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神经干细胞联合nt-3基因修饰嗅鞘细胞移植对大鼠脑损伤后的修复作用

神经干细胞联合NT-3基因修饰嗅鞘细胞移植对大鼠脑损伤后的修复作...

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作者：闫耀宗新乡医学院

学位级别：硕士

背景创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是严重的中枢神经系统创伤性疾病,具有发病率高、致残率高及死亡率高等特点。而损伤后期患者常遗留难治性的神经功能障碍。近年来,细胞移植为神经损伤后修复提供了一种治疗策略。神经干... 详细信息

背景创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是严重的中枢神经系统创伤性疾病,具有发病率高、致残率高及死亡率高等特点。而损伤后期患者常遗留难治性的神经功能障碍。近年来,细胞移植为神经损伤后修复提供了一种治疗策略。神经干细胞(Neural stem cell,NSCs)是具有自我更新和分化等能力的细胞,移植后能在损伤部位存活、分化并替代受损或凋亡的神经元。嗅鞘细胞(Olfactory ensheathing cell,OECs)是存在于嗅觉系统中具备终生再生分裂能力的细胞,可分泌多种神经营养因子,有助于受损的轴突生长以及髓鞘再生。神经营养因子-3(Neurotrophin-3,nt-3)能促进轴突的分化和延伸,具有抗凋亡,介导细胞存活,并在神经损伤后的修复过程中诱导干细胞向神经元方向分化的能力。目的本研究构建nt-3基因修饰的嗅鞘细胞(OECs-nt-3),并对TBI模型大鼠进行NSCs和OECs-nt-3的联合移植,探讨NSCs联合OECs-nt-3对TBI的神经修复的作用。方法1.原代培养OECs与NSCs并行细胞鉴定。***-3基因修饰的OECs的构建:取适量OECs接种至6孔板中。将含有nt-3基因的慢病毒载体原液(1×10 TU/ml)以MOI值100,10,1,0与培养基混合稀释后,换入病毒梯度稀释液。24 h后更换新鲜培养基,于48 h后在荧光显微镜下观察浸染效果。并收集各组转染后2 d、7 d、14 d、28 d的细胞培养上清液,ELISA法检测nt-3含量。3.实验分组:50只2月龄雄性SD大鼠,体重(200±20)g,随机分为5组:假手术组(A组)、模型组(B组)、NSCs移植组(C组)、OECs-nt-3移植组(D组)、OECs-nt-3联合NSCs移植组(E组),每组10只大鼠。4.大鼠颅脑损伤模型制作及细胞移植:参考改良的Feeney’s方法,制作TBI模型。在造模成功第3天给予细胞移植,注射前将NSCs细胞与5-溴脱氧尿嘧啶BrdU(10μmol/L)共培养72 h。5.大鼠神经功能缺损严重程度评分:移植后1 d、7 d、14 d和28 d,对各组大鼠进行大鼠神经功能缺损评分(neurological severity scores,NSS),以判断大鼠脑功能损害程度,分值越低神经功能越好。***染色及细胞密度计算:行苏木精染色和伊红染色,封片后镜下观察细胞形态与组织结构,并计算细胞密度。7.免疫组织化学:行P75及BrdU抗体免疫组织化学染色,观察NSCs与OECs存活情况和分布位置。***细胞凋亡检测:检测损伤灶中细胞凋亡情况,并计算细胞凋亡指数。9.统计学方法:应用SPSS 21.0统计软件分析,计量资料用均值±标准差(Mean±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P细胞免疫荧光染色,证实嗅球原代培养的细胞为OECs。行Nestin抗体的细胞免疫荧光染色及神经干细胞诱导分化试验,证实海马体原代培养的细胞为NSCs。2.慢病毒转染48 h后,于荧光显微镜下观察OECs转染效果。ELISA结果:MOI为10的转染组培养基中nt-3含量高于其他各组,且可持续分泌到转染后28 d。3.大鼠神经系统严重程度评分:细胞联合治疗组中大鼠运动功能恢复较明显,具体表现为:平衡木试验停留时间大于40 s或姿态稳定不跌落、提尾试验中肢体屈曲情况恢复、行走步态趋于稳定或可恢复行走直线,不正常运动消失等。NSS评分结果:在移植28 d,联合组评分与模型组、OECs-nt-3组和NSCs组比较,差异有统计学意义(P细胞。联合组损伤灶细胞密度较模型组、OECs-nt-3组、NSCs组显著提高,差异有统计学意义(P细胞治疗组中看到P75及BrdU阳性染色结果,提示两种移植细胞能持续存活且广泛分布在损伤灶周围。6.大鼠脑组织细胞凋亡测定:移植7 d,联合组与模型组、OECs-nt-3组、NSCs组比较,脑损伤灶中细胞凋亡指数降低,差异有统计学意义(Pnt-3基因的慢病毒载体转染后可持续稳定分泌nt-3。***和OECs-nt-3移植到TBI模型大鼠的损伤灶处后可长期存活并在损伤边缘聚集,促进大鼠神经运动功能的恢复。3.两种细胞的联合移植可进一步减轻大鼠脑损伤后的脑组织细胞凋亡,明显提高损伤部位的细胞数量,对神经运动功能的恢复具有显

关键词：创伤性颅脑损伤神经干细胞联合移植 nt-3基因修饰的嗅鞘细胞

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