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中国病原生物学杂志 2022年第10期17卷 1121-1124页

作者：梁亮陈世毅李又云韦一知邓秋云邓丽丽韦敬航马宇燕秦月刘巍广西壮族自治区疾病预防控制中心广西南宁530028 宁明县疾病预防控制中心

目的分离鉴定广西中越边境口岸地区来源的1株NDiV,并对其进行同源性比较和进化分析。方法将蚊虫标本研磨液接种C6/36和BHK21细胞,提取阳性分离物的病毒RNA,合成cDNA后进行二代测序,获得毒株的全基因组序列,利用Editseq软件识别该序列的... 详细信息

目的分离鉴定广西中越边境口岸地区来源的1株NDiV,并对其进行同源性比较和进化分析。方法将蚊虫标本研磨液接种C6/36和BHK21细胞,提取阳性分离物的病毒RNA,合成cDNA后进行二代测序,获得毒株的全基因组序列,利用Editseq软件识别该序列的ORF和非编码区,采用Bioedit 7.0软件进行同源性比较,采用MegaⅩ软件分别构建全基因组、RDRP和S基因的系统进化树。结果接种1批次三带喙库蚊标本的C6/36细胞出现明显的病变,病毒命名为Ad2019035sd,二代测序显示该毒株的NDiV覆盖率为99.80%;比较Ad2019035sd与Mesoniviridae科参考株全基因组核苷酸同源性在57.9%~98.9%之间,主要蛋白的编码基因核苷酸和氨基酸同源性分别在56.7%~100%和40.0%~99.5%之间,其中与深圳毒株SZ11706Z的同源性最高。全基因组、RDRP和S基因系统进化树均显示毒株Ad2019035sd与两株NDiV毒株在同一进化分支。结论毒株Ad2019035sd为NDiV,与深圳毒株SZ11706Z高度同源,为广西地区NDiV感染情况调查及相关研究提供了基础资料。

关键词： nam dinh病毒中越边境口岸全基因组系统进化树

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四川省nam dinh病毒的首次分离鉴定

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中国病毒病杂志 2022年第2期12卷 108-113页

作者：李伟张佳珂林世华周兴余冯玉亮四川省疾病预防控制中心微生物检验所虫媒病毒室四川成都610041

目的对2015年从四川省西部的甘孜藏族自治州蚊虫中分离到的病毒株SC1502、SC1510进行鉴定并分析其基因特征。方法通过细胞培养的方法对蚊虫标本进行病毒分离,利用nam dinh病毒(nam dinh virus,NDiV)特异性引物进行逆转录聚合酶链反应(re... 详细信息

目的对2015年从四川省西部的甘孜藏族自治州蚊虫中分离到的病毒株SC1502、SC1510进行鉴定并分析其基因特征。方法通过细胞培养的方法对蚊虫标本进行病毒分离,利用nam dinh病毒(nam dinh virus,NDiV)特异性引物进行逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)鉴定,同时扩增分离株的开放阅读框、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerase,RdRp)、解旋酶超家族1(superfamily 1 helicase,HEL1)、刺突蛋白(spike protein,S蛋白)基因序列并测序,然后利用Mega Align软件对核苷酸序列和推测的氨基酸序列进行比对分析,利用Mega 7软件绘制系统进化树。结果SC1502、SC1510病毒株能够引起C6/36细胞发生病变,但不能引起BHK-21细胞的病变。同源性分析结果显示,2株四川新分离株与NDiV的RdRp、HEL1、S蛋白的核苷酸和氨基酸同源性最高,分别超过99.4%和97.5%。系统进化分析结果表明,2株四川新分离株与NDiV亲缘关系最近,处于同一进化分支。结论SC1502与SC1510为NDiV,该研究结果丰富了四川省的虫媒病毒病原谱数据库,对相关地区的不明原因疫情分析和调查提供了参考依据。

关键词： nam dinh病毒 RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp) HEL1基因 S基因系统进化树

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云南省nam dinh病毒的首次鉴定（英文）

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寄生虫与医学昆虫学报 2016年第2期 91-97页

作者：赵秋敏郭晓芳曾旭灿周红宁张久松云南省寄生虫病防治所云南省虫媒传染病防控研究重点实验室军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室

本研究对云南省分离的一株nam dinh病毒(NDi V)进行鉴定,并对其全基因组特征进行分析。采用白纹伊蚊C6/36细胞对2009年在云南省采集的蚊虫进行病毒分离;采用RT-PCR方法对阳性病毒分离物进行鉴定,在电镜下观察其形态特征;采用Mega 5软件... 详细信息

本研究对云南省分离的一株nam dinh病毒(NDi V)进行鉴定,并对其全基因组特征进行分析。采用白纹伊蚊C6/36细胞对2009年在云南省采集的蚊虫进行病毒分离;采用RT-PCR方法对阳性病毒分离物进行鉴定,在电镜下观察其形态特征;采用Mega 5软件对病毒全基因组序列进行系统进化分析。结果从一组三带喙库蚊标本中分离出一株NDi V。该病毒为球形颗粒,直径约100160 nm;基因组全长为20 126bp,包括6个开放读码框架,与越南NDi V 02VN178株和中国深圳SZ11706Z株核苷酸和氨基酸同源性分别为94.0%100%和97.4%100%,同属于套式病毒目Mesoniviridae病毒科。本研究获得的NDi V毒株及其全基因组序列特征系云南省首次报告。

关键词： nam dinh病毒病毒分离全基因组三带喙库蚊

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深圳市龙岗区部分蚊传虫媒病毒的分子流行病学研究

深圳市龙岗区部分蚊传虫媒病毒的分子流行病学研究

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作者：周健明广东药学院

学位级别：硕士

目的了解深圳市龙岗区成蚊携带虫媒病毒的情况，探讨相关病毒株的分子流行病学特征，为蚊媒传染病的预防与控制提供依据。方法2009011年，在龙岗区的龙城、南湾、坂田等10个街道及21个大运场馆室内外环境设立监测点，按照《全国病媒生... 详细信息

目的了解深圳市龙岗区成蚊携带虫媒病毒的情况，探讨相关病毒株的分子流行病学特征，为蚊媒传染病的预防与控制提供依据。方法2009011年，在龙岗区的龙城、南湾、坂田等10个街道及21个大运场馆室内外环境设立监测点，按照《全国病媒生物监测方案》监测方法采集成蚊标本。采用SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR进行乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、登革病毒(Dengue virus，DV)和nam dinh病毒(nam dinh virus，NDiV)等虫媒病毒的检测，分析成蚊病毒感染情况;用C6/36与BHK-21细胞进行相关病毒的分离工作，以TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR与基因扩增技术进行病毒鉴定。测序基因扩增片段，用ClustalX、Mega4、DNASTAR等软件对测序结果进行同源性分析与构建系统进化树。结果共采集成蚊25556只，隶属3属7种，分别是按蚊属的中华按蚊、微小按蚊、嗜人按蚊;库蚊属的三带喙库蚊和致倦库蚊;伊蚊属的东乡伊蚊和白纹伊蚊。致倦库蚊23962只，为优势蚊种，占93.8%;东乡伊蚊637只，占2.5%;白纹伊蚊有408只，占1.6%;三带喙库蚊385只，占1.5%;其他种类占0.6%。 SYBR GreenⅡ实时荧光RT-PCR检测结果显示，有2批致倦库蚊和1批三带喙库蚊标本检出乙脑病毒核酸阳性，白纹伊蚊和东乡伊蚊标本各1批检出登革病毒核酸阳性;4批致倦库蚊标本检出nam dinh病毒核酸阳性。 4批NDiV核酸阳性标本能引起C6/36细胞出现典型的细胞病变(CPE)，但不引起BHK-21细胞的病变。SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测JEV和DV核酸阳性的标本接种C6/36细胞和BHK-21细胞后，未能分离到相关病毒。用TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR检测NDiV分离物中病毒核酸随时间推延的增殖情况，检测结果显示0天、3天、6天、9天分离物的Ct值呈梯度减少，表明随分离时间的增加，培养液中病毒核酸含量同步递增。对4株深圳NDiV进行RdRp基因和部分ZmHel1基因的扩增，扩增产物在2%琼脂糖电泳均出现目的条带。4株分离株RdRp基因核苷酸序列间同源性在99.800.0%之间，氨基酸序列同源性为99.700.0%;深圳分离株的RdRp基因核苷酸和氨基酸序列与越南代表株NDiV(02VN178)的同源性均达99%以上;系统进化树分析，深圳NDiV分离株与越南NDiV代表株的亲缘性最近，同属一个进化分支。结论本研究首次在深圳市龙岗区开展全面的虫媒病毒传播媒介的监测，证实了致倦库蚊为当地的优势蚊种。在采集的成蚊标本中检测到JEV和DV核酸，提示病毒存在低水平的自然循环，当地有可能是乙脑、登革热的自然疫源地。继2011年全球首次在越南发现蚊传套式病毒-NDiV后，本研究发现深圳市致倦库蚊中携带该病毒，这是中国国内首次发现NDiV[1]，进化树分析显示深圳NDiV分离株与越南分离株在遗传进化学上存在联系。

关键词：深圳市龙岗区乙脑病毒登革病毒 nam dinh病毒序列分析

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NDiV致病性初步研究及实时荧光PCR检测方法的建立

NDiV致病性初步研究及实时荧光PCR检测方法的建立

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作者：梁克峰广东药科大学

学位级别：硕士

目的nam dinh virus（以下简称NDiV）是近年新发现的虫媒病毒,本课题组在国内首次成功从成蚊中分离,但该病毒流行病学意义和检测方法尚鲜见报道。本次研究拟建立一种特异、快速检测成蚊中NDiV的实时荧光定量PCR方法,为环境中的蚊虫携带N... 详细信息

目的nam dinh virus（以下简称NDiV）是近年新发现的虫媒病毒,本课题组在国内首次成功从成蚊中分离,但该病毒流行病学意义和检测方法尚鲜见报道。本次研究拟建立一种特异、快速检测成蚊中NDiV的实时荧光定量PCR方法,为环境中的蚊虫携带NDiV的状况提供快速检测的方法提供参考。通过动物试验了解NDiV其致病作用,为指导虫媒传染病的控制提供依据。方法用C6/36细胞培养nam dinh病毒,待4-6天出现明显细胞病变时离心纯化病毒,50%细胞终点法测定病毒滴度。将已测定滴度的NDiV分离物分别在蚊虫细胞（C6/36细胞）和哺乳动物细胞培养,观察NDiV在不同细胞的生长状况。动物实验:（a）3-4日龄乳鼠,分组处理后在乳鼠脑部、腹腔和鼻腔接种不同剂量的病毒分离液,观察乳鼠接种病毒后的发病情况并作记录,提取发病组织研磨液核酸做RT-PCR检测并做病毒鉴定。（b）6日龄SPF鸡胚,分组处理后在SPF鸡胚卵黄囊、尿囊腔、羊膜腔接种不同剂量的病毒分离液,观察其孵育情况。（c）雏鸡,分组处理后在雏鸡的脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种病毒分离液,记录出现症状的雏鸡数。收集乳鼠和鸡胚的发病部位或组织,研磨后提取核酸做RT-PCR检测。以上实验均设立对照组。分析NCBI中的越南和中国的NDiV病毒株全序列特征,选取保守区域RdRp基因,设计NDiV的特异性引物与TaqMan-MGB探针,通过优化试验后验证所建立方法的特异性、敏感性、稳定性和应用性。建立特异性高、灵敏度强的实时荧光PCR快速检测方法。结果利用建立的RT-PCR方法检测NDiV分离物在蚊虫细胞（C6/36细胞）和哺乳动物细胞随时间的生长情况,检测结果显示病毒只在蚊虫细胞中有增殖,在哺乳动物细胞中无生长。NDiV对C6/36细胞有明显的病变效应,C6/36细胞是NDiV的敏感细胞;经C6/36细胞50%终点法计算得出NDiV病毒滴度为:1.41×106PFU/ml。乳鼠、鸡胚和雏鸡的不同部位经不同剂量的NDiV染毒后,没有出现明显的发病情况。通过多次的优化试验首次建立了NDiV MGB探针RT-PCR的检测方法。该检测方法用时短,灵敏度高,最低检测下限为1PFU/ml。该方法有良好的特异性,与登革热1-4血清型病毒、流行性乙型脑炎病毒、轮状病毒、人呼吸道合胞病毒、腺病毒、星状病毒无交叉反应;4份核酸含量不同的NDiV标准品重复测5次,Ct值的变异系数范围在1.67%.68%,有较高的稳定性。通过检测,龙岗区蚊虫NDiV携带率为18%,以居民区、医院和场馆的蚊虫携带NDiV比例最高,分别为22%、25%、31%。其它区域蚊虫携带NDiV比例较低。结论C6/36细胞是NDiV感染的敏感细胞,NDiV在C6/36细胞能产生病变效应,但病毒在哺乳类动物细胞未见增殖。通过实验观察发现,NDiV对乳鼠及鸡胚没有明显的致病作用。NDiV的TaqMan-MGB探针RT-PCR方法是一种特异、快速、灵敏高及稳定性好的方法,可应用于NDiV的流行病学监测工作,提高该病毒的快速检测的能力。

关键词： TaqMan-MGB nam dinh病毒致病性 50%终点法

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