研究生殖干细胞(Germline stem cells, GSCs)的标记基因nanos2的功能,在银鲫(Carassius gibelio)中克隆了两个nanos2的同源基因(Homologs),将其命名为Cgnanos2a和Cgnanos2b,等位、系统进化树和共线性分析表明,在银鲫进化历程中发生了... 详细信息

为研究生殖干细胞(Germline stem cells, GSCs)的标记基因nanos2的功能,在银鲫(Carassius gibelio)中克隆了两个nanos2的同源基因(Homologs),将其命名为Cgnanos2a和Cgnanos2b,等位、系统进化树和共线性分析表明,在银鲫进化历程中发生了额外的两轮多倍化事件,是一个异源六倍体。qPCR分析表明Cgnanos2a和Cgnanos2b在5月龄银鲫精巢中的表达水平最高,其次是卵巢;对在孵化后25—190d的卵巢中的表达动态分析表明,孵化后25d的卵巢中的Cgnanos2a和Cgnanos2b转录水平最高,随后表达水平急剧下降;并且Cgnanos2a和Cgnanos2b呈现出偏向表达的特征。切片RNA原位杂交实验结果表明, Cgnanos2a和Cgnanos2b均特异地在银鲫卵巢邻近生殖上皮的胞囊(Cyst)中一类直径小于20μm的细胞中表达, Cgnanos2a在精巢精小囊边缘一类单个或两个紧紧相邻的细胞中高表达,推测是银鲫的GSCs。此外,还可在精原细胞和初级精母细胞中检测到Cgnanos2a和Cgnanos2b的转录本。研究通过对nanos2阳性细胞的追踪描绘了银鲫卵巢早期胞囊的发育过程,为后续分离银鲫GSCs奠定了基础;同时对银鲫nanos2两个歧化的部分同源基因的序列特征、进化及表达特征分析,为研究鱼类多次多倍化事件后重复基因的进化提供了一个典型例子。

关键词：生殖干细胞银鲫六倍体 nanos2 偏向表达

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nanos2在雄性生殖系统内的研究进展

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中华男科学杂志 2018年第6期24卷 558-561页

作者：黄振宇张贤生安徽医科大学第一附属医院泌尿外科安徽合肥230022

nanos2是nanos基因家族成员之一,编码一种进化保守的RNA结合蛋白,其表达在胚胎期雄性原始生殖细胞(PGCs)和睾丸的精原干细胞(SSCs)内,是一种雄性生殖细胞特异性基因。胚胎发育期间,nanos2能促进雄性PGCs发育并抑制其进入减数分裂;精子... 详细信息

nanos2是nanos基因家族成员之一,编码一种进化保守的RNA结合蛋白,其表达在胚胎期雄性原始生殖细胞(PGCs)和睾丸的精原干细胞(SSCs)内,是一种雄性生殖细胞特异性基因。胚胎发育期间,nanos2能促进雄性PGCs发育并抑制其进入减数分裂;精子生成过程中,nanos2可抑制睾丸SSCs分化进而维持SSC池稳定。敲除nanos2基因能导致雄性小鼠生殖细胞的消失和不育,而睾丸nanos2基因过表达则会引起生精小管内SSCs的累积。此外,nanos2还参与特定RNAs的降解,并且可能与某些雄性生殖系统疾病相关。本文就近年来nanos2在雄性生殖系统内的研究进展现予以综述。

关键词： nanos2 原始生殖细胞精原干细胞性别分化信使核糖核蛋白

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nanos2维持水牛精原干细胞干性特征机制的初步研究

NANOS2维持水牛精原干细胞干性特征机制的初步研究

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作者：张筱芫广西大学

学位级别：硕士

水牛是我国华南地区重要家畜,具有较高的奶用和肉用价值。但我国水牛为沼泽型水牛,产肉、产奶等生产性能较低,急需通过集成多种生物繁殖技术对其进行改良。精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性体内唯一能够进行遗传物质... 详细信息

水牛是我国华南地区重要家畜,具有较高的奶用和肉用价值。但我国水牛为沼泽型水牛,产肉、产奶等生产性能较低,急需通过集成多种生物繁殖技术对其进行改良。精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性体内唯一能够进行遗传物质传递的成体细胞,是进行水牛遗传改良或雄性种质资源保存的理想种子细胞。但目前水牛SSCs自我更新和分化机制尚不明晰,体外培养系统还不完善。已有研究证实nanos2是小鼠雄性生殖细胞发育重要调控因子,在促进小鼠原始生殖细胞向雄性分化及维持SSCs动态平衡过程中起了重要作用。我们前期研究证实水牛nanos2的表达模式与小鼠既存在一致性,也存在差异性,水牛nanos2不但能在幼年水牛和成年水牛的SSCs中表达,也能在成年水牛曲精细管的延长精子细胞中表达,其功能是否与小鼠一致有待证实。本研究在优化水牛SSCs体外培养体系基础上,将构建的nanos2过表达SSC-like细胞进行体外培养,通过对水牛nanos2过表达SSCs的转录组测序及生物信息学分析解析了水牛SSC-like细胞转录组相关变化,揭示nanos2维持水牛SSC-like细胞干性特征相关机制。主要研究结论如下:(1)构建了nanos2过表达载体。以XP61质粒为骨架构建XP61-nanos2过表达载体,利用hy PBase转座酶将其转入水牛睾丸Sertoli细胞以验证nanos2是否能在细胞中表达。结果显示XP61-nanos2过表达载体构建成功。(2)筛选和优化了水牛SSCs体外培养系统。根据先前研究,我们选择无血清培养模式,并设置三种培养方式:饲养层加Insert(F+I)、Laminin加Insert(L+I)及Laminin无Insert(L)以探索对水牛THY1+细胞的最佳体外培养方式。同时对所培养的细胞进行细胞免疫荧光鉴定及RT-PCR对比。结果显示,F+I、L+I培养方式下培养的细胞都能被nanos2、DDX4和PGP9.5一抗着色,但F+I条件更能维持水牛SSC-like细胞的干性。(3)通过对水牛nanos2过表达SSCs的转录组测序及生物信息学分析解析了水牛SSC-like细胞转录组相关变化。对培养的SSC-like细胞进行nanos2过表达后,将进行过表达的SSC-like细胞(X-N SSC-like细胞)和未进行过表达的SSC-like细胞进行转录组测序,检测到表达的基因共有16675个,其中,X-N SSC-like细胞与SSC-like细胞共同表达的细胞有11912个,X-N SSC-like细胞相对于SSC-like细胞具有表达量显著性差异的基因共有2659个(差异倍数>2;Pnanos2可以通过抑制其分化来维持其干性,且nanos2可以促进其自我更新及增殖能力。综上,本研究初步解析了nanos2基因维持水牛SSC干性特征的机制,为今后深入探索水牛SSCs自我更新和分化机制的研究提供参考。

关键词：水牛精原干细胞体系优化 nanos2 转录组测序

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nanos2在黄鳝性腺发育中的表达研究

Nanos2在黄鳝性腺发育中的表达研究

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作者：李勇智华中农业大学

学位级别：硕士

黄鳝(Monopterus albus)是我国重要的名特优水产经济鱼类,同时也是第一个被发现存在自然性逆转现象的脊椎动物。但黄鳝性逆转的分子机制仍然不清楚,根据已有的研究表明nanos2的启动子区域甲基化水平在黄鳝性逆转过程中降低,同时提示其... 详细信息

黄鳝(Monopterus albus)是我国重要的名特优水产经济鱼类,同时也是第一个被发现存在自然性逆转现象的脊椎动物。但黄鳝性逆转的分子机制仍然不清楚,根据已有的研究表明nanos2的启动子区域甲基化水平在黄鳝性逆转过程中降低,同时提示其在黄鳝性腺发育起重要作用。本研究通过实时荧光定量PCR、荧光原位杂交及免疫荧光技术对nanos2基因在黄鳝性腺发育中的时空表达特征进行研究。首先,为确定黄鳝在不同发育阶段的性腺,以便于后续研究,本研究采用石蜡切片HE染色技术对黄鳝的性腺进行了组织学分析。根据性腺的石蜡切片结果,确定了不同发育时期的黄鳝卵巢(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)、间性性腺(早期、中期、晚期)以及精巢(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期)。NCBI搜索结果显示黄鳝nanos基因家族存在3个成员,通过核苷酸序列构建系统发育树先对其同源性进行分析,结果显示黄鳝nanos基因家族与其他硬骨鱼nanos基因具有一定的同源性。利用实时荧光定量PCR分析黄鳝3个nanos基因(nanos1、nanos2和nanos3)在不同发育时期性腺中的时空表达特征。定量结果显示nanos1在肝脏中有高表达,其次是脑和性腺中;nanos2和nanos3均在性腺中有高表达,而在其他组织中表达微弱或不表达。nanos3主要在卵细胞发育晚期的性腺中有高表达,整个精巢发育阶段均处于低表达水平;nanos2在Ⅳ期、Ⅴ期精巢及间性晚期中有高表达,在整个卵巢的发育时期、间性早期以及间性中期nanos2都处于低表达水平。在Ⅳ期、Ⅴ期精巢及间性晚期,通过石蜡切片发现精小囊存在大量精子细胞,表明了nanos2的基因表达水平可能与精子发生相关,其高表达的时期都处于精子形成期。为进一步深入研究nanos2基因的表达特征,通过RACE-PCR获得黄鳝nanos2基因全序列,合成nanos2荧光探针,对性腺组织进行nanos2 m RNA定位;利用原核表达实验合成nanos2重组蛋白,并制备了多克隆抗体,采用免疫荧光实验对黄鳝性腺中的nanos2蛋白进行定位研究。nanos2全长c DNA序列为1139bp,其5’非编码区域具有一段140bp的连续重复序列;开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸,理论大小约20.5 k Da。氨基酸序列比对发现黄鳝nanos蛋白均具有两个保守的锌指结构。荧光原位杂交及免疫荧光结果显示nanos2信号定位于部分体细胞(类似支持细胞)、精原细胞、次级精母细胞、初级精母细胞。另外,nanos2阳性信号在卵巢中定位到一类与精原细胞核径(6～7μm)大小一致的细胞。通过对nanos2在黄鳝性腺发育过程中的时空表达特征研究,发现nanos2主要于精子形成期的性腺中有高表达,暗示其对精子发生具有重要作用。本研究为研究黄鳝性腺发育过程中nanos基因的功能提供了基础。

关键词：黄鳝 nanos2 定量分析荧光原位杂交免疫荧光

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河南华溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因部分序列的克隆及表达特征

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淡水渔业 2020年第5期50卷 10-16页

作者：刘俊卿孙敏王兰山西大学生命科学学院太原030006

为获取河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)nanos1、nanos2和piwi基因的表达特征,在前期河南华溪蟹卵巢组织转录组测序的基础上,对生殖相关基因nanos1、nanos2和piwi进行了克隆和分析,首次获得了河南华溪蟹nanos1、nanos2和piwi基因的部... 详细信息

为获取河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)nanos1、nanos2和piwi基因的表达特征,在前期河南华溪蟹卵巢组织转录组测序的基础上,对生殖相关基因nanos1、nanos2和piwi进行了克隆和分析,首次获得了河南华溪蟹nanos1、nanos2和piwi基因的部分cDNA序列。利用半定量PCR获取了河南华溪蟹nanos1、nanos2和piwi基因的组织表达谱特征和在卵巢发育过程中的表达变化规律。研究结果显示,nanos1基因在卵巢、精巢、鳃、心和肌肉中均有表达;nanos2基因在卵巢、精巢、副性腺、心脏、肠和肌肉中有较高表达,且卵巢中表达量高于精巢中表达量;piwi基因特异表达于卵巢和精巢。卵巢发育中3个基因的表达时序研究显示,nanos1基因从卵巢发育的增殖期、小生长期、大生长期到成熟期表达量逐渐升高,与之相反,nanos2和piwi基因的表达呈现相反的趋势。这些研究结果将为河南华溪蟹nanos1、nanos2和piwi基因的功能分析奠定基础。

关键词：河南华溪蟹(Sinopotamon henanense) nanos1 nanos2 piwi 克隆表达特征

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miR-34c和nanos2在隐睾组织中的表达及其意义

miR-34c和Nanos2在隐睾组织中的表达及其意义

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作者：黄振宇安徽医科大学

学位级别：硕士

目的隐睾作为一种泌尿生殖系统畸形是男性不育症的常见病因之一,高度保守的mi R-34c在精子发生中具有重要作用,nanos2通过抑制精原细胞分化维持精原细胞池稳定。mi R-34c和nanos2在隐睾组织中的表达情况目前尚不清楚,本文旨在探究mi R-... 详细信息

目的隐睾作为一种泌尿生殖系统畸形是男性不育症的常见病因之一,高度保守的mi R-34c在精子发生中具有重要作用,nanos2通过抑制精原细胞分化维持精原细胞池稳定。mi R-34c和nanos2在隐睾组织中的表达情况目前尚不清楚,本文旨在探究mi R-34c和nanos2在隐睾组织中的表达情况以及其与隐睾患者精子发生障碍之间的联系。方法收集6例隐睾患者以及6例梗阻性无精症患者的睾丸组织,定量RT-PCR检测mi R-34c在隐睾患者睾丸组织中的相对表达情况。使用生物信息学工具Target Scan和mi RDB预测mi R-34c的靶标,GC-1小鼠精原细胞中检测mi R-34c过表达和敲低对nanos2表达的影响。构建小鼠隐睾模型,检测mi R-34c和nanos2在小鼠隐睾模型中的表达情况,统计Plzf阳性精原细胞数目,探究mi R-34c以及nanos2的异常表达对隐睾小鼠精原细胞池稳定性的影响。结果本研究中我们发现隐睾会严重损害患者的精子发生,与梗阻性无精症相比mi R-34c在隐睾患者的睾丸组织中表达水平显著下调。生物信息学预测结果显示nanos2可能是mi R-34c的靶标之一,GC-1小鼠精原细胞实验结果表明mi R-34c能调控nanos2基因表达,且两者表达水平负相关。此外mi R-34c在小鼠隐睾模型中表达水平显著下调,nanos2在小鼠隐睾模型中表达水平显著上升,两者表达水平呈负相关性。隐睾小鼠在手术后第14天时Plzf阳性精原细胞数目显著增加,睾丸精原细胞池稳定性发生改变。结论隐睾会严重损害患者的精子发生,且mi R-34c在隐睾患者的睾丸组织中表达水平显著下调,异常表达的mi R-34c/nanos2通路扰乱了精原干细胞自我更新与分化之间的平衡,破坏了精原细胞池稳定性,最终影响睾丸的精子发生。本研究为隐睾患者精子发生障碍的发病机制提供新思路,mi R-34c也许能成为隐睾患者男性不育的治疗靶点之一。

关键词： miR-34c nanos2 隐睾精子发生精原干细胞

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