检索结果-南通市图书馆

作者：王杰河北医科大学

学位级别：硕士

背景:肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是中枢神经系统运动神经元的退行性病变,主要表现为肌无力、肌萎缩、瘫痪。发病年龄一般在35-50岁之间,生存期3-5年,迄今尚无有效的治疗方法,目前利鲁唑是市场上唯一被美国FD... 详细信息

背景:肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是中枢神经系统运动神经元的退行性病变,主要表现为肌无力、肌萎缩、瘫痪。发病年龄一般在35-50岁之间,生存期3-5年,迄今尚无有效的治疗方法,目前利鲁唑是市场上唯一被美国FDA批准对ALS治疗有效的药物,但只能平均延长患者生存期2-3月。大约90-95%为散发型,5-10%为家族型。在家族型ALS中,突变的超氧化物歧化酶-1（SOD-1）基因是发病的主要原因。另外,编码突变蛋白TDP-43的TARDBP基因以及编码突变型RNA结合蛋白的FUS基因,都是与家族型ALS发病相关的基因。TDP43是由TARDBP基因中的6个外显子编码,TDP-43蛋白由414个氨基酸组成,由2个RNA识别序列和1个富含甘氨酸的C末端组成,具有DNA以及RNA结合蛋白的能力。同时,TDP-43可在富含甘氨酸的末端被截断,形成两个C末端的片段,分别为25KD、35KD,TDP25、TDP35都具有细胞毒性,其中TDP25的细胞毒性是其中最强的。虽然ALS的发病机制并不十分明确,但是研究表明与线粒体的损伤、谷氨酸兴奋性毒性、免疫系统的破坏、异常蛋白聚集等有关。此外,神经营养的供应不足也是重要原因。各种生长因子包括VEGF、IGF-1等在ALS中的表达是不同的,但它们都有巨大的神经保护作用,促进ALS中运动神经元的增殖。VEGF是血管源性的生长因子,它对各种细胞都有高效的促进分裂能力以及保护神经细胞避免脑损害的能力,对血管内皮细胞的生长和调控有着重要的作用,而且对神经生长、神经元的迁移有着直接的作用。最近的研究表明,当神经细胞处于低氧、低糖、氧化应激等不利条件时,VEGF可作为调节者调控各种复杂的机制,避免神经元死亡和刺激神经生长。VEGF家族可分为7种亚型,包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PLGF、VEGF-E、sv VEGF。VEGF-A是由33-42k Da组成的二聚体糖蛋白。它的基因的表达受许多条件的影响,包括低氧、生长因子、NO、p53突变、甲状腺生长激素、肿瘤生长因子。VEGF-A的高表达信使RNA主要存在于肾上腺、肝脏、心脏、脑。VEGF-A由8个外显子和7个内含子组成,根据其活性的不同又分为多种亚型,其中VEGF165是活性最强的。研究表明,在过表达VEGF-A的SOD-1 G93A转基因ALS小鼠与单纯的SOD-1 G93A转基因ALS小鼠相比,其神经元的死亡减少、疾病的发病时间延迟、生存率增加。目前尚无VEGF-A 165在稳转TDP25的NSC34细胞的ALS细胞模型中治疗效果的研究报道。目的:研究VEGF-A 165对稳转TDP25的NSC34细胞的ALS细胞模型的保护作用,并进一步探讨VEGF-A 165发挥保护作用的机制。方法:首先采用流式细胞仪筛选出稳转TDP25的NSC34细胞,将稳转TDP-25质粒的NSC34细胞复苏、传代、培养,提取蛋白质,进而通过免疫印迹法检测细胞中TDP25蛋白的表达水平,证明选用的细胞是稳转TDP25的NSC34细胞以建立ALS的细胞模型。然后用不同浓度的VEGF-A 165处理稳转TDP25的NSC34细胞,采用CCK8试剂盒检测细胞活力,确定VEGF-A 165对稳转TDP25的NSC34细胞的最适药物浓度。用最适药物浓度的VEGF-A 165干预细胞,测定乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量观察VEGF-A 165对稳转TDP25的NSC34细胞的保护作用。最后,采用免疫印迹法检测在凋亡通路上caspase3蛋白水平的变化,及在氧化应激通路上HO-1蛋白水平的变化,以研究VEGF-A 165的作用通路。结果:1通过western blot法检测流式细胞仪筛选后细胞中TDP25蛋白,结果显示细胞中有TDP25蛋白的表达,表明选用的细胞是稳转TDP25的NSC34细胞,成功建立ALS的细胞模型。2观察不同浓度的VEGF-A 165处理稳转TDP25的NSC34细胞后细胞的生长情况及细胞形态,CCK8试剂盒检测细胞活力,结果发现,当VEGF-A 165浓度达到5ng/ml时,细胞数目多,细胞突起展开,细胞形态最好,细胞活力最高,因此筛选出VEGF-A 165的最适药物浓度为5ng/ml。3用最适药物浓度的VEGF-A 165干预细胞,LDH、MDA的检测结果显示,给药组与对照组比较给药组LDH水平、MDA水平均明显下降（P＜0.05）。4 western blot法检测caspase3、HO-1蛋白水平的变化,结果显示给药组与对照组比较,caspase3和HO-1蛋白水平均显著降低（P＜0.01）。结论:VEGF-A 165对稳转TDP25的NSC34细胞有保护作用,其发挥保护作用是通过抑制caspase3、HO-1水平实现的。

关键词： VEGF 肌萎缩侧索硬化 NSC34细胞 TDP43 凋亡

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稳定转染hSOD1G93A增加NSC34细胞凋亡

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脑与神经疾病杂志 2021年第9期29卷 544-547页

作者：齐伟静刘亚玲周晓萌杨帅耿丽颖张欣保定市第一中心医院神经内科河北071000 保定市第一中心医院骨科河北071000 河北医科大学第二医院神经内科河北省神经病学重点实验室

目的探讨稳定转染hSOD1G93A对NSC34细胞凋亡的影响。方法常规体外培养稳定转染空质粒、hSOD1WT或hSOD1G93A质粒的NSC34细胞系,分为3组:空转组、野生组和突变组。应用CCK-8试剂盒和LDH试剂盒来测定各组细胞活力,应用透射电镜观察细胞线... 详细信息

目的探讨稳定转染hSOD1G93A对NSC34细胞凋亡的影响。方法常规体外培养稳定转染空质粒、hSOD1WT或hSOD1G93A质粒的NSC34细胞系,分为3组:空转组、野生组和突变组。应用CCK-8试剂盒和LDH试剂盒来测定各组细胞活力,应用透射电镜观察细胞线粒体形态,通过TUNEL染色来检测细胞凋亡情况,应用Western blotting检测各组细胞凋亡相关蛋白的表达水平。结果与空转组和野生组细胞相比,突变组细胞线粒体形态异常,细胞活力明显下降,凋亡细胞数量增多,差异有统计学意义(P细胞Bcl-2的蛋白表达水平显著下降,Bax的蛋白表达水平均明显增高,差异有统计学意义(PNSC34细胞线粒体形态异常,降低抗凋亡蛋白的表达水平,增加促凋亡蛋白的表达水平,最终导致凋亡细胞增加。

关键词： hSOD1G93A NSC34细胞肌萎缩侧索硬化凋亡

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白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞的作用

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作者：石小翠河北医科大学

学位级别：硕士

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis ,ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的慢性进行性致死性神经系统变性疾病,其病因和发病机制尚不清楚。很多研究表明氧化应激介导了神经元的死亡并在神经变性疾病的发生发展中发挥着... 详细信息

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis ,ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的慢性进行性致死性神经系统变性疾病,其病因和发病机制尚不清楚。很多研究表明氧化应激介导了神经元的死亡并在神经变性疾病的发生发展中发挥着重要作用,因此抗氧化应激治疗相应地成为了治疗ALS的一个重要方向。有研究发现在ALS患者的神经组织中存在异常的TDP-43(TAR-DNA binding protein)蛋白阳性包涵体,并出现该蛋白从核内到核外的异常分布。TDP-43由位于人类1号染色体1p36.2上的TARDBP(transactive response DNA binding protein)基因的6个外显子编码。TARDBP基因序列高度保守,广泛表达于多种组织。在后续的研究中证实,TDP-43在基因的表达调控方面起着重要作用,包括:参与剪切囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因及载脂蛋白AⅡ(ApoA-Ⅱ)基因;通过富含甘氨酸的C末端与核内不均一糖核蛋白(hnRNP)家族成员结合从而影响外显子跳跃接拼(exon skipping)、抑制剪接活性;与运动神经元生存蛋白作用为核体提供支架;参与调节mRNA稳定性、microRNA的生物合成、细胞凋亡和分裂;可能是调节神经元可塑性的神经元活性反应因子等。近两年来,数个研究小组先后在不同人群的家族性ALS(familial ALS, FALS)和散发性ALS(sporadic ALS,SALS)患者中发现了TARDBP基因的30多种突变,尤其以TDP-43Q331K与散发性ALS和TDP-43M337V与家族型ALS的相关关系研究较多,种种证据都提示TARDBP基因的异常与ALS的发生发展可能潜在相关,因此对这一基因功能及致病机制的研究也逐步深入。本实验室已做的研究证实,在转染TDP-43 Q331K、M337V突变位点的运动神经元细胞系(motor neuron-like cell line,简称nsc34)出现比转染Empty vector、TDP-43 Wide type组显著的氧化损伤、线粒体功能的障碍。白藜芦醇(Resveratrol,简称Res)最早是由葡萄的皮和种子中提取的一种植物抗毒素,化学名称为3, 4’,5-三羟基-1,2-二苯乙烯(亦称芪三酚),是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物,其具有多种生物学活性:如抗氧化作用,神经保护作用,抗肿瘤增殖作用,心血管保护作用,激活延寿基因等作用。研究证实,白藜芦醇上述生物学活性中,最受关注的是抗氧化清除自由基和神经保护作用。本研究应用稳定转染TDP-43 Q331K和TDP-43 M337V的NSC34细胞系作为ALS的细胞模型,深入研究不同浓度白藜芦醇对转染TDP-43突变位点的NSC34细胞系的作用。以细胞增殖速度和细胞总体损伤状况为切入点,寻求白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞的保护浓度。目的:探索稳定转染TDP-43的NSC34细胞系的培养方法;利用稳定转染TDP-43 Q331K和TDP-43 M337V的NSC34细胞系作为ALS的细胞模型,以此模型为基础,研究白藜芦醇干预后细胞的变化,探讨白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞的保护浓度。方法:参照NSC34细胞细胞株的培养程序,将本实验室现有的稳定转染TDP-43的NSC34细胞系进行复苏、传代、消化、冻存等,观察其生长和增殖变化。在成功培养稳定转染TDP-43的NSC34细胞基础上,于传代24小时后进行换液,待细胞恢复6-12小时后,将细胞分为对照组和Res干预组,Res干预组分别给予Res1、5和25μmol/L作用24小时,用四甲基噻唑蓝(MTT)法进行细胞活力分析;收集各组培养液,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果:⑴成功培养了稳定转染Empty vector、TDP-43 Wide type、TDP-43 Q331K、TDP-43 M337V四个NSC34细胞系,倒置显微镜下观察细胞生长状态良好;⑵稳定转染TDP-43的NSC34细胞系在给予Res作用24小时后,倒置相差显微镜下观察,1和5μmol/L干预组各组细胞形态可见突起细长光滑,彼此间可见丰富的联系,胞体圆润、折光性强、贴壁能力好;Res25μmol/L干预组可见各组细胞突起短,细胞彼此间多形成聚集,胞体皱缩、折光性差甚至成球形亮点、贴壁能力差;⑶给予Res1、5μmol/L作用24小时后,较未干预组和Res25μmol/L干预组细胞增殖程度明显升高、培养液LDH水平明显下降,具有统计学意义(P细胞增殖程度明显降低、LDH明显升高,具有统计学意义(P细胞系作为ALS的体外细胞模型的培

关键词：神经系统变性疾病 NSC34细胞 TDP-43 氧化应激乳酸脱氢酶白藜芦醇

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天麻素对肌萎缩侧索硬化症细胞模型的药理作用及机制研究

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中药新药与临床药理 2017年第6期28卷 729-733页

作者：姜懿纳阳松威朱天碧张钊陈乃宏湖南中医药大学湖南长沙410208 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所北京100050

目的探讨天麻素对肌萎缩侧索硬化症h SOD1^(G93A) NSC34细胞模型的影响及机制。方法给予正常培养的NSC34细胞天麻素后,观察细胞形态活力变化。通过转染h SOD1^(WT)和h SOD1^(G93A)质粒,建立h SOD1^(WT)和h SOD1^(G93A)nsc34稳定细胞系... 详细信息

目的探讨天麻素对肌萎缩侧索硬化症h SOD1^(G93A) NSC34细胞模型的影响及机制。方法给予正常培养的NSC34细胞天麻素后,观察细胞形态活力变化。通过转染h SOD1^(WT)和h SOD1^(G93A)质粒,建立h SOD1^(WT)和h SOD1^(G93A)nsc34稳定细胞系后再给予天麻素干预以观察h SOD1^(WT)和h SOD1^(G93A) NSC34细胞形态和活力变化以及MDA水平。结果在正常培养的NSC34细胞内加入天麻素后,细胞的形态和活力均无明显影响(P>0.05);在成功转染h SOD1^(WT)和h SOD1^(G93A)质粒的NSC34细胞内加入天麻素后,细胞活力明显增加(PNSC34细胞无明显影响,但对转染h SOD1G93A质粒后的细胞,有明显促进细胞存活和降低MDA的作用。

关键词：肌萎缩侧索硬化症天麻素 NSC34细胞 SOD1 中药

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红景天苷对肌萎缩侧索硬化症的保护机制

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中国老年学杂志 2019年第10期39卷 2471-2473页

作者：陶蕊张怀国付庆喜尤翠萍王龙临沂市人民医院神经内科山东临沂276000 临沂市人民医院全科医学科山东临沂276000 临沂市人民医院中心实验室山东临沂276000

目的探讨红景天苷在肌萎缩侧索硬化症细胞模型中的保护作用及其机制。方法阳离子脂质体转染法,转染(nsc)-34细胞,构建肌萎缩侧索硬化症细胞模型;对nsc-34细胞进行随机分组:对照组、空载组、转染组和转染组+(30/60/120)μmol/L红景天苷... 详细信息

目的探讨红景天苷在肌萎缩侧索硬化症细胞模型中的保护作用及其机制。方法阳离子脂质体转染法,转染(nsc)-34细胞,构建肌萎缩侧索硬化症细胞模型;对nsc-34细胞进行随机分组:对照组、空载组、转染组和转染组+(30/60/120)μmol/L红景天苷处理组。通过检测丙二醛(MDA)水平,反映各组线粒体氧化水平。通过Western印迹检测分裂半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved caspase)3、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt的表达水平,来反映细胞凋亡和上调磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt情况。结果成功构建肌萎缩侧索硬化细胞模型,该细胞模型中细胞凋亡与活性氧水平显著增高(P细胞凋亡(P细胞凋亡和氧化应激,可能通过PI3K/Akt信号通路保护肌萎缩侧索硬化中受损的神经元细胞。

关键词：红景天苷肌萎缩侧索硬化 NSC34细胞 PI3K/Akt

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