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云南高致病性PRRSV nsp2和ORF5基因变异分析

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动物医学进展 2010年第11期31卷 15-22页

作者：杨利琴庞海洋石凤海张文东赵焕云吕粤岳亮张富强张应国云南农业大学云南昆明650203 昆明正大动保中心云南昆明650071 临沧市动物疫病预防控制中心云南临沧677000 云南省动物疫病预防控制中心云南昆明650051 成都军区疾病预防控制中心云南昆明650032

为研究云南省高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异特征,采用RT-PCR对云南省2007年-2008年采集的56份猪组织样品中PRRSV nsp2、ORF5基因进行检测,获得阳性样品12份,选择6份代表性样品将其PCR产物纯化后,克隆至pMD18-T载体后测序,... 详细信息

为研究云南省高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异特征,采用RT-PCR对云南省2007年-2008年采集的56份猪组织样品中PRRSV nsp2、ORF5基因进行检测,获得阳性样品12份,选择6份代表性样品将其PCR产物纯化后,克隆至pMD18-T载体后测序,并与已知代表毒株进行序列比对及系统发育分析。分离株nsp2基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为94.9%～97.2%和91.4%～95.7%,其中1份样品(07YNMG)在486位～489位氨基酸发生了缺失。在系统进化树上可将其划分为4个亚组群,分离株分别与广东、贵州、浙江、山东等地分离毒株遗传关系密切。ORF5基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为97.8%～99.5%和97.0%～99.5%。氨基酸序列未发现缺失,仅个别位点发生点突变。系统进化树分析表明,分离株与浙江、贵州、广东、云南株亲缘关系较近,而与国内疫苗株以及PRRSV经典代表毒株CH-1a距离较远。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp2基因 ORF5基因变异分析

PRRSV安徽分离株nsp2和ORF7基因的克隆与序列分析

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动物医学进展 2010年第5期31卷 58-63页

作者：姚雪静占松鹤朱良强祁克宗王非王爱萍安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 安徽省动物疫病预防与控制中心安徽合肥230022

2008年从安徽两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,在Marc-145细胞上盲传4代～5代,发现明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HS08株和ZJ08株)。用RT-PCR扩增这两个分离毒株的nsp2和ORF7基因,进行克隆和序列分析。... 详细信息

2008年从安徽两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,在Marc-145细胞上盲传4代～5代,发现明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HS08株和ZJ08株)。用RT-PCR扩增这两个分离毒株的nsp2和ORF7基因,进行克隆和序列分析。结果表明,这两个分离毒株核苷酸同源性高于99.0%;在nsp2基因上,这两个分离毒株均发生30个氨基酸的不连续缺失,它们与CH-1a株之间核苷酸同源性分别为80.7%和80.2%;在ORF7基因上,与2007年国内高致病性猪蓝耳病毒株HuN4核苷酸同源性较高,分别为98.4%和99.5%,且ORF7基因均存在K46→R46,H109→Q109,V117→A117氨基酸突变。这些信息显示这两个安徽分离株属美洲型毒株,具有高致病性特征,与国内高致病性毒株位于同一基因群。

关键词： PRRSV nsp2基因 ORF7基因克隆序列分析

新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及其nsp2和ORF5基因遗传变异分析

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广东农业科学 2014年第17期41卷 106-110,2页

作者：张美玲陆桂丽薛晶刘丽雅简子健夏俊新疆畜牧科学院兽医研究所新疆乌鲁木齐830000 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异特征,利用RT-PCR、ORF5和部分nsp2基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒.分离的病毒株被鉴定为PRRSV美洲型,命名为XJ-Q株.该株病毒与香港分离株H... 详细信息

为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异特征,利用RT-PCR、ORF5和部分nsp2基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒.分离的病毒株被鉴定为PRRSV美洲型,命名为XJ-Q株.该株病毒与香港分离株HK13亲缘关系最近,与国内变异株（HUB1和JXA1）同源性较为亲近.与美洲型标准毒株VR-2332相比,该分离株在481位和532～560位共有30个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV变异株相比,在487～489位有3个氨基酸的独特缺失.结果表明,新疆分离株为PRRSV美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株.

关键词：猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRS) ORF5基因 nsp2基因序列分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及nsp2、ORF5基因的遗传变异分析

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猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及NSP2、ORF5基因的遗传...

作者：郭雪亮华中农业大学

学位级别：硕士

PRRS首先被报道于20世纪80年代的美国,之后迅速在世界各地传播。PRRS能引起猪繁殖障碍和呼吸道症状,该病起初被称为“神秘病”,现在被命名为猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome)。猪繁殖与呼吸综合征给... 详细信息

PRRS首先被报道于20世纪80年代的美国,之后迅速在世界各地传播。PRRS能引起猪繁殖障碍和呼吸道症状,该病起初被称为“神秘病”,现在被命名为猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome)。猪繁殖与呼吸综合征给全球养猪业带来巨大威胁。PRRS的病原为PRRSV(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus),据报道,PRRSV比其它一些RNA病毒进化速率更快。最近,2006年中国爆发了一次“猪高热病”,引起这次疫病的主要病原为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV),临床症状主要表现为高发病率和高死亡率(20%)。为了更深入地了解中国PRRSV的流行状况,2006年爆发PRRS后遗传进化特征以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒可能的致病机理,我们开始了这项研究工作。在这项研究中,我们在2009年到2010年期间检测了1060份临床样品,测得了101株毒株的ORF5和部分nsp2基因序列,分析中国近年来PRRSV的流向状况和变异情况。这些样品分别从安徽,湖北,河南,广西,江西,福建,广东,河北,陕西等省份。我们的结果显示2009年PRRSV阳性率为71.71%,2010年PRRSV阳性率为54.03%,并且高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒在中国已经占据主导地位。通过氨基酸序列比对分析,在101株毒株中nsp2序列氨基酸相似性为83.6%-100%,ORF5同源性为89.5%-100%。进化树分析表明,这101株毒株都属于美洲型毒株,而且我们将美洲型毒株划分为4个亚类。另外,高致病性PRRSV(2006年后在中国广泛流行)的变异毒株在2009年再次出现。序列分析显示,绝大部分毒株在nsp2氨基酸序列中存在30个氨基酸的不连续缺失,个别出现其他类型的缺失。在ORF5编码的GP5蛋白中出现了大量氨基酸残基的替换,特别是在主要中和抗原表位(PNE)和潜在糖基化位点。与经典毒株相比,潜在糖基化位点的数量和位置都发生了改变。我们的研究表明,中国PRRSV毒株正在经历快速地演变,出现了一些变异,可能导致目前临床使用的疫苗失效。通过本研究,将帮助我们更好地去了解中国PRRSV遗传变异特点,有利于未来疫苗的开发和使用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学 ORF5基因 nsp2基因遗传变异进化树分析

HP／LP-PRRSV二重FQ-PCR诊断方法的建立及其nsp2和ORF5基因变异分析

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HP／LP-PRRSV二重FQ-PCR诊断方法的建立及其Nsp2和ORF5基因变异分...

作者：孔刚锐河南科技大学

学位级别：硕士

2006年以来，我国大部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）与低致病性猪繁殖与呼吸综合征（LP-PRRS）混合感染并流行，其nsp2和ORF5基因的不断变异也增加了控制这两种疫病的难度，给我国养猪业造成了严重的经济损失。目前，针... 详细信息

2006年以来，我国大部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）与低致病性猪繁殖与呼吸综合征（LP-PRRS）混合感染并流行，其nsp2和ORF5基因的不断变异也增加了控制这两种疫病的难度，给我国养猪业造成了严重的经济损失。目前，针对这两种病原的诊断方法费时、耗力，而且难以鉴别诊断，其nsp2和ORF5基因遗传进化规律难以掌握。为了对HP-PRRS和LP-PRRS进行快速、可靠的鉴别诊断，了解河南省2010～2012年PRRSV的流行动态及主要基因遗传变异情况，本研究进行了HP/LP-PRRSV二重实时荧光定量RT-PCR（fluorescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR）诊断方法的建立，并对PRRSV的nsp2和ORF5基因进行了克隆测序与遗传进化分析。比对GenBank中登录的HP-PRRSV和LP-PRRSV的非结构蛋白（nsp2）基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针，经优化反应条件，建立起鉴别HP/LP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法;分别对该方法进行二重FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性实验，并对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测，同时与HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行对比实验;选择本方法检测出的有代表性的PRRSV阳性样品，对其nsp2和ORF5基因进行扩增和克隆，并进行序列测定和遗传进化分析。结果显示，成功建立了鉴别HP/LP-PRRSV的二重FQ-PCR检测方法，HP/LP-PRRSV标准曲线的曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达101copies/μL;特异性高，HP/LP-PRRSV阳性对照呈现阳性反应曲线，而对5个对照病原扩增曲线均呈现阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次，重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测，阳性检出率为92%，较二重RT-PCR方法阳性检出率高。对8个临床代表性阳性样品进行nsp2基因和ORF5基因片段克隆和测序分析，序列分析结果表明样品之间nsp2基因核苷酸同源率为93.5%～98.0%，与VR-2332核苷酸同源率为82.8%～83.7%，LV毒株独成一分支，表明nsp2核苷酸同源率较高，均属于美洲型毒株;与JXA1株核苷酸同源性94.5～97.3%，同在JXA1代表的大分支上，同HPRRSV同样均缺失30氨基酸;ORF5基因核苷酸之间同源率为93.9%～98.2%，与JXA1株核苷酸同源性93.5～96.6%，ORF5基因中除HN-GY株与CH-1a在同一枝上，其余7株均与JXA1株在同一大分枝上，与HP-PRRSV同源性较高遗传关系较近。nsp2基因氨基酸变异较小，ORF5氨基酸多个位点发生突变，应加强对其分子变异规律的研究，从而为PRRS的防控提供理论指导。

关键词：高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征二重实时荧光定量RT-PCR nsp2基因 ORF5基因变异分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒新疆株XJ-Q的分离鉴定及其nsp2和ORF5基因遗传变异分析

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猪繁殖与呼吸综合征病毒新疆株XJ-Q的分离鉴定及其Nsp2和ORF5基因...

作者：张美玲新疆农业大学

学位级别：硕士

本研究从新疆某养殖场采集疑似猪高热病病例的肺脏，猴肾细胞(Marc-145)分离病毒、鉴定，并克隆和分析其部分功能基因。将疑似猪高热病病例的肺组织病料接种至单层Marc-145细胞上进行分离培养，盲传3代后，Marc-145细胞出现了典型的细... 详细信息

本研究从新疆某养殖场采集疑似猪高热病病例的肺脏，猴肾细胞(Marc-145)分离病毒、鉴定，并克隆和分析其部分功能基因。将疑似猪高热病病例的肺组织病料接种至单层Marc-145细胞上进行分离培养，盲传3代后，Marc-145细胞出现了典型的细胞病变(CPE)。使用设计的特异性鉴定引物经RT-PCR方法扩增到约430bp基因片段。测序与分析表明，分离出的病毒为PRRSV(猪蓝耳病)毒株，并命名为新疆XJ-Q病毒株。该毒株传至4代后，其半数细胞培养物感染量(TCID50)为10-5.5/0.1mL，电镜下观察到约为50nm病毒粒子。用于新疆PRRSV XJ-Q株nsp2和ORF5基因的RT-PCR检测。经RT-PCR成功扩增出新疆XJ-Q株nsp2的769bp和ORF5的603bp的基因片段，本试验通过比对PRRSV国内外毒株的nsp2和ORF5基因序列，设计2对特异性引物PN1/PN2和PO1/P02，并克隆至PUCm-T质粒载体。对正确的重组质粒进行PCR鉴定、酶切和测序。序列比较结果表明，获得的XJ-Q分离株的nsp2基因与美洲分离株VR-2332的相似性为75.8%2.4%，与欧洲分离株LV的相似性仅为47.7%;而XJ-Q分离株的ORF5基因与美洲型分离株的相似性为88.1%6.4%，与欧洲分离株LV毒株的相似性只有62.4%，由此说明PRRSV XJ-Q属于美洲型毒株。依据ORF5序列对国内分离株进行了系统进化分析，XJ-Q株与香港HK13和HB-1亲缘关系最近，表明美洲型毒株中XJ-Q株与HB-1株同属一个亚群。推导氨基酸的比较结果表明，新疆地区的PRRSV XJ-Q株在ORF5基因编码蛋白与毒力相关的氨基酸(13位和151位氨基酸)存在着变异。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定 nsp2基因 ORF5基因遗传进化树

新疆株PRRSV的nsp2和ORF5基因变异分析

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新疆株PRRSV的NSP2和ORF5基因变异分析

作者：苏贵成新疆农业大学

学位级别：硕士

从新疆猪场采集发病仔猪脏器及血清,制作病理切片;用RT-PCR诊断试剂盒对组织样品进行检测,目的是检测PRRSV的nsp2(1594～1680)变异株;应用ELISA试剂盒检测PRRSV抗体效价,结果均为PRRSV阳性。将阳性病料接种于Marc-145细胞,经过3代盲传,... 详细信息

从新疆猪场采集发病仔猪脏器及血清,制作病理切片;用RT-PCR诊断试剂盒对组织样品进行检测,目的是检测PRRSV的nsp2(1594～1680)变异株;应用ELISA试剂盒检测PRRSV抗体效价,结果均为PRRSV阳性。将阳性病料接种于Marc-145细胞,经过3代盲传,出现了典型的细胞病理变化(CPE),经RT-PCR诊断试剂盒验证为PRRSV,最后分离出新疆PRRSV毒株,分别命名为XJ-a、XJ-b、XJ-c株,分离毒株在Marc-145细胞第三代分别为10-5.33TCID50/0.1mL、10-5.88TCID50/0.1 mL、10-5.46TCID50/0.1 mL,荧光抗体检测阳性。参照Genbank上发表的美洲型毒株ATCC-VR2332的nsp2 (1062bp)和ORF5(603bp)的两段基因序列,分别对这两段基因设计特异性引物P1/P2,P5/P6,建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) nsp2和ORF5基因的RT-PCR方法,对nsp2和ORF5片段进行扩增,分别从三份PRRSV毒株均获得了PRRSV nsp2的1062bp和ORF5的603bp的基因片段。将扩增得到的PCR产物纯化后分别连接到PUCm-T载体上,转化到大肠杆菌DH5α中,增菌培养后,挑选阳性克隆,重组质粒进行PCR鉴定和双酶切后送生物公司测序。用DNAStar软件分析XJ-a、XJ-b、XJ-c三个毒株的nsp2和ORF5序列,这三个毒株两段核苷酸序列与北美洲标准株VR2332和国内美州型毒株的nsp2和ORF5基因的核苷酸序列同源性进行比较,序列比较结果表明所获得nsp2基因序列与国内美州型毒株核苷酸的相似性为77.2%～98.6%,与VR2332株的相似性77.6%～78.7%,与LV株的相似性为42.5%～43.8%;获得ORF5基因序列核苷酸与VR2332株的相似性为86.6%～87.2%,与LV株的相似性为56.1%～56.4%,与国内美州型毒株的相似性为85.7%～99.2%。表明新疆PRRSV毒株与北美洲毒株有较近的亲缘关系,且新疆毒株与近两年发表的江西、山东、河南、湖南毒株nsp2和ORF5序列的同源性均达到96%以上。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp2基因 ORF5基因变异分析同源性

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒部分nsp2、ORF5～7基因的克隆、序列分析及分子流行病学调查研究

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广西猪繁殖与呼吸综合征病毒部分Nsp2、ORF5～7基因的克隆、序列...

作者：陈琼广西大学

学位级别：硕士

2006～2008年广西“高热”病期间,本研究通过RT-PCR的方法从广西不同县市的猪血清、流产胎儿、粪便、肺脏、淋巴结、肾脏中扩增得到25株PRRSV的部分nsp2、ORF5、ORF6、ORF7基因。这四个基因与2005年以前的国内PRRSV分离毒株CH-1a、BJ-4... 详细信息

2006～2008年广西“高热”病期间,本研究通过RT-PCR的方法从广西不同县市的猪血清、流产胎儿、粪便、肺脏、淋巴结、肾脏中扩增得到25株PRRSV的部分nsp2、ORF5、ORF6、ORF7基因。这四个基因与2005年以前的国内PRRSV分离毒株CH-1a、BJ-4、HB-1、HB-2、HN1的核苷酸同源性分别为77.1%～95.3%、81.9%～97.2%、92.0%～99.0%、85.2%～98.1%,氨基酸同源性分别为55.1%～94.0%;76.0%～95.0%、94.8%～98.9%、77.2%～96.0%,与2006-2007的国内PRRSV变异株JXA1、JX0612、HuN、HuN4、HuB1、HEB1的核苷酸同源性分别为96.3%～99.3%、91.5%～99.7%、98.7%～100%、93.0%～100%,氨基酸同源性分别为74.7%～98.8%、84.1%～100%、97.7%～100%、83.7%～100%,可见本研究毒株与2006-2007年分离的变异株同源性较高;遗传进化树分析表明本研究流行毒株属于美洲型的Ⅱ亚群,与JXA1、JX0612、HuN、HuN4、HuB1、HEB1分布在Ⅱ亚群的同一个分支,亲缘关系较近,这表明本研究毒株与PRRSV变异株可能来源于同一个祖先。通过GP5的遗传变异分析发现,广西的PRRSV变异并没有明显的地域性,Ⅱ亚群毒株在广西各县市都有分布;但从时间上分析,2003～2005年的广西毒株和2006～2008年的广西毒株分别分布在Ⅱ亚群的两个分支上,且在9aa、16aa、94aa、185aa位点,本研究毒株与JXA1、JX0612、HUB1、HEB1、HUN、HUN4的变异相同,而2003～2005年的广西毒株却极少发生变异;在54aa、59aa、104aa位点,2003～2005年的广西毒株发生了变异,而本研究的毒株却鲜少发生变异。在GP5中的R13、R151以及M蛋白中的Q16这3个病毒毒力致弱的相关位点,本研究毒株均未发生改变,但位于GP5蛋白中的病毒首要中和表位发生了变异:L39→I39。在nsp2氨基酸序列中发现,25个毒株序列的第482和第534～562位出现了1个和29个氨基酸的缺失,但这30个氨基酸的缺失可能不会对病毒的生长动力学产生明显影响。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp2基因 ORF2基因 ORF6基因 ORF7基因遗传变异流行病学分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒柳州地方株nsp2和ORF5基因变异分析

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中国动物检疫 2011年第11期28卷 35-38页

作者：韦正吉陈强严斯刚广西柳州市动物疫病预防控制中心广西柳州545005

为了给广西柳州预防和控制猪繁殖与呼吸综合症提供理论数据,本研究对利用RT-PCR方法扩增了该地区流行株LZ5和LZ6的nsp2和ORF5基因并进行测序分析,然后与GenBank中已发表的PRRSV毒株的nsp2和ORF5基因序列进行比较。结果显示,2株柳州地方... 详细信息

为了给广西柳州预防和控制猪繁殖与呼吸综合症提供理论数据,本研究对利用RT-PCR方法扩增了该地区流行株LZ5和LZ6的nsp2和ORF5基因并进行测序分析,然后与GenBank中已发表的PRRSV毒株的nsp2和ORF5基因序列进行比较。结果显示,2株柳州地方流行株均属于美洲型,在nsp2基因第483位和535~563位氨基酸均存在30个氨基酸的不连续缺失,其nsp2和ORF5基因的核苷酸同源性分别为99.5%和99.7%,推导的氨基酸同源性分别为100%和99.5%;与近几年国内流行的高致病性蓝耳病代表性毒株之间的nsp2、ORF5基因核苷酸同源性分别为94.7%~96.2%和97.2%~98.0%,其推导的氨基酸同源性分别为92.0%~95.5%和94.5%~97.0%。序列分析结果表明此次柳州流行的PRRSV与2006年夏高热病引起的基因序列高度同源,在基因序列上并未显示出新的特性,在国内也缺乏明显的地域性差异。

关键词：猪繁殖与呼吸综合症 nsp2基因 ORF5基因变异分析