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Sequence-and structure-selective m RNA m5C methylation by nsun6 in animals

National Science Review 2021年第6期8卷 136-147页

作者： Jianheng Liu Tao Huang Yusen Zhang Tianxuan Zhao Xueni Zhao Wanying Chen Rui Zhang MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation State Key Laboratory of BiocontrolSchool of Life SciencesRNA Biomedical InstituteSun Yat-Sen Memorial HospitalSun Yat-Sen University

mRNA m5C,which has recently been implicated in the regulation of mRNA mobility,metabolism and translation,plays important regulatory roles in various biological *** types of m5C sites are found in *** Ⅰ m5C sites,which contain a downstream G-rich triplet motif and are computationally predicted to be located at the 5' end of putative hairpin structures,are methylated by *** Ⅱ m5C sites contain a downstream UCCA motif and are computationally predicted to be located in the loops of putative hairpin ***,their biogenesis remains *** we identified nsun6,a methyltransferase that is known to methylate C72 of tRNAThrand tRNACys,as an mRNA methyltransferase that targets Type Ⅱ m5C *** the RNA secondary structure prediction,miCLIP,and results from a high-throughput mutagenesis analysis,we determined the RNA sequence and structural features governing the specificity of nsun6-mediated mRNA *** these features into an nsun6-RNA structural model,we identified an nsun6 variant that largely loses tRNA methylation but retains mRNA methylation ***,we revealed a weak negative correlation between m5C methylation and translation *** findings uncover that mRNA m5C is tightly controlled by an elaborate two-enzyme system,and the protein-RNA structure analysis strategy established maybe applied to other RNA modification writers to distinguish the functions of different RNA substrates of a writer protein.

关键词： mRNAm5C nsun6 RNA modification protein-RNA complex structure

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nsun6抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖的差异基因和信号通路筛选以及抑制增殖的作用研究

NSUN6抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖的差异基因和信号通路筛选以及...

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作者：骆慧中国医科大学

学位级别：硕士

目的:甲状腺癌的发病率在近十几年来呈现逐年上升态势,其中有75%-85%被确诊为甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Cancer,PTC）。鉴于前期生物信息学分析结果发现nsun6在甲状腺乳头状癌中呈现差异性表达,即癌组织中表达显著低于癌旁组织... 详细信息

目的:甲状腺癌的发病率在近十几年来呈现逐年上升态势,其中有75%-85%被确诊为甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Cancer,PTC）。鉴于前期生物信息学分析结果发现nsun6在甲状腺乳头状癌中呈现差异性表达,即癌组织中表达显著低于癌旁组织,因此猜想nsun6对甲状腺乳头状癌的增殖可能具有抑制作用。本课题旨在研究RNA甲基转移酶nsun6对甲状腺乳头状癌增殖的抑制作用,并筛选与nsun6抑制甲状腺乳头状癌增殖作用相关的基因或信号通路,为接下来深入研究nsun6的作用机制提供新的思路,也为未来治疗甲状腺乳头状癌提供新的方向。方法:首先利用在线生物信息学工具Oncomine、TIMER 2.0、Kaplan-Meier Plotter、GEPIA、Prognoscan以及UALCAN对nsun6进行多个癌症类型中的单基因和预后分析,了解它在不同类型癌症中的作用差异,并就本课题研究对象甲状腺癌进行重点分析。从TCGA数据库（https://***/,2022年11月9日访问）下载甲状腺乳头状癌的m RNA表达谱文件,一共包含397例样本,运用R软件（版本:4.1.0）分析并筛选nsun6在甲状腺乳头状癌中作用相关的差异性表达的基因和信号通路。运用免疫组化染色对从中国医科大学附属第四医院病理科取得的甲状腺乳头状癌及正常甲状腺组织中的nsun6表达进行检测,由于免疫组化染色常用Ki67细胞比率高低体现肿瘤细胞增殖能力强弱,所以分析nsun6的表达与Ki67细胞比率的相关性。首先利用Western Blot检测正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1以及乳头状癌细胞系BCPAP和K1当中nsun6的蛋白表达水平证实nsun6的差异性表达。运用质粒转染技术对甲状腺乳头状癌的两种细胞系BCPAP及K1分别进行nsun6的过表达和敲除,通过q RT-PCR验证并筛选出对目的基因敲除作用最强的质粒,Western Blot验证目的基因的过表达和敲除。利用质粒转染对增殖情况不同的癌细胞系分别做nsun6的过表达和敲除,CCK8法检测过表达和敲除nsun6后的细胞与对照组之间存活率是否有差异。通过Ed U增殖检测过表达和敲除目的基因后癌细胞的增殖率是否有明显改变。结果:生物信息学在线工具综合分析结果显示,nsun6在不同类型癌症中的表达和对预后的影响是有差异的（图2）。nsun6在甲状腺癌组织中的表达显著低于正常癌旁组织（图1B,图3A-C）;nsun6表达越高,甲状腺癌患者的无病生存率（DFS）越高（图2A）。R语言分析甲状腺乳头状癌的m RNA表达谱筛选出与nsun6调控甲状腺癌增殖作用相关的显著上调的基因有16个,分别为TPO、PKNOX2、EDN3、DIO1、KCNAB1、FAM167A、FHL1、CA4、BMP8A、DUOX2、SLC26A7、KIT、FOSB、VEGFA、WSCD2、TFF3,显著下调的基因有4个,分别是CHI3L1、LCN2、SLC34A2、SFTPB。通路富集结果显示,最显著富集的5个上调通路分别是甲状腺激素合成（Thyroid hormone synthesis）、单纯疱疹病毒1感染（Herpes simplex virus 1 infection）、Rap1信号通路（Rap1 signaling pathway）、吗啡成瘾（Morphine addiction）、基底细胞癌（Basal cell carcinoma）;5个下调通路分别是类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis）、细胞粘附分子（Cell adhesion molecules）、吞噬小体（Phagosome）、人T细胞白血病病毒1感染（Human T-cell leukemia virus 1infection）和细胞因子间受体反应（Cytokine-cytokine receptor interaction）。此外,与甲状腺有关的显著富集通路共计3个,包括甲状腺激素合成（Thyroid hormone synthesis）、甲状腺激素信号通路（thyroid hormone signaling pathway）和自身免疫性甲状腺疾病（Autoimmune thyroid disease）。免疫组化结果提示nsun6在正常组织中的表达高于乳头状癌,nsun6表达较低的癌组织样本对应Ki67比率更高,细胞增殖能力更强。WB提示nsun6在正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1中的表达显著高于乳头状癌细胞系BCPAP和K1。CCK8结果提示,nsun6敲除的PTC细胞系BCPAP和K1存活率更高,过表达nsun6的相应细胞系的细胞存活率更低,可以证明增强nsun6的表达可抑制PTC细胞系

关键词： nsun6 甲状腺乳头状癌增殖差异基因通路富集分析

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RNA m5C甲基化调控基因对皮肤黑素瘤进展和临床预后的影响

RNA m5C甲基化调控基因对皮肤黑素瘤进展和临床预后的影响

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作者：黄茂欣郑州大学

学位级别：硕士

研究背景皮肤黑素瘤(cutaneous malignant melanoma,CMM)是发生于皮肤黑素细胞的恶性肿瘤,进展较快,恶性程度较高,预后取决于临床类型和肿瘤分期。流行病学调查指出,近年其发病率和死亡率快速上升。全球癌症统计报告显示,2020年全球将近... 详细信息

研究背景皮肤黑素瘤(cutaneous malignant melanoma,CMM)是发生于皮肤黑素细胞的恶性肿瘤,进展较快,恶性程度较高,预后取决于临床类型和肿瘤分期。流行病学调查指出,近年其发病率和死亡率快速上升。全球癌症统计报告显示,2020年全球将近有324,635例新发病例以及57,043例死亡病例。CMM致死性较高,占皮肤相关恶性肿瘤的65%。目前常用的治疗方法为手术治疗和放化疗,近年来靶向治疗和免疫治疗技术的应用也明显改善了患者的预后,但整体效果仍不理想。晚期CMM患者的中位生存期约为9个月,5年生存期不足30%。因此,探索CMM浸润转移的潜在机理、寻找潜在的诊断和预后生物学标志物、发现新型有效的药物靶点,具有重要的临床意义和科学价值。RNA 5-甲基胞嘧啶(RNA5-methylcytosine,RNA m5C)修饰是一种常见的RNA转录后修饰模式,能够调控细胞内mRNA转运、翻译和剪切过程,同时也能调控核糖体RNA、转运RNA、线粒体RNA、非编码RNA甚至病毒RNA的转录后加工、基因表达和控制蛋白质合成。RNA m5C修饰主要受三种酶的调控,包括写入蛋白(methyltransferase,writers),擦除蛋白(demethylases,eraser)和识别蛋白(reader)。RNA m5C写入蛋白主要包括NOP2/Sun RNA甲基转移酶1-7(NOP2/Sun RNA methyltransferase 1-7,nsun1-7)和人类同源DNA甲基转移酶 1/2/3A/3B蛋白(DNA methyltransferase 1/2/3A/3B,DNMT1/2/3A/3B)。m5C 阅读蛋白包括Aly/REF外运因子(Aly/REF export factor,ALYREF)和Y盒结合蛋白 1(Y box binding protein 1,YBX1)。m5C去甲基化酶主要包括10-11易位蛋白1-3(Tet methylcytosine dioxygenase 1-3,TET1-3)。RNA m5C修饰与一系列生理病理进程密切相关。研究显示,RNA m5C修饰在胚胎形成、器官发育、神经系统发育、干细胞自我更新、细胞增殖和衰老等生命进程中发挥关键作用。同时RNA m5C修饰的失调和能量代谢相关疾病、感染性疾病、小头畸形、软骨内骨化延迟和神经系统疾病等病理进程密切相关。在人类恶性肿瘤性疾病中,RNA m5C修饰调控基因异常与白血病、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、肝细胞癌和妇科肿瘤等恶性肿瘤进展密切相关。此外,有研究提示RNA m5C修饰调节基因nsun2表达的失调与鳞状细胞癌和基底细胞癌的进展密切相关,但RNA m5C修饰在皮肤黑素瘤中的作用尚不清楚,亟待进一步研究。目的根据肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)的公共数据库信息,系统分析RNA m5C调节基因在皮肤黑素瘤中的变异情况和预后价值;其次,识别皮肤黑素瘤RNA m5C修饰亚型并探索其临床价值;进一步构建RNA m5C调节基因的预后风险评分模型并进行外部验证;最后,采用机器学习联合皮肤黑素瘤组织芯片队列筛选皮肤黑素瘤RNA m5C调节基因风险评分模型中起关键作用的调节基因,并进行验证。材料与方法1.整合TCGA和GEO数据库中皮肤黑素瘤的表达谱数据信息,分析RNA m5C中16个基因调节蛋白与mRNA在皮肤黑素瘤组织和癌旁组织中的表达差异,利用生物信息学方法,探讨RNA m5C中16个调节基因在皮肤黑素瘤体细胞突变、拷贝数变异和预后价值。2.利用TCGA中皮肤黑素瘤的表达谱数据信息,对RNA m5C中16个调节基因的表达进行非共识聚类分析,鉴定RNA m5C基因表达聚类亚型(m5C cluster),并分析其在皮肤黑素瘤中的预后、临床和通路富集特征。3.以TCGA-SKCM为训练集、GSE65904为验证集,运用LASSO回归模型构建RNA m5C调节基因预后风险评分模型,生存分析探索模型的预后价值,单因素、多因素Cox回归分析验证RNA m5C调节基因预后风险评分模型在皮肤黑素瘤预后危险因素中的价值。差异分析和卡方分析判定RNA m5C调节基因预后风险评分与皮肤黑素瘤临床进展中的作用。4.运用集成学习算法(eXtreme Gradient Boosting,XG-boot)机器学习,筛选RNA m5C中16个调节基因对预后风险模型影响最大的基因。免疫组织化学染色验证其蛋白在皮肤黑素瘤癌和癌旁组织中的表达,并探讨表达水平和临床病理分级之间的相关关系。结果1.皮肤黑素瘤组织与癌旁组织相比,NOP2、nsun2、YBX1、DNMT3A、N

关键词： RNA 5-甲基胞嘧啶修饰皮肤恶性黑素瘤预后风险评分模型 nsun6

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