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HCV ns5b蛋白表达、纯化及活性测定

吉林农业大学学报 2008年第2期30卷 154-156页

作者：张秀杰李莉欧阳红生中国农业科学院生物技术研究所北京100081 吉林大学农学部畜牧兽医学院长春130062

以HCV cDNA为模板,设计特异性扩增引物,PCR得到编码ns5b的基因,与PET-21a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta菌株,加入IPTG(终浓度0.5 mmol/L),30℃、5 h诱导表达。连续通过Ni-NTA柱、SP阳离子交换柱纯化蛋白,1 L菌... 详细信息

以HCV cDNA为模板,设计特异性扩增引物,PCR得到编码ns5b的基因,与PET-21a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta菌株,加入IPTG(终浓度0.5 mmol/L),30℃、5 h诱导表达。连续通过Ni-NTA柱、SP阳离子交换柱纯化蛋白,1 L菌液可得到1.2 mg蛋白。体外活性测定结果表明,所得蛋白具有RdRp功能,酶对底物UTP的Km值为2.06μmol/L。

关键词： HCV ns5b蛋白表达纯化活性测定

牛病毒性腹泻病毒ns5b蛋白激活NF-κb信号通路分子机制的初步研究

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牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白激活NF-κB信号通路分子机制的初步研究

作者：尹纪营吉林农业大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,bVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,bVDV)引起的以牛感染为主的传染病,可引起患病动物腹泻、流产、繁殖障碍和免疫抑制等。因其危害性大,世界动物卫生组织(OIE)将其列为b类传染... 详细信息

牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,bVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,bVDV)引起的以牛感染为主的传染病,可引起患病动物腹泻、流产、繁殖障碍和免疫抑制等。因其危害性大,世界动物卫生组织(OIE)将其列为b类传染病,我国将其列为二类传染病,但具体致病机制尚不完全明确。因此,了解其致病机制对于遏制该病的传播至关重要。课题组前期研究已经证实bVDV ns5b可显著激活NF-κb信号通路,为进一步探究其激活机制,明确ns5b激活NF-κb信号通路的功能域,将ns5b蛋白按结构域截短为6段进行表达:ns5b-core(核心区)、ns5b-finger(指尖区)、ns5b-palm(手掌区)、ns5bthumb(拇指区)、ns5b-N(N端)、ns5b-c domain(C端),构建各截短片段pCAGGS真核表达载体转染HEK-293细胞,双荧光素酶报告系统初步确定ns5b激活NF-κb信号通路的功能域位于“指尖”和“手掌”结构域;构建各截短片段p EGFP真核表达载体,通过激光共聚焦及Western blot进一步证明ns5b的“指尖”区和“手掌”区可激活NF-κb,其他结构域无法激活该信号通路。基于此研究,我们将pEGFP-ns5b、pEGFP-ns5b-finger、pEGFPns5b-palm分别转染HEK-293细胞,提取6h、12h、24h、36h、48h细胞蛋白,Western blot结果显示,与对照组相比,NF-κb信号通路被激活后,TLRs和RLRs受体以及相关接头分子蛋白的表达量随时间变化呈现不同趋势,但表达量均有所增加。构建pGbKT7-ns5b诱饵质粒,通过酵母双杂交技术筛选出牛肾细胞c DNA文库中与ns5b有相互作用的宿主蛋白,并通过点对点实验、反交实验、激光共聚焦和免疫共沉淀四种方法进行验证,最终明确ARHGEF18可与ns5b互作。构建pEGFP-ARHGEF18重组质粒,与pEGFP-ns5b共转染HEK-293细胞,两者单独转染作为对照,通过Western blot检测p65的磷酸化水平,结果表明ARHGEF18促进ns5b对NF-κb的激活作用。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 ns5b蛋白酵母双杂交 NF-κb信号通路 ARHGEF18蛋白

与猪瘟病毒ns5b蛋白互作的宿主蛋白galectin-1对猪瘟病毒复制的影响

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与猪瘟病毒NS5B蛋白互作的宿主蛋白galectin-1对猪瘟病毒复制的影...

作者：冯茹西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的流行性疾病。该病的典型临床症状为高热,组织器官出血、阻塞和坏死,周身多发性小出血点,繁殖障碍等。CSFV是一种单股正链RNA病毒,ns5b蛋... 详细信息

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的流行性疾病。该病的典型临床症状为高热,组织器官出血、阻塞和坏死,周身多发性小出血点,繁殖障碍等。CSFV是一种单股正链RNA病毒,ns5b蛋白是CSFV的非结构蛋白,它具有依赖于RNA的RNA聚合酶活性(RNA dependent RNA polymerase,RdRp),在病毒复制的过程中发挥重要作用。研究ns5b蛋白和宿主细胞蛋白之间的相互作用,可以为了解CSFV的感染,认识ns5b蛋白在其感染过程中发挥的作用提供有效工具。在实验室前期的研究中,用含有CSFV ns5b基因构建的诱饵质粒与猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)cDNA文库进行酵母双杂交,成功筛选到了与CSFV ns5b蛋白相互作用的半乳糖凝集素-1(Lectin galactoside-binding soluble 1,LGALS 1/galectin-1)。galectin-1在细胞内和细胞外都具有很多功能,比如在机体内诱导细胞凋亡,通过调节炎症发生及免疫反应等来抵御外界病原微生物的入侵,还可以影响肿瘤的发生、细胞的黏附、细胞之间信号的转导等。galectin-1可以通过与蛋白或多糖之间相互影响来发挥其功能。本研究通过将CSFV ns5b基因片段克隆含有冷启动子的pCold-SUMO原核表达载体构建了重组质粒,转化Rosetta(DE3)大肠杆菌表达菌,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,成功地将重组蛋白在上清中表达。采用镍柱亲和层析法(NiNTA)进行纯化以获得纯度较高的蛋白,纯化得到的蛋白免疫小鼠以制备抗ns5b的多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹(Western blot)验证所制备多克隆抗体的反应性和特异性。发现制备的多克隆抗体可以与原核表达及真核质粒转染瞬时表达的ns5b蛋白发生反应,即通过Western blot可以检测到特异性条带,但与CSFV感染PK-15细胞后裂解所得的天然构象的ns5b蛋白不能发生特异性反应。研究发现CSFV感染的宿主细胞中galectin-1在转录水平(mRNA)和蛋白水平均出现下调。通过分别构建了galectin-1过表达和干扰稳定转染细胞系,接种CSFV后利用实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)对CSFV的转录水平及释放到上清中的病毒滴度水平进行检测。发现干扰PK-15细胞中galectin-1基因的表达可以上调CSFV的转录,过表达galectin-1蛋白下调了CSFV的转录和上清中的病毒滴度,即galectin-1具有抑制CSFV复制的生物学活性,可以为以后研发抗CSFV药物提供新的理论依据。

关键词：猪瘟病毒 ns5b蛋白多克隆抗体 galectin-1

与猪瘟病毒ns5b相互作用的宿主蛋白的筛选与鉴定

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与猪瘟病毒NS5B相互作用的宿主蛋白的筛选与鉴定

作者：高宇瑾西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是一种重要的猪的传染性疾病,给养猪业造成重大经济损失,该病的病原体为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)。近些年来已经很少见急性典型病例,主要以温和的非典型性病例为主,然而非典型病例... 详细信息

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是一种重要的猪的传染性疾病,给养猪业造成重大经济损失,该病的病原体为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)。近些年来已经很少见急性典型病例,主要以温和的非典型性病例为主,然而非典型病例的出现使猪瘟的防控形势更加严峻,持续性感染是猪瘟在我国难以根除的主要原因。目前对CSF的治疗无有效方法,猪瘟还继续威胁着养殖业,因此研究并阐明CSFV的致病机制是非常必要的。ns5b蛋白是RNA依赖的RNA酶,保守序列为GDD,负责RNA复制。ns5b蛋白具有类似于右手的手指,手掌和拇指形状的结构域,展示了聚合酶典型的一般折叠。已经证明了ns3、ns4A、ns4b、ns5A和ns5b蛋白对于基因组复制是必须的。非结构蛋白和非编码区之间的相互作用参与调控RNA复制和翻译。然而ns5b蛋白也很可能通过与宿主蛋白之间的相互作用来影响CSFV的复制和翻译,目前ns5b蛋白与宿主蛋白之间相互作用参与病毒复制的机理并不明确。本研究以CSFV ns5b蛋白为诱饵,并将诱饵蛋白ns5b克隆到p GbKT7载体上,通过对诱饵蛋白自激活和毒性检测后,将转化有pGbKT7-ns5b的Y2H Gold酵母菌株与PAM cDNA文库进行杂交试验,最终从不同营养缺陷型培养基上筛选并得到了90个阳性克隆,对阳性克隆进行PCR筛选鉴定,最终得到了60个阳性克隆,对阳性克隆进行测序。通过将测序结果与NCbI数据库中序列信息进行blast比对分析后,最终得到并确认12个与CSFV ns5b蛋白相互作用的宿主蛋白。从前期筛选的宿主蛋白中选择可能与CSFV复制和细胞自噬相关的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为进一步深入研究的宿主蛋白,酵母回返试验证实了CSFV ns5b蛋白可以与GAPDH蛋白相互作用。随后我们利用GST-Pulldown和激光共聚焦均验证GADPH蛋白与ns5b蛋白存在相互作用。然而GAPDH参与CSFV复制和细胞自噬的相关机制还有待进一步的深入研究。综上所述,本试验通过酵母双杂交技术筛选出了12个与CSFV ns5b蛋白相互作用的宿主蛋白,并且利用GST-Pulldown和激光共聚焦验证了GADPH蛋白能够与ns5b蛋白相互作用。

关键词：猪瘟病毒 ns5b蛋白酵母双杂交甘油醛-3-磷酸脱氢酶

基于丙型肝炎病毒非结构蛋白ns5b晶体结构的抑制剂筛选

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天津药学 2013年第5期25卷 4-8页

作者：杨淑芳李爽王中玲李真真傅晟天津经济技术开发区卫生防病站天津300457 天津市国际生物医药联合研究院天津300457

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是引起慢性肝炎的主要病原体之一,主要通过血源传播,严重危害人类的健康,寻找有效的抗病毒药物具有重要意义。随着HCV复制过程中一些重要蛋白以及这些蛋白与相关配体或抑制剂的精确三维结构的解析,... 详细信息

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是引起慢性肝炎的主要病原体之一,主要通过血源传播,严重危害人类的健康,寻找有效的抗病毒药物具有重要意义。随着HCV复制过程中一些重要蛋白以及这些蛋白与相关配体或抑制剂的精确三维结构的解析,对这些蛋白的三维结构进行设计和筛选,成为目前开发治疗HCV感染药物的重要手段。ns5b RNA聚合酶是HCV复制过程中的关键酶,是研究抗HCV病毒药物的一个重要靶点。本文以ns5b的晶体结构为基础,用晶体浸泡的方法进行ns5b蛋白的抑制剂筛选,得到了小分子抑制剂与ns5b蛋白的精确三维结构,从原子水平上阐释了抑制剂对HCV ns5b蛋白的抑制机理。

关键词：丙型肝炎病毒 ns5b蛋白晶体浸泡

核糖体展示人单链抗体库的构建及抗HCVns5b蛋白的ScFv的筛选

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核糖体展示人单链抗体库的构建及抗HCVNS5B蛋白的ScFv的筛选

作者：田江红第四军医大学

学位级别：硕士

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)引起的传染性疾病,主要通过血源途径传播,以慢性化程度高为主要特征。全球范围内HCV感染者为1.7～2.0亿,我国大约为4000万。HCV感染后有75～85%的感染者会形成慢性肝炎,进一步会发展为肝硬... 详细信息

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)引起的传染性疾病,主要通过血源途径传播,以慢性化程度高为主要特征。全球范围内HCV感染者为1.7～2.0亿,我国大约为4000万。HCV感染后有75～85%的感染者会形成慢性肝炎,进一步会发展为肝硬化和肝癌,目前HCV感染已成为严重危害人类健康的全球公共卫生问题之一。迄今为止抗HCV的治疗仅限于干扰素-利巴韦林联合使用,只有约50%的患者可获得持续的抗病毒反应,而且费用昂贵、有一定毒副作用,因此迫切需要研制更加安全有效的新型抗病毒药物和生物制品。 HCV ns5b蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),在病毒RNA复制中起着关键作用,而细胞中则没有相应功能的酶类,因此ns5b蛋白是抗HCV的理想靶位。近年来很多学者针对ns5b蛋白设计了多种核苷类与非核苷类抑制剂,疗效显著,然而临床试验发现用药后易出现耐药突变株,影响了抑制剂的进一步应用。鉴于ns5b蛋白晶体结构已经明确,它在复制基因组RNA中需要一定的空间构型转换才能发挥酶催化活性,可以克服抑制剂的耐药现象,因此构型抑制剂研究已成为拮抗ns5b酶活性研究的又一重要方向。单链抗体(ScFv)基因通过载体携带进入靶细胞内与与抗原特异结合,调节靶分子构型转换与细胞内定位,影响其生物功能的发挥,可将病毒复制的关键分子选择性的“敲除”,从而达到使目标分子生物学功能失活的目的。本研究从构建的核糖体展示人单链抗体库中,筛选出了抗ns5b蛋白的人源化单链抗体,有可能抑制ns5b蛋白的空间构型转换,为进一步研制抗HCV生物制剂带来了新的希望。【目的】以在HCV RNA复制中起关键作用的RNA聚合酶ns5b蛋白为靶标,从HCV阳性患者的PbLs中提取mRNA并构建ScFv基因文库,利用完全体外筛选、高库容的核糖体展示技术来筛选针对ns5b蛋白的人源性ScFv,将初步鉴定筛选到的ScFv生物学功能。【方法】 1.运用软件设计引物,以bb7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA;将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化bL21大肠杆菌,用IPTG诱导表达及可溶性分析;Western-blot检测ns5b蛋白的抗原性和特异性;用Ni2+-NTA亲和层析柱和电洗脱方法纯化ns5b蛋白;用纯化的ns5b蛋白免疫小鼠制备多抗血清。 2.从6名HCV阳性患者的外周血淋巴细胞(PbLs)中提取总RNA,甲醛变性电泳检测RNA质量;以反转录的全长cDNA为模板PCR扩增全套重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因,将VH和VL的胶回收产物拼接,来构建核糖体展示的人单链抗体(ScFv)基因库;构建ScFv-pMD18T载体,转化后挑60个克隆提取质粒,将酶切鉴定正确的31个克隆送去测序。 3.将纯化的ns5b蛋白包被磁珠;ScFv DNA库在兔网织红细胞裂解液中进行体外转录与翻译,形成ScFv-核糖体-mRNA(ARM)三聚体;用包被抗原从三聚体中筛选抗ns5b的ARM;筛选得到的ARM用Trizol试剂提取RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物进入下一轮循环;经三轮循环,从ScFv库中筛选抗ns5b的特异性ScFv基因并对其测序。 4.运用软件设计引物,以测序正确的Anti-ns5b-ScFv-pMD18T重组质粒为模板PCR扩增Anti-ns5b-ScFv基因;克隆入原核表达载体pET16b;将重组表达质粒Anti-ns5b-ScFv-pET16b转化bL21感受态细胞,用IPTG进行诱导原核表达及可溶性分析,SDS-PAGE和Western-blot鉴定ScFv是否有表达。【结果】 1.截断型HCVns5b基因克隆、表达及纯化酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性均良好;利用亲和层析和电洗脱方法获得了纯化的ns5b蛋白;制备了效价为1:3000的抗血清。 2.核糖体展示人ScFv库的构建从6名HCV阳性患者的PbLs中提取总RNA,甲醛变性电泳结果可见28s和18s rRNA条带,表明RNA的质量很好;通过重叠PCR技术扩增抗体的VH和VL基因,并用linker将其拼接,成功构建了ScFv DNA文库;对31个阳性克隆进行序列分析,结果表明该文库有很好的多样性,库容量较大,约为7.86×1012。 3.筛选针对ns5b的ScFv将ScFv DNA库体外转录和翻译,通过SDS-PAGE 证实其有效形成了ScFv-核糖体-mRNA三聚体;用包被抗原从三聚体中筛选获得了针对ns5b的ScFv基因并测序正确。 4.抗ns5b ScFv的原核表达及初步

关键词： HCV ns5b蛋白单链抗体库核糖体展示技术

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调控表达HCVns5b蛋白小鼠模型的建立

调控表达HCVNS5B蛋白小鼠模型的建立

作者：马玉第四军医大学

学位级别：硕士

目前全世界有1.7亿人感染了丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV),HCV感染慢性化往往可以发展为严重的肝脏疾病,如脂肪肝、肝硬化和肝癌,严重危害人类健康。迄今为止,尚未有疫苗可以预防HCV感染,而且抗病毒治疗成本高、副作用大,疗效... 详细信息

目前全世界有1.7亿人感染了丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV),HCV感染慢性化往往可以发展为严重的肝脏疾病,如脂肪肝、肝硬化和肝癌,严重危害人类健康。迄今为止,尚未有疫苗可以预防HCV感染,而且抗病毒治疗成本高、副作用大,疗效有限。因此丙型病毒性肝炎是继乙型病毒性肝炎之后的又一种引起全球广泛关注的病毒性肝炎传染病。长期以来,人们一直致力于对HCV的防治研究,但是研究进展缓慢。这主要是因为HCV具有较高的变异性,缺乏稳定的HCV感染动物模型,严重阻碍了对HCV致病机制、抗病毒药物筛选和疫苗研究的进程。目前HCV动物模型的研究主要集中在感染动物模型、人-鼠肝脏嵌合小鼠模型和转基因小鼠模型三个方面,但都存在很大的局限性。HCV ns5b是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),在HCV复制中起着关键作用。并且鉴于ns5b的晶体结构已经明确,对其功能的研究也较为深入,因此ns5b是目前抗HCV的理想靶标之一。本研究通过联合使用Tet-on四环素调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统,建立了一个可在肝脏组织严格调控表达HCV ns5b蛋白的三转基因小鼠模型,研究内容和结果如下;1.构建受Tet-on和Cre/LoxP系统双重调控的HCV ns5b真核表达载体以真核表达载体pbI-3为载体构建骨架,在其启动子的下游依次插入luc报告基因、bGH PolyA和ns5b基因片段,并分别在luc报告基因的上游和bGH PolyA尾的下游各引入一个LoxP位点,成功构建了可受Tet-on四环素调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统双重调节控制的HCV ns5b真核表达载体,命名为PbI-3/luc-bGH PolyA-ns5b。这种双调控设计不但可以更为严格的避免漏过性表达,而且双报告基因的设计为后期实验筛选背景表达低和诱导性强的转基因小鼠提供了简便、灵敏、准确的检测方法。PbI-3/luc-bGH PolyA-ns5b真核表达载体的成功构建为可严格调控HCV ns5b蛋白表达转基因小鼠的建立奠定了良好的基础。2.建立在Dox诱导下可严格调控表达ns5b蛋白的三转基因小鼠将PbI-3/luc-bGH PolyA-ns5b载体线性化后送往上海南方模式生物研究中心制备在Tet-on和Cre/LoxP系统双重调控下表达HCV ns5b蛋白的转基因小鼠,结果获得了6只ns5b转基因小鼠首建鼠(F0)。将该首建鼠进行PCR及Southern bolt鉴定后与C57bL/6小鼠杂交获得第一代小鼠(F1), PCR法筛选ns5b基因阳性小鼠。经筛选获得的ns5b基因阳性的小鼠一部分与C57bL/6小鼠继续交配,繁殖扩群,用PCR法检测其是否能够将外源基因稳定遗传;而另一部分与共表达rtTA和Cre的双转基因小鼠(rtTALAP-1/LC-1)杂交,筛选共表达ns5b、Lap、Cre基因的三转基因小鼠。用PCR法分别检测ns5b基因、Lap基因和Cre基因片段,三种片段均阳性的三转基因小鼠用Dox(盐酸强力霉素)饮水饲喂一周,小鼠腹腔注射荧光素,用小动物在体光学成像分析系统下检测三转基因小鼠肝脏的发光信号,用免疫组化法检测Cre重组酶和ns5b蛋白在小鼠肝脏组织中的表达情况。结果发现三转基因小鼠在Dox诱导一周后,只在肝脏部位采集到强烈的特异性荧光信号,其他部位未采集到信号,说明该三转基因小鼠的调控性和特异性均良好。免疫组化法证实Cre重组酶特异性定位于肝细胞胞核,ns5b蛋白特异性分布于肝细胞胞浆。综上所述,通过联合使用Tet-on四环素调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统建立了三转基因小鼠模型,其目的基因ns5b表达的诱导性和肝脏靶向性均良好,为后期评价该三转基因小鼠用于HCV RdRp抑制剂筛选的稳定性和有效性提供了实验基础。

关键词： HCV ns5b蛋白转基因小鼠模型

bVDV拯救与缺失ns5b的bVDV感染性RNA表达载体构建

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BVDV拯救与缺失NS5B的BVDV感染性RNA表达载体构建

作者：秦春雪山东师范大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻病(bovine viral diarrhea,bVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,bVDV)引起的一种重大传染病,主要感染牛、羊、鹿和猪等动物。该病分布范围广泛,给全世界的畜牧业造成了巨大的经济损失。目前西方有经验... 详细信息

牛病毒性腹泻病(bovine viral diarrhea,bVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,bVDV)引起的一种重大传染病,主要感染牛、羊、鹿和猪等动物。该病分布范围广泛,给全世界的畜牧业造成了巨大的经济损失。目前西方有经验的国家主要以灭活疫苗和减毒疫苗来预防该病,而我国针对bVDV的研究起步较晚,疫苗研制相对落后。临床上只有一种灭活疫苗被批准使用,而且其免疫原性较差,免疫成本较高。因此,急需研制出免疫原性高且成本较低的新型疫苗,为我国bVDV防控工作提供新方法。bVDV是一种单股正链RNA病毒,大小约为12.3kb。其开放阅读框编码一个长的多聚蛋白,被病毒和宿主蛋白酶切割成12个成熟的多肽。其中ns5b蛋白位于多聚蛋白的羧基末端,具有RNA依赖性RNA聚合酶活性,对bVDV基因组的复制至关重要。如果缺乏ns5b蛋白,bVDV基因组将无法复制,其在宿主细胞中便无法增殖,从而失去连续感染的能力。因此可以利用该特性构建缺失ns5b的bVDV疫苗株,这将为我国bVDV疫苗研制提供新思路。构建全长感染性cDNA克隆是获得ns5b基因缺失疫苗的必经之路。虽然之前有相关报道,但所有针对bVDV的拯救方法,均需经过体外转录、体外合成和RNA转染等技术,过程繁琐且RNA易降解,对操作技术要求较高。因此需要研发出一种简便易操作的反向遗传系统来拯救bVDV。为了解决上述问题,在本论文中,我们开展了如下研究:(1)为了检测bVDV病毒,我们构建ns5b蛋白的原核表达载体,使用IPTG诱导剂诱导蛋白表达。蛋白经镍柱纯化后,作为主要免疫原,皮下接种刺激小鼠产生免疫反应,从而产生多克隆抗体。研究发现,ns5b蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,且截短的ns5b比未截短的表达量要高。将该多克隆抗体用于检测bVDV,显示特异性较好。(2)构建ns5b慢病毒表达载体,使用电穿孔转染法将其转入bHK细胞中,使用嘌呤霉素进行筛选表达ns5b的阳性单克隆细胞,并逐级扩大培养为稳定表达ns5b蛋白的bHK细胞系。(3)为了方便检测bVDV疫苗的免疫效果,我们构建了bVDV感染小鼠模型。使用口服灌胃法接种野生型bVDV,然后通过Western blot以及免疫荧光法检测其脾脏内bVDV的表达情况,并通过HE染色观察bVDV对其组织的病理学损伤情况。研究发现,口服接种可以使小鼠感染bVDV,且感染后第五天bVDV表达量最高。有趣的是,感染bVDV对小鼠肝脏、心脏和脾脏组织并无明显病理学损伤。(4)本文对bVDV的反向遗传操作系统进行了简化。基本操作是在其基因组5′UTR前加入锤头状核酶序列,可以使宿主细胞中转录出的RNA能准确地将5′端多余序列切除。在3′UTR后加入丁型肝炎病毒核酶序列,可以确保bVDV 3′端的完整性。经改进后,它可以不经体外转录,直接转染细胞产生bVDV,这使bVDV拯救优于之前报道的系统。随后,将构建好的bVDV感染性RNA表达载体转染至bHK细胞中获得其感染性RNA,即拯救型bVDV。感染MDbK细胞后盲传5代,通过观察细胞病变情况以及PCR检测,确定拯救型bVDV是否呈阳性。进而通过免疫荧光检测以及Western blot检测等方法分析拯救型bVDV的感染性。经检测后发现,拯救型bVDV呈阳性且具有一定的感染性,但是细胞感染后无明显细胞病变情况,且病毒滴度较低。将其感染小鼠后进行Western blot检测,发现可以感染小鼠。(5)在bVDV全基因组克隆的基础上,缺失ns5b基因,构建缺失ns5b的bVDV感染性RNA表达载体。本文对bVDV的拯救与分析进行了进一步的研究,并提出构建ns5b缺失疫苗的思路,为拯救bVDV提供新方法,为研制bVDV缺失疫苗株奠定基础,对我国防控bVDV具有重要意义。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 ns5b蛋白反向遗传学技术基因缺失疫苗

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构建bVDV-ns5b稳定表达的细胞系

构建BVDV-NS5B稳定表达的细胞系

作者：夏国建山东师范大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻(亦称粘膜病)是世界动物卫生组织(Office International desépizooties,OIE)必须上报的传染病之一。其病原是牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus,bVDV)。bVDV为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的代表成员。bVDV能感染的动物主要包括牛、羊和猪等,最近发现bVDV也能感染小鼠。但是其天然宿主为牛,尤其是幼龄牛的易感性最高。感染bVDV之后引起牛发病,产生的症状不一,有的急性感染,损伤牛的健康,重症者死亡;有的持续感染,无明显症状,却成为主要的传染源,并且由于免疫抑制作用,导致继发其他疾病而放大其危害。目前在防控bVDV方面,欧美国家已经积累了较丰富的经验,主要采用“筛查+淘汰”和“免疫+淘汰”两种净化策略。前者建立在有效的诊断基础之上,且淘汰成本高;后者依赖高效的疫苗免疫,适用于养牛密度高,且bVDV流行率高的地区。因此,第二种策略较适应我国当前情况。要很好地控制在我国bVDV的流行,研究和生产高效疫苗成为当务之急。bVDV的基因组约为12500核苷酸的正链RNA,一个开放阅读框编码一个大的蛋白,然后被剪切为12个蛋白。最后一个蛋白为其RNA聚合酶ns5b,缺乏此蛋白病毒基因组将不能复制,病毒在宿主细胞中将不能增殖,而失去连续感染能力。本实验室已经成功构建出ns5b缺失的bVDV疫苗病毒,所以要构建ns5b基因稳定表达的生产细胞系,以遗传互补的方式使ns5b缺失的bVDV疫苗病毒在配套细胞系中增殖。项目的完成,将有望弥补我国bVDV疫苗生产中的不足,对控制我国bVDV具有非常重要的意义。根据ns5b核酸序列设计并合成上下游引物,以实验室保存的从bVDV病毒液中提取的RNA反转录成的cDNA为模板,通过PCR扩增出ns5b核酸序列,然后与pLVX-IRES-Puro载体连接,构建pLVX-IRES-Puro-HA-ns5b重组质粒。重组质粒经过鉴定之后,与包装载体(PLP1、PLP2、pLP/VSVG)共转染293T细胞,48h和72h分别收集病毒液感染MDbK细胞,感染48h之后用含有嘌呤霉素的培养基筛选阳性细胞,直至单克隆出现并逐级扩大培养。另外将pLVX-IRES-Puro-HA-ns5b直接转染bHK细胞,并通过嘌呤霉素筛选获得表达ns5b蛋白的bHK细胞系。本研究利用原核表达系统成功表达了ns5b抗原表位,并对其进行纯化,经过测定最高浓度可达430μg/mL,然后经过弗氏佐剂乳化免疫小鼠,免疫三次之后摘除眼球致死获得抗ns5b的血清,经过ELISA效价测定,最高效价可达1:64000,因此获得有效的血清用于后期Western blot检测表达ns5b蛋白的细胞系,也可以检测bVDV。总之,本实验成功获得抗ns5b的血清,成功构建ns5b稳定表达的bHK细胞系,为ns5b缺失的bVDV疫苗病毒提供了配套生产细胞系,以反向遗传互补方式获得bVDV基因缺失病毒奠定基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 ns5b蛋白慢病毒载体 MDbK细胞 bHK细胞原核表达