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作者：贾克利河南师范大学

学位级别：硕士

在植物中,质体DNA向核基因组的转移是一种普遍的遗传物质水平转移现象,转移到核基因组的质体DNA称为核质体DNA(Nuclear plastid DNA,nupts),nupts在核基因组中的插入可以引起核基因组变异及染色体结构重排,是基因组及染色体组演化的重... 详细信息

在植物中,质体DNA向核基因组的转移是一种普遍的遗传物质水平转移现象,转移到核基因组的质体DNA称为核质体DNA(Nuclear plastid DNA,nupts),nupts在核基因组中的插入可以引起核基因组变异及染色体结构重排,是基因组及染色体组演化的重要推动因素之一。石刁柏(Asparagus officinalis)为雌雄异株经济作物,具有2n=20条染色体,同型XY性染色体决定性别,其染色体组处于演化的不稳定阶段。但是哪些因素引起了石刁柏染色体组的不稳定尚不清楚。因此,本文利用生物信息学及分子细胞遗传学技术对石刁柏核基因组中的nupts进行注释及分析,对包括Y染色体在内的不同染色体上的nupts分布模式进行中期染色体定位。主要结果如下:1、生物信息学分析表明,石刁柏核基因组中共有2,239个nupts序列的插入,总长度为565,970 bp,占核基因组的0.047%。nupts在不同染色体上的插入长度不同,Y染色体插入平均长度最长,显著高于其他染色体,每Mb基因组中有778 bp的nupts序列,且存在一个插入热点区域。其次,不同染色体上插入的nupts数量也存在较大差异,Y染色体上的nupts数量最多,每100 Mb基因组中有272个nupts,这说明NUTPs在石刁柏Y染色体上具有更多的累积。同一染色体上nupts的插入位置是不均匀的。对10条染色体上基因密度、nupts长度和转座子长度的共定位模式分析表明,石刁柏基因组中nupts和转座子存在显著的共定位关系,2,239个nupts中有1,690个nupts侧翼序列为转座子序列,比例达到75.5%,显著高于随机序列和转座子共定位的比例(51.6%)。对nupts的叶绿体基因组来源分析表明,石刁柏叶绿体基因组中的反向重复区(Inverted repeat,IR)、短单拷贝区(Small single copy,SSC)和长单拷贝区(Large single copy,LSC)均能够向核基因组转移,但是转移的频率不同,IR、LSC和SSC区来源的nupts频率分别为27.9个/Kb、14.6个/Kb和15.9个/Kb,这说明IR区序列更容易向核基因组转移。2、为了对nupts在染色体上的位置进行定位,我们将叶绿体基因组进行按照约每4,000 bp为一序列单元进行扩增,将回收纯化的序列进行中期染色体荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)。结果表明,共28个探针序列中有23个探针获得稳定的中期染色体FISH杂交信号。其中LSC区来源的15个;IR区来源的6个;SSC区来源的2个。nupts在染色体上的分布位置存在三种模式,其中4个序列定位于着丝粒及着丝粒侧翼区,12个序列在染色体上弥散分布,7个序列特异分布于某特定染色体。根据nupts序列的来源来看,LSC和SSC区来源序列主要定位于染色体臂和着丝粒位置,IR区序列主要定位于染色体的着丝粒位置。更为重要的是,我们获得了3个Y染色体特异的nupts序列,主要定位于Y染色体的着丝粒区,这也说明nupts的插入可能参与了石刁柏性染色体的演化过程。

关键词：石刁柏叶绿体基因组 nupts FISH 性染色体

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菠菜雄性偏向nupts的分离与染色体定位

菠菜雄性偏向NUPTs的分离与染色体定位

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作者：黄莹莹河南师范大学

学位级别：硕士

菠菜(*** L.)是藜科(Chenopodiaceae)菠菜属(Spinacia)一年生或两年生草本植物,是一种广泛种植的雌雄异株的经济作物。菠菜基因组大小为989Mbp,染色体组型为2n=12,具有XY异型染色体。菠菜的性染色为1号染色体,处于性染色体演化的较早期... 详细信息

菠菜(*** L.)是藜科(Chenopodiaceae)菠菜属(Spinacia)一年生或两年生草本植物,是一种广泛种植的雌雄异株的经济作物。菠菜基因组大小为989Mbp,染色体组型为2n=12,具有XY异型染色体。菠菜的性染色为1号染色体,处于性染色体演化的较早期阶段。由于菠菜的生长周期短,易于繁殖,染色体数目少,因此是研究植物性别分化和性染色体演化的理想材料。细胞器DNA片段转移到核基因组中是真核生物中普遍发生的现象。在高等植物中,质体DNA转移并整合到核基因组中会形成核质体DNA(nuclear plastid DNA,nupts)。最新的研究发现nupts在雌雄异株的白麦瓶草的Y染色体上特异性的累积,说明nupts可能和性染色体的起源和演化具有一定的联系。但是,nupts的这种性染色体的累积是否是普通现象,如果是,又是如何参与性染色体的起源和演化的等问题仍不清楚。鉴于此,本研究以菠菜为实验材料,利用基因组消减杂交技术筛选分离菠菜雌雄基因组差异的nupts序列,根据菠菜叶绿体基因组数据获得长片段nupts序列并利用染色体荧光原位杂交技术进行了验证和染色体定位分析,为探讨菠菜叶绿体基因组向核基因组转移的研究和染色体演化的研究提供数据资料。主要研究结果如下:(1)构建了菠菜的消减杂交文库,从文库中挑选出4706个单菌落进行菌落PCR,再对筛选出来的阳性克隆进行斑点杂交验证。共得到39条雄性特异的有效序列,所得到的序列平均长度约为154 bp,最长的为308 bp,最短为75 bp。对获得的序列进行Blastn同源比对分析发现,有23条有同源比对结果,其中有12条序列与叶绿体有关,与菠菜叶绿体基因组相似度在98%以上。另有16条为新序列。(2)将筛选出的与叶绿体有关的序列进行设计引物和PCR验证,最终得到两条雌雄基因组差异序列(分别命名为sp5和sp8),其长度为分别为146bp和199bp。将sp5和sp8和NCBI数据库中菠菜叶绿体基因组数据进行相似性比对,并根据目的序列所在位置两侧序列设计引物进行sp5和sp8长片段扩增,获得了长度分别为3706 bp和2391 bp的长序列(分别命名为sp5-L和sp8-L)。基因组半定量PCR分析发现,两条nupts序列在菠菜的雌雄基因组上有明显的差异,表现出雄性偏好,说明所获得的两个nupts序列在雄性基因组中有更多的积累。(3)为了进一步分析sp5-L和sp8-L在染色体上的位置分布特点,利用染色体原位杂交技术对其进行了中期染色体定位。结果发现,sp5-L和sp8-L在菠菜的所有染色体上都有稳定的信号。通过核型和带型分析,发现两个nupts序列的杂交信号主要分布于染色体的着丝粒侧翼区域。其中性染色体上杂交信号最强。XY染色体的杂交信号比较表明,Y染色体上的信号强度高于X染色体,说明sp5-L和sp8-L的分布具有雄性偏好的特点。

关键词：菠菜 nupts 染色体荧光原位杂交

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石刁柏核质体DNA的生物信息学分析及染色体定位

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植物学报 2019年第3期54卷 328-334页

作者：程广前贾克利李娜邓传良李书粉高武军河南师范大学生命科学学院新乡453007 新乡医学院三全学院新乡453003

在植物基因组中,叶绿体DNA(cpDNA)序列可以向核基因组转移成为核质体DNA(NUPT)。nupts在植物染色体(包括性染色体)的演化过程中具有重要作用,但目前相关研究比较缺乏。以雌雄异株植物石刁柏(Asparagus officinalis)为材料,采用生物信息... 详细信息

在植物基因组中,叶绿体DNA(cpDNA)序列可以向核基因组转移成为核质体DNA(NUPT)。nupts在植物染色体(包括性染色体)的演化过程中具有重要作用,但目前相关研究比较缺乏。以雌雄异株植物石刁柏(Asparagus officinalis)为材料,采用生物信息学方法对其核基因组nupts进行注释及分析,并选取叶绿体基因组反向重复区(IR)2个片段进行染色体定位。结果表明,石刁柏核基因组中有2239个nupts序列的插入,总长度为565970bp,占核基因组的0.047%。不同染色体上插入的nupts数量存在较大差异,Y染色体上的nupts数量、密度及总长度均高于其它染色体,表明nupts在石刁柏性(Y)染色体上累积的更多。石刁柏叶绿体基因组中的IR区、大单拷贝区(LSC)和小单拷贝区(SSC)序列均能够向核基因组转移,但IR区序列转移频率更高。此外,对2个IR区的叶绿体序列进行荧光原位杂交,其中AocpIR1主要分布在所有染色体的着丝粒部位,而AocpIR2特异性分布在Y染色体上。研究结果为深入揭示石刁柏基因组的结构及其性染色体的演化奠定了坚实的基础。

关键词：石刁柏生物信息学分析核质体DNA nupts 性染色体

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基于基因组消减杂交技术的石刁柏性别差异重复序列的克隆与定位

基于基因组消减杂交技术的石刁柏性别差异重复序列的克隆与定位

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作者：李仲夏河南师范大学

学位级别：硕士

石刁柏(Asparagus officinalis)又名芦笋,是一种多年生雌雄异株草本植物,其单倍体基因组大小为1323 Mbp,具有2n=2X=20条染色体,其性染色体组成为同型XY型性染色体,在性染色体演化仍处于早期阶段,能更有利于进行植物性染色体起源和演化... 详细信息

石刁柏(Asparagus officinalis)又名芦笋,是一种多年生雌雄异株草本植物,其单倍体基因组大小为1323 Mbp,具有2n=2X=20条染色体,其性染色体组成为同型XY型性染色体,在性染色体演化仍处于早期阶段,能更有利于进行植物性染色体起源和演化机制的研究。目前研究表明,植物XY性染色体起源于一对常染色体,其中的一条由于某种未知原因而累积了反转座子等重复序列而在体积上逐步扩展,进而从形态上逐渐演化为异型的XY性染色体。但是,重复序列的累积是否是性染色体体积扩展的普遍现象,是否参与了性染色体早期的演化过程等问题仍不清楚。因此,本文以石刁柏为材料,利用基因组消减杂交技术及生物信息学技术分离分析雌雄基因组差异重复序列,并采用中期染色体荧光原位杂交技术对获得的性别差异序列进行染色体定位,分析重复序列在性染色体起源和演化过程中可能的作用。为揭示石刁柏性染色体起源及演化的机制提供理论资料。主要研究结果如下:1、以石刁柏雌雄基因组DNA为材料,利用通用引物M13对石刁柏6600个消减杂交克隆产物进行筛选,通过斑点杂交验证后获得98个雌雄差异序列。对测序成功的52条序列分析发现,所获得的序列长度分布在63bp-297bp。其中,33个属于非叶绿体基因组来源序列(命名为Ao1-Ao33),包括3个反转录转座子,15个未命名序列,6个mRNA序列,9个其他序列。另外,19个序列属于叶绿体来源序列(命名为Ao34-Ao52),Ao34-Ao50在核酸数据库中均有同源序列,相似度分布在84%-100%,Ao51相似度最低为37%。Ao52序列在数据库中未发现同源序列,其序列与石刁柏叶绿体基因组相似性为100%。为了进一步验证52个序列是否为性别差异的序列,利用基因组半定量技术对52个斑点杂交验证的差异序列进行分析。结果表明,其中9条差异序列为雌雄差异序列,包含5条为非叶绿体来源序列(分别为Ao6、Ao13、Ao15、Ao19、Ao29)。4条为叶绿体基因组来源序列(分别为Ao34、Ao36、Ao43、Ao51),序列定位发现转移到核基因组的核叶绿体序列(nuclear integrants of plastid DNA,nupts)主要分布在叶绿体基因组的反向重复区(inverted repeat,IR)(包含IRa和IRb区)(分别为Ao34、Ao36、Ao43)。说明叶绿体反向重复区序列更容易向核基因组进行转移,这可能和该区域序列高拷贝数有关。2、为了对所获得的性别差异序列进行染色体定位,将5条非叶绿体来源的差异序列从基因组中进行长片段扩增。其中,Ao6和Ao15两个序列成功获得长度分别为3048bp和528bp的长序列(分别命名为Ao6-L和Ao15-L)。中期染色体荧光原位杂交结果表明,Ao6-L序列在所有染色体着丝粒上有杂交信号,且在着丝粒上的信号强烈而明显。Ao15-L序列在所有染色体上均有杂交信号,且信号集中在着丝粒及其附近,距离着丝粒越近信号越强。由此可以得出差异重复序列在着丝粒位置富集最多。石刁柏染色体着丝粒含有大量重复序列,才使杂交信号在着丝粒及其附近堆积。3、为了对所获得的叶绿体来源的序列进行染色体定位,首先根据石刁柏叶绿体基因组序列设计引物进行长序列扩增,其中,Ao52序列成功获得长度为2859bp(命名为Ao52-L)。中期染色体定位发现,Ao52-L序列在所有染色体上均有杂交信号,且信号从端粒到着丝粒呈现逐渐加强的特征,说明该nupts序列在着丝粒位置富集最多,这和水稻中期染色体nupts的分布特征相一致。其次,着丝粒位置本身存在较多重复序列,也进一步说明了从叶绿体转移到核基因组的序列也是组成着丝粒侧翼重复序列的重要成分之一。石刁柏叶绿体序列在核基因组中的插入,删除,以及重排是在新型核基因的产生的重要进化过程。

关键词：石刁柏性别差异重复序列 nupts 性染色体演化基因组消减杂交

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