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水牛Oct4、nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达

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中国农业科学 2014年第2期47卷 394-402页

作者：邓彦飞刘庆友邓海莹罗婵杨素芳石德顺广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室

【目的】转录因子Oct4、nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水... 详细信息

【目的】转录因子Oct4、nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系（iPSC）奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列（Oct4:NM;74580,nanog:NM;01025344）设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和nanog的编码区序列（the coding sequences,CDS）和DNA全长序列,其中Oct4全长DNA分3段扩增,nanog全长DNA分2段扩增;利用生物在线分析软件对水牛Oct4和nanog进行蛋白质结构预测和同源性比对;采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ双酶切,T4连接酶,将Oct4和nanog的CDS连接到逆转录病毒载体pMX上,构建逆转录表达载体pMX-Oct4和pMX-nanog;采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts,BFFs）,逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs,感染12—15h后,继续培养48 h;通过RT-PCR和免疫荧光技术检测转基因在BFFs中的表达情况。【结果】Oct4 CDS全长1 083 bp,编码361个氨基酸,DNA全长4 509 bp,包括5个外显子和4个内含子;nanog CDS全长903 bp,编码301个氨基酸,DNA全长4 473 bp,包括4个外显子和3个内含子;将Oct4和nanog基因序列提交到GenBank,分配的基因登录号分别为JN991003和JN991004;Oct4氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为98%、96%、91%和81%,nanog氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为90%、81%、69%和47%;Oct4和nanog蛋白结构与小鼠相应蛋白的结构相似,分别含有本家族特有的POU结构域和HOX同源结构域;成功构建表达Oct4和nanog的逆转录病毒载体pMX-Oct4和pMX-nanog;逆转录病毒系统pMX介导的Oct4和nanog基因能转入BFFs中,在mRNA水平和蛋白水平都表达,阴性对照中不表达。【结论】分别克隆了水牛Oct4和nanog的DNA序列全长和CDS,其基因序列和氨基酸序列在物种间高度保守;逆转录病毒转基因方法将Oct4和nanog基因成功地转入BFFs并表达。逆转录病毒系统介导目的基因表达的转基因方法可以应用于水牛转基因研究和水牛iPSC生产。

关键词：水牛 Oct4基因 nanog基因克隆异位表达

慢病毒介导nanog基因在小鼠ES细胞的表达

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中国生物工程杂志 2009年第5期29卷 23-27页

作者：曹鸿国殷慧群张卫琴陈涛黄伟玲安徽农业大学动物科技学院合肥230036

试验尝试构建小鼠nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源nanog基因的小鼠ES细胞。结果显示通过RT-PCR扩增出918bp的小鼠nanog基因,测序正确的小鼠nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普... 详细信息

试验尝试构建小鼠nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源nanog基因的小鼠ES细胞。结果显示通过RT-PCR扩增出918bp的小鼠nanog基因,测序正确的小鼠nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源nanog基因的小鼠ES细胞。

关键词：小鼠 ES细胞 nanog基因表达

转nanog基因对6-羟基多巴胺帕金森病大鼠脑核因子-κB表达的影响

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中国老年学杂志 2014年第22期34卷 6401-6404页

作者：陈施艳冯飞阳张志坚周海涛吴秀丽福建医科大学附属第一医院神经内科福建福州350005

目的探讨转nanog基因对6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病(PD)大鼠A脑内核因子(NF)-κB表达的影响。方法取SD大鼠随机分成正常对照组、6-OHDA+磷酸盐缓冲液(PBS)组、6-OHDA+PNL组与6-OHDA+nanog组,各组又分注射后1、14 d亚组。除正常对... 详细信息

目的探讨转nanog基因对6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病(PD)大鼠A脑内核因子(NF)-κB表达的影响。方法取SD大鼠随机分成正常对照组、6-OHDA+磷酸盐缓冲液(PBS)组、6-OHDA+PNL组与6-OHDA+nanog组,各组又分注射后1、14 d亚组。除正常对照组外,采用脑立体定向注射技术,6-OHDA+PBS组注入PBS,6-OHDA+PNL组注入空载体,6-OHDA+nanog组注入转nanog基因载体。各组动物注射阿朴吗啡(APO)后观察各时间点大鼠的旋转行为改变;行脑免疫组织化学染色,观察黑质多巴胺(DA)能神经元数量变化、纹状体NF-κBp65的表达改变;激光扫描共聚焦显微镜技术检测NF-κBp65表达的定位。结果注射后14 d,6-OHDA+nanog组大鼠APO诱发的旋转效应明显低于6-OHDA+PNL组与6-OHDA+PBS组(Pnanog组损毁侧黑质存活的TH阳性细胞数明显高于6-OHDA+PNL组与6-OHDA+PBS组(Pnanog基因可抑制6-OHDA诱导的PD大鼠模型脑内NF-κB的活化,同时具有神经元保护作用。

关键词：帕金森病(PD) 6-羟多巴胺 nanog基因核因子-κB

小鼠胚胎干细胞核心转录因子nanog靶基因Zbtb9的生物信息学分析

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西北农业学报 2008年第5期17卷 21-25页

作者：曹峰李裕强西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

通过特异性引物用RT-PCR方法扩增Zbtb9基因。利用生物信息学对小鼠的Zbtb9基因启动子进行生物信息学分析,预测Zbtb9基因启动子位置和启动子区内含有的转录因子结合位点,以及nanog在Zbtb9基因转录调控中的作用及Zbtb9蛋白的基本性质。Zb... 详细信息

通过特异性引物用RT-PCR方法扩增Zbtb9基因。利用生物信息学对小鼠的Zbtb9基因启动子进行生物信息学分析,预测Zbtb9基因启动子位置和启动子区内含有的转录因子结合位点,以及nanog在Zbtb9基因转录调控中的作用及Zbtb9蛋白的基本性质。Zbtb9基因启动子区可能定位于转录起始点上游790 bp至1024 bp之间。启动子区内含有15个转录调控因子结合位点,nanog的作用靶序列位于Zbtb9基因启动子区与转录起始位点之间,提示nanog在Zbtb9基因转录调控中起作用,小鼠Zbtb9蛋白二级结构可能以螺旋为主,富含疏水性氨基酸;对Zbtb9基因疏水区的氨基酸进行跨膜区分析,提示可能是跨膜蛋白。经SMART分析,Zbtb9蛋白含有BTB/POZ结构域。

关键词：小鼠干细胞转录因子 nanog基因 Zbtb9基因生物信息学分析

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同源结构蛋白nanog基因的研究进展

黑龙江畜牧兽医 2011年第2期 39-41页

作者：胡敏华郭欣政张守全华南农业大学广东广州510642

胚胎干细胞（ES细胞）可以从囊胚期内细胞团（ICM）或原始生殖细胞（PG）中分离得到，在体外能够无限的自我更新，且具有全能性，能够发育成各种不同功能的细胞。这种独特的性质使其在修复治疗、药物研究和再生医学等方面具有广阔的应... 详细信息

胚胎干细胞（ES细胞）可以从囊胚期内细胞团（ICM）或原始生殖细胞（PG）中分离得到，在体外能够无限的自我更新，且具有全能性，能够发育成各种不同功能的细胞。这种独特的性质使其在修复治疗、药物研究和再生医学等方面具有广阔的应用前景。尽管对小鼠胚胎干细胞的研究已有30多年的历史，但是对其如何维持全能性机制尚不明确，确立胚胎干细胞全能性和自我更新的转录调控机制是理解人类发育过程及实现体细胞重编程的基础。

关键词： nanog基因结构蛋白小鼠胚胎干细胞原始生殖细胞细胞全能性同源自我更新调控机制

干细胞标志物nanog基因检测在肺癌免疫诊断及预后中的意义

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中国老年学杂志 2020年第3期40卷 532-534页

作者：郭婧澜谭蓓蓓叶婷刘靳波西南医科大学附属医院检验科四川泸州646000 西南医科大学附属医院核医学科四川泸州646000

目的分析干细胞标志物nanog基因检测在肺癌诊断及预后中的意义。方法肺癌患者100例分为肺腺癌组与肺鳞癌组。采取实时定量RT-PCR检测癌组织与癌旁组织,检测两组干细胞nanog的基因表达水平,并分析两组不同程度下各组织当中nanog的基因表... 详细信息

目的分析干细胞标志物nanog基因检测在肺癌诊断及预后中的意义。方法肺癌患者100例分为肺腺癌组与肺鳞癌组。采取实时定量RT-PCR检测癌组织与癌旁组织,检测两组干细胞nanog的基因表达水平,并分析两组不同程度下各组织当中nanog的基因表达量。结果两组发病年龄大致相同,性别、疾病分期、有无淋巴结转移等方面差异均无统计学意义(P>0.05);与Ⅰ期和Ⅱ期对比,Ⅲ期与Ⅳ期患者nanog基因表达明显升高,且癌组织中nanog基因表达明显高于癌旁组织(Pnanog基因表达明显上升(Pnanog在肺癌中的表达要高于癌旁正常肺组织和良性病变肺组织;在肺癌干细胞CD44+细胞中,nanog表现出高表达状态,nanog高表达的生存率(44%)较低,低表达的生存率(60%)较高,差异有统计学意义(χ^2=4.69,Pnanog基因表达明显升高,主要以Ⅲ、Ⅳ期肺癌表达最为显著,细胞分化程度越低,其癌组织中nanog基因表达越强。

关键词： nanog基因肺癌干细胞

小干扰RNA沉默nanog基因对人肺腺癌A549细胞迁移及侵袭能力的影响

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实用医学杂志 2015年第15期31卷 2433-2436页

作者：王金娜王锦光赵磊辽宁省大连市友谊医院 116110 大连医科大学附属第一医院 116011

目的:观察小干扰RNA(si RNA)沉默nanog基因对人肺腺癌A549细胞迁移及侵袭能力的影响。方法:将A549细胞分为空白对照组(A549)、阴性对照组(si NC)及实验转染组(si nanog)。以脂质体Lipofectamine2000将nanog基因特异性si RNA转染A549细胞... 详细信息

目的:观察小干扰RNA(si RNA)沉默nanog基因对人肺腺癌A549细胞迁移及侵袭能力的影响。方法:将A549细胞分为空白对照组(A549)、阴性对照组(si NC)及实验转染组(si nanog)。以脂质体Lipofectamine2000将nanog基因特异性si RNA转染A549细胞;以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测特异性si RNA对nanog基因在m RNA和蛋白水平沉默效果;以细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测干扰nanog基因前后A549细胞迁移及侵袭能力的改变。结果:RT-PCR及Western blot分别显示A549-si nanog组细胞中nanog基因m RNA及蛋白表达(0.40±0.06及0.50±0.03)较si NC对照组(0.97±0.03及0.85±0.02)明显下降(Pnanog组细胞迁移能力及侵袭能力[(57±0.04)%及69.60±17.14]较si NC对照组[(95±0.02)%及209.60±15.40]明显降低(Pnanog-si RNA能有效抑制A549细胞nanog基因表达,降低人肺腺癌A549细胞迁移及侵袭能力,nanog-si RNA可有效调控A549细胞恶性生物学行为。

关键词：肺腺癌 nanog基因小片段RNA 侵袭

大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、nanog基因的表达及启动子区甲基化观察

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山东医药 2017年第31期57卷 13-16页

作者：刘钦成张梓朗潘润华刘宁韩晓玉郭凌宏王春明廖彩仙南方医科大学南方医院广州510515

目的观察大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、nanog基因表达及启动子区CpG位点的甲基化变化。方法大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞在体外用25μg/L重组人肝细胞生长因子和0.1 nmol/L地塞米松诱导其分化,在诱导第0、7、14天分... 详细信息

目的观察大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、nanog基因表达及启动子区CpG位点的甲基化变化。方法大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞在体外用25μg/L重组人肝细胞生长因子和0.1 nmol/L地塞米松诱导其分化,在诱导第0、7、14天分别提取细胞DNA和RNA。采用实时荧光定量PCR法检测Klf4、nanog基因mRNA,甲基化特异性PCR法观察Klf4、nanog基因启动子区CpG位点甲基化。结果与诱导第0天比较,第7、14天Klf4 mRNA相对表达量降低(P均nanog mRNA相对表达量均降低(P均nanog启动子区第1个CpG位点甲基化频率降低,第2个CpG位点甲基化频率升高,P均nanog启动子区第1个CpG位点甲基化频率升高,第2个CpG位点甲基化频率降低,P均nanog基因表达随诱导时间增加呈现先下降后回升趋势,两者启动子区CpG位点甲基化程度随诱导时间增加出现不同程度变化;Klf4和nanog基因启动子区CpG位点的甲基化变化不仅会影响Klf4、nanog基因的表达,而且起到重要的调控作用。

关键词：骨髓间充质干细胞 CD90^+Lin^-骨髓细胞 nanog基因 Klf4基因

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nanog基因与神经胶质瘤的研究进展

中国微侵袭神经外科杂志 2013年第10期18卷 475-477页

作者：李仲颖牛朝诗安徽医科大学附属省立医院神经外科脑功能与脑疾病安徽省重点实验室合肥230001

神经胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,易复发,病人预后差。nanog作为一种胚胎干细胞因子,在胶质瘤生长中可能起到重要作用,了解nanog的转录及调控机制,对于了解神经胶质瘤的发病机制十分重要。本文就nanog基因的结构、表达调控以及与神经... 详细信息

神经胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,易复发,病人预后差。nanog作为一种胚胎干细胞因子,在胶质瘤生长中可能起到重要作用,了解nanog的转录及调控机制,对于了解神经胶质瘤的发病机制十分重要。本文就nanog基因的结构、表达调控以及与神经胶质瘤的关系进行综述。

关键词：神经胶质瘤 nanog基因胚胎干细胞