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Surface Display of Rice Stripe Virus nsvc2 and Analysis of Its Membrane Fusion Activity

Virologica Sinica 2012年第2期27卷 100-108页

作者： Shu-ling Zhao Xue-juan Dai Jian-sheng Liang Chang-yong Liang College of Bioscience and Biotechnology Yangzhou UniversityYangzhou 225009China

Rice stripe virus (RSV) infects rice and is transmitted in a propagative manner by the small brown planthopper. How RSV enters an insect cell to initiate the infection cycle is poorly understood. Sequence analysis revealed that the RSV nsvc2 protein was similar to the membrane glycoproteins of several members in the family Bunyaviridae and might induce cell membrane fusion. To conveniently study the membrane fusion activity of nsvc2, we constructed cell surface display vectors for expressing nsvc2 on the insect cell surface as the membrane glycoproteins of the enveloped viruses. Our results showed that nsvc2 was successfully expressed and displayed on the surface of insect Sf9 cells. When induced by low pH, the membrane fusion was not observed in the cells that expressed nsvc2. Additionally, the membrane fusion was also not detected when co-expressing nsvc2 and the viral capsid protein on insect cell surface. Thus, RSV nsvc2 is probably different from the phlebovirus counterparts, which could suggest different functions. RSV might enter insect cells other than by fusion with plasma or endosome membrane.

关键词： Rice stripe virus nsvc2 Surface display Membrane fusion

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水稻条纹病毒nsvc2-N与nsvc2-C蛋白互作的研究

水稻条纹病毒NSvc2-N与NSvc2-C蛋白互作的研究

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作者：侯艳玲扬州大学

学位级别：硕士

水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)是最重要的水稻病毒之一,可引起水稻条纹叶枯病,给水稻生产造成了严重的损失。该病毒主要由介体灰飞虱(Laodelphax steiatellus)以循回增殖的方式传播,灰飞虱一旦染毒可以持久传毒,并且可经卵传递... 详细信息

水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)是最重要的水稻病毒之一,可引起水稻条纹叶枯病,给水稻生产造成了严重的损失。该病毒主要由介体灰飞虱(Laodelphax steiatellus)以循回增殖的方式传播,灰飞虱一旦染毒可以持久传毒,并且可经卵传递给下一代幼虫,因此给防治工作带来了困难。RSV隶属于纤细病毒属(Tenuivius),是该属的典型成员,其基因组由4条单链RNA组成,共编码7种蛋白质。其中nsvc2蛋白由RSV RNA2的反义链编码,分子量为94kDa。因为nsvc2蛋白分子量比较大,翻译后要经历复杂的修饰过程,并且可能具细胞毒性,因此造成了它的研究困难。相对RSV编码的其它蛋白,nsvc2相关的研究工作开展较少。nsvc2蛋白可以在病株和灰飞虱中检测到,暗示nsvc2蛋白可能在介导病毒传播及诱导宿主植物症状的发生中起作用,是一个重要的多功能蛋白。另外,我们前期的研究结果表明nsvc2蛋白在宿主细胞中被切割成两部分(nsvc2-N和nsvc2-C),这两部分之间可能存在互作。基于前期的研究结果,本文对nsvc2-N和nsvc2-C间的互作展开研究,从而为深入研究nsvc2蛋白的结构、在病毒侵染、致病及传播过程中所起的作用奠定基础,为控制病害的发生提供一定理论依据。本文第一章以综述的形式论述了RSV的研究概况,包括其危害、分类、基因组结构及其编码蛋白的功能。另外,简单介绍了本实验所用到的几种实验技术,如：酵母双杂交、荧光共振能量转移等技术的原理及其优缺点。另外,还介绍了利用杆状病毒AcMNPV作为人类干细胞基因治疗载体的相关内容,对杆状病毒的结构和功能及杆状病毒表达载体系统的相关技术进行了简单介绍。第二章利用酵母双杂交系统来验证nsvc2-N和nsvc2-C蛋白间的互作。构建分别含编码nsvc2-N和nsvc2-C基因片段的酵母双杂交载体,进而验证两者间的互作。结果显示,含nsvc2-N和nsvc2-C基因片段的酵母在含有X-a-gal四缺培养基上出现了明显的蓝斑,表明nsvc2-N和nsvc2-C蛋白间存在互作。第三章利用荧光共振能量转移技术来进一步验证nsvc2-N和nsvc2-C蛋白间的互作。通过原核表达载体成功构建出nsvc2蛋白的N端和C的一些片段,将其导入昆虫Sf9细胞中,利用共聚焦显微镜来观察它们之间的相互作用,发现它们之间发生了FRET,表明存在相互作用。第四章利用杆状病毒AcMNPV载体将绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein, GFP)和人生长因子(Human growth factor, HGF)基因转入兔子骨髓间充质干细胞(BMSCs)中表达。PCR扩增eGFP和HGF基因片段,克隆于原核表达载体得到重组质粒pFast-Tet-egfp和pFast-Tet-hgf,利用Bac-to-Bac系统获得Ac-eGFP和Ac-HGF Bacmid DNA,将其转染昆虫Sf9细胞获得重组的杆状病毒vAcrtTA2-Ptight-GFP和vAcrtTA2-Ptight-HGF。第五章对本文进行了总结和分析。综上所述,本论文对RSV nsvc2-N和nsvc2-C蛋白间互作用进行了研究,证明了两者间的互作。通过nsvc2蛋白N端和C端间的互作研究可明确nsvc2的结构,也为进一步研究nsvc2蛋白的功能、阐明病毒的侵染机理和传播机制奠定基础。本文还成功构建了杆状病毒表达载体系统,为基因治疗奠定了基础。

关键词： RSV nsvc2 酵母双杂交系统荧光共振能量转移蛋白相互作用基因治疗

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