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Molecular Cloning, Expression and Purification of Recombinant VHH Proteins Expressed in <i>E. coli</i>

American Journal of Molecular Biology 2021年第4期11卷 129-141页

作者： Tewodros Fentahun Jember Department of Biomedical Sciences College of Veterinary Medicine and Animal Sciences University of Gondar Gondar Ethiopia

Variable Heavy-chain Homodimer (VHH) or nanobody is a recombinant dromedary antibody fragment which is classified as the smallest antibody fragments with the highest binding affinity and specificity of the original whole antibody. In this study the Expression of Nanobodies in E. coli WK6 cell periplasm was performed. The protein expression and purity was and analyzed by Affinity Chromatography, SDS PAGE and Western Blot. Upon elution with Imidazole, the concentrations observed using the OD280 nm of the eluted fractions EI, E2 and E3 were observed to be 0.42 μg/ml, 0.13 μg/ml and −0.46 μg/ml respectively. This gives an Antilog of 7.88 kDa which showed the calculated molecular size of our band. The SDS-PAGE gel reading was confirmed using Western blot analysis and illustrated as the specific binding of the mouse Anti-His antibody to the Histidine tag of the nanobody. The nanobody protein expression was then analyzed further with western blotting showed a strong signal at the region corresponding to the 15 kDa marker indicating presence of the nanobody gene. This was taken as further confirmation of the protein expression from the bacterial cells.

关键词： VHH nanobody Protein

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Development and Application of an Immunoassay for Detection of Cd Based on Specific Nano-body Against Cd-Chelate

Development and Application of an Immunoassay for Detection ...

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：俞华齐 Juan Wang Renren Jiang Gang Yao Shaowei Liu 华东理工大学

In this study,p-SCN-Bn-DTPA was chosen as a bifunctional chelator to facilitate the synthesis of antigens for Cd,and the complete antigen Cd-DTPA-BSA/OVA was gained *** phage antibodies Cd-DTPA-VHH 4-18 and Cd-DTPA-VHH 6-15 were produced through phage display technology successfully and Cd-DTPA-VHH 4-18 was the *** relative affinity is 5.95× 108 L/mol,there exists no cross-reactivity between the antibody and the carrier protein BSA/OVA and also the non-metallic antigen DTPA-BSA/OVA,and almost no cross reaction with other metal *** initially established indirect competitive ELISA immunoassay method detection for the detection of Cd with the prepared phage antibody met the national standard of water quality *** lowest detection limit for Cd using the phage antibody VHH 4-18 was 0.2 nM,and the spiked results showed that the mean recovery was more than 90%.

关键词： Ion cadmium nanobody Phage display Indirect-competition ELISA Application

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Specificity Evaluation and Disease Monitoring in Arthritis Imaging with Complement Receptor of the Ig superfamily targeting Nanobodies

Specificity Evaluation and Disease Monitoring in Arthritis I...

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中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议

作者： Fang Zheng Harris Perlman Patrick Matthys Yurong Wen Tony Lahoutte Serge Muyldermans Shemin Lu Patrick De Baetselier Steve Schoonooghe Nick Devoogdt Geert Raes Department of Biochemistry and Molecular Biology Health Science Center Xi'an Jiaotong University Research group of Cellular and Molecular Immunology Vrije Universiteit Brussel Division of Rheumatology Feinberg School of MedicineNorthwestern University

Single-photon emission computed tomography combined with micro-CT(SPECT/μCT)imaging using Nanobodies against complement receptor of the Ig superfamily(CRIg),found on tissue macrophages such as synovial macrophages,and has promising potential to visualize joint inflammation in experimental ***,we further addressed the specificity and

关键词： Complement receptor of the Ig superfamily(CRIg) Collagen-induced arthritis(CIA) K/BxN serum transferinduced arthritis(STIA) SPECT/μCT nanobody

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Isolation and optimization of camelid single-domain antibodies:Dirk Saerens'work on nanobodies

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World Journal of Biological Chemistry 2010年第7期1卷 235-238页

作者： Dirk Saerens Department of Cellular and Molecular Immunology Vrije Universiteits Brussel-Vlaams Instituut voor BiotechnologyPleinlaan 2B-1050 BrusselBelgium

It is well established that all camelids have unique antibodies circulating in their *** antibodies from all other species,these special antibodies are devoid of light chains,and are composed of a heavy chain *** so-called heavy-chain antibodies(HCAbs)are expressed after a V-D-J rearrangement and require dedicated constant gamma genes. An immune response is raised in these HCAbs following a classical immunization *** HCAbs are easily purified from serum,and their antigen-binding fragment interacts with parts of the target that are less antigenic to conventional *** antigen binding site of the dromedary HCAb comprises one single domain,referred to as VHH or nanobody(Nb),therefore,a strategy was designed to clone the Nb repertoire of an immunized dromedary and to select the Nb with specificity for our target *** monoclonal Nb is produced well in bacteria,is very stable and highly soluble,and it binds the antigen with high affinity and ***,the recombinant Nb has been developed successfully for research purposes, as a probe in biosensors,to diagnose infections,or to treat diseases such as cancer or trypanosomiasis.

关键词： Heavy-chain antibody Single-domain antibody Monoclonal antibody nanobody

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DNA nanoplatform for targeted platinum drug delivery

DNA nanoplatform for targeted platinum drug delivery

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第十一届全国化学生物学学术会议

作者： Tiantian Wu Jianbing Liu Baoquan Ding CAS Key Laboratory of Nanosystem and Hierarchical Fabrication CAS Center for Excellence in NanoscienceNational Center for Nanoscience and Technology

Cisplatin and related platinum analogs have been widely employed in the clinic as first-line chemo-drugs for the treatment of *** observed systemic toxicity and drug resistance induced by high doses of platinum drugs lead to the development of novel strategies to improve drug efficacy. DNA nanostructures,demonstrated excellent biocompatibility and high drug loading capability and were used to efficiently enrich therapeutic drugs in the tumor *** nanocarriers could be an ideal platform for targeted platinum drug ***,we report a facile and universal strategy to deliver platinum-based DNA intercalator(56 MESS) for targeted tumor therapy.A DNA tetrahedron is employed to load 56 MESS through intercalation with DNA *** targeted drug delivery,an anti-EGFR nanobody is conjugated with DNA and assembled on DNA *** nanosystem is used to realize higher drug accumulation in tumor region and block signal transduction of EGFR in the tumor cells with EGFR *** rationally designed DNA nanoplatform exhibits exceptional targetability and higher antitumor efficacy without observable systemic side-effects in *** report demonstrated the first example of combined cancer therapy based on platinum drug 56 MESS and EGFR blocking.

关键词： DNA nanotechnology nanobody Platinum drug Drug delivery Cancer therapy

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长效重组人Bikunin的表达及鉴定

长效重组人Bikunin的表达及鉴定

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作者：刘彩艳上海交通大学

学位级别：硕士

Bikunin是一种含硫酸软骨素糖链的血浆糖蛋白，在肝脏中合成，由肾脏代谢后随尿液排出。研究发现，Bikunin可显著抑制胰蛋白酶，纤溶酶，糜蛋白酶和组织蛋白酶等多种蛋白酶的活性，并能抑制促炎细胞因子的产生，在急性胰腺炎，急性循环... 详细信息

Bikunin是一种含硫酸软骨素糖链的血浆糖蛋白，在肝脏中合成，由肾脏代谢后随尿液排出。研究发现，Bikunin可显著抑制胰蛋白酶，纤溶酶，糜蛋白酶和组织蛋白酶等多种蛋白酶的活性，并能抑制促炎细胞因子的产生，在急性胰腺炎，急性循环衰竭等疾病的治疗中有着广泛的应用。目前市售的Bikunin制剂(乌司他丁)是从人尿中提纯获得，其半衰期较短，且受尿液来源限制，并存在安全隐患及纯化困难等问题，限制了其临床应用。因此，探寻获取高胰酶抑制活性、长半衰期Bikunin的制备方法已成为当前Bikunin的研究热点。 nanobody是克隆骆驼血清中重链抗体可变区而获得的特殊抗体，它保留了原始抗体的抗原表位高结合能力。研究证明，将抗人血清白蛋白nanobody(aAlb)与其他药物偶联或融合使用，可以显著延长该药物在血液中的半衰期，进而成为解决Bikunin半衰期问题的有效方法之一。本课题中，我们利用基因工程手段在CHO细胞中表达了一种全新的aAlb-Bikunin融合蛋白，并最终通过Ni2+金属螯和层析纯化获得目的蛋白。蛋白印迹分析表明目的蛋白分子量约为40kD，并能特异性结合人血清白蛋白及抗Bikunin抗体。通过表面共振技术测得目的蛋白与人和小鼠血清白蛋白亲和力分别为3.93×10M和4.86×10M。体外胰酶抑制试验测得此融合蛋白比活性高达5800IU/mg，且其在动物体内半衰期长达6h。此研究首次应用抗人血清白蛋白nanobody与Bikunin融合表达，获得了活性高且半衰期长的新型重组Bikunin，克服了Bikunin半衰期短、提纯困难的缺点。而aAlb-Bikunin不仅在研究上为药物半衰期的延长提供了一种确实有效的解决方案，同时在急性胰腺炎、急性循环衰竭等疾病的治疗上具有一定的应用价值和临床前景。

关键词： Bikunin nanobody CHO-K1 重组表达活性检测

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Leptin活化ERK/MAPK信号通路促进CGRP表达从而减轻脑缺血性损伤

Leptin活化ERK/MAPK信号通路促进CGRP表达从而减轻脑缺血性损伤

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作者：张金英中国人民解放军医学院

学位级别：硕士

脑中风是导致死亡和残疾的主要原因,急性神经系统疾病中脑中风占将近50%。中风通常表现为缺血再灌注损伤,导致血流量下降和神经细胞损伤。因此,改善血液循环和神经细胞功能是保护大脑免受缺血再灌注损伤的关键。瘦素由ob基因编码,主要... 详细信息

脑中风是导致死亡和残疾的主要原因,急性神经系统疾病中脑中风占将近50%。中风通常表现为缺血再灌注损伤,导致血流量下降和神经细胞损伤。因此,改善血液循环和神经细胞功能是保护大脑免受缺血再灌注损伤的关键。瘦素由ob基因编码,主要由脂肪组织分泌,能够抑制摄食、调节体重以及能量代谢。前期实验已经证实瘦素具有神经保护作用,但是,其下游信号传导机制尚未完全清楚。降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是一公认的舒血管肽,具有改善脑血液循环及保护神经元作用。有报道CGRP竞争性抑制剂CGRP8-37能够部分逆转leptin对雨蛙肽诱导的胰腺炎的保护作用,这个研究结果说明CGRP参与leptin保护雨蛙肽诱导的胰腺炎的保护。本课题拟采用小鼠局灶性脑缺血模型、原代神经元、器官型脑片及神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)缺氧复氧损伤模型,探讨CGRP在leptin改善脑缺血性损伤中的作用及机制。本研究包含以下2个部分：第一部分探讨Leptin改善小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及CGRP在其中扮演的角色;第二部分Leptin是如何调控CGRP达到神经保护作用。结果如下：第一部分：(1)线栓法建立小鼠局灶性脑缺血模型;较单纯损伤组,Leptin处理组小鼠神经功能损伤减轻,右侧梗塞区脑血流有所改善,脑梗死面积降低,凋亡降低。提示leptin具有减轻小鼠脑缺血再灌注损伤的作用。(2)缺血再灌注缺血半影区CGRP表达显著降低;leptin处理组CGRP表达明显增高,提示leptin可能通过促进CGRP表达从而减轻损伤。(3)使用SD胎鼠原代神经元旨在表现leptin对神经元的保护作用及CGRP在其中发挥的作用。leptin显著增加细胞存活率,CGRP竞争性抑制剂CGRP8-37则可逆转上述作用,提示leptin抗凋亡作用可能是通过上调CGRP。(4) leptin显著增加CGRP mRNA水平,增加抗凋亡基因bcl-2,降低促凋亡基因caspase-3,而CGRP8-37则可逆转上述作用。提示leptin可能通过促进CGRP表达从而减轻神经元缺氧复氧损伤。第二部分：(1) SH-SY5Y缺氧复氧损伤诱导后,leptin受体OB-Rb mRNA显著升高;(2)细胞缺氧复氧诱导后细胞凋亡增加,CGRP水平显著降低;1eptin能明显改善细胞状态,促进CGRP合成并具有浓度依赖性,leptin特异性阻断剂nanobody能逆转leptin的上述作用;(3)ERK的特异性抑制剂U0126能够逆转leptin促进CGRP表达的作用。提示leptin通过活化ERK/MAPK通路促进CGRP表达。(4)器官型脑片属组织水平,较细胞模型能够更好的模拟组织中细胞间的相互作用,更加贴近体内环境。与体内水平一致,leptin能显著促进脑片CGRP表达,ERK特异性抑制剂U0126可以逆转上述作用;(5)与细胞水平一致,器官型脑片缺氧复氧损伤后leptin显著增加培养上清中CGRP水平,U0126能够逆转上述作用。提示lepitn通过ERK/MAPK信号通路上调CGRP表达。综上所述,本研究表明：(1) Leptin能显著促进神经元合成和分泌CGRP,并具有浓度依赖性;(2) Leptin竞争性抑制剂nanobody能够逆转leptin促进CGRP表达的作用;(3) CGRP竞争性抑制剂CGRP8-37能够显著降低leptin抗凋亡的作用;(4) 缺氧复氧损伤ERK1/2活化降低,leptin处理后能够上调ERK1/2的活化;(5) ERK特异性抑制剂U0126能够逆转leptin促进CGRP表达作用。

关键词：瘦素脑缺血再灌注损伤降钙素基因相关肽 CGRP8-37 nanobody

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