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蓝舌病毒释放机制的研究进展

生物工程学报 2021年第9期37卷 3179-3189页

作者：林俊泓王让赵瑶陈玉娟马鲜平易华山西南大学动物医学院重庆402460

蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)作为由媒介昆虫库蠓传播的引起反刍动物蓝舌病(Bluetongue,BT)的病原微生物,同时也是研究无囊膜病毒(Non-enveloped virus)释放机制的经典模型。文中以BTV侵染细胞及组装为始,对BTV诱导细胞自噬并通过多... 详细信息

蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)作为由媒介昆虫库蠓传播的引起反刍动物蓝舌病(Bluetongue,BT)的病原微生物,同时也是研究无囊膜病毒(Non-enveloped virus)释放机制的经典模型。文中以BTV侵染细胞及组装为始,对BTV诱导细胞自噬并通过多囊泡体以细胞外囊泡形式释放、BTV诱导细胞凋亡而裂解释放、BTV从质膜出芽释放的不同途径以及BTV关键非结构蛋白ns3在调控BTV释放过程中作用机制的研究进展进行综述,为进一步了解BTV感染、增殖、释放的分子机制提供参考。

关键词：蓝舌病毒细胞外囊泡裂解性释放非裂解性释放 ns3蛋白

Zika病毒ns3具有依赖于ATP水解的dsDNA解链活性

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基础医学与临床 2018年第5期38卷 674-678页

作者：徐杉王蕾杰石磊中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的研究Zika病毒ns3蛋白是否具有依赖于ATP水解的ds DNA解链活性。方法构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21菌株中表达带有His标签的Zika ns3蛋白,并用Ni琼脂糖珠进行纯化;利用ATPase检测试剂盒对ns3的ATP水解活性进行检测;利用荧光共振... 详细信息

目的研究Zika病毒ns3蛋白是否具有依赖于ATP水解的ds DNA解链活性。方法构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21菌株中表达带有His标签的Zika ns3蛋白,并用Ni琼脂糖珠进行纯化;利用ATPase检测试剂盒对ns3的ATP水解活性进行检测;利用荧光共振能量转移(FRET)原理,对ns3的ds DNA解链活性进行实时动力学检测;利用定点突变方法将ns3蛋白的第198位甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A),得到G198A突变体,检测其是否影响ns3解旋酶活性。结果 Zika ns3蛋白在体外可以水解ATP,酶解最大反应速率为2.76μmol/(L·min),Km值为0.11 mmol/L;Zika ns3蛋白在体外可以解链ds DNA;G198A突变体与野生型相比,ATP水解速率和ds DNA的解链速率均明显减弱。结论 Zika ns3蛋白在体外具有ATP水解活性以及ds DNA解链活性,且第198位甘氨酸对于ns3酶活性至关重要。

关键词： Zika病毒 ns3蛋白 ATP dsDNA 解旋酶

丙型肝炎病毒ns_3蛋白人源基因工程单链抗体的表达

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中华肝脏病杂志 2000年第3期8卷 171-173页

作者：钟彦伟成军刘妍董菁杨继珍张玲霞解放军第三O二医院传染病研究所基因治疗研究中心北京100039

目的在大肠杆菌ＸＬ_１－Ｂｌｕｅ中表达可溶性的抗ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ_３的人源单链可变区抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙ，ＳＣＦＶ）。方法以重组的ＨＣＶＮＳ_３为抗原... 详细信息

目的在大肠杆菌ＸＬ_１－Ｂｌｕｅ中表达可溶性的抗ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ_３的人源单链可变区抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙ，ＳＣＦＶ）。方法以重组的ＨＣＶＮＳ_３为抗原，利用噬菌体抗体库技术筛选含有抗－ＨＣＶＮＳ_３ＳＣＦｖ基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒，经ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ酶切鉴定后，亚克隆到ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ载体；转化大肠杆菌ＸＬ_１－Ｂｌｕｅ，提取质粒进行ＤＮＡ序列测定；异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，ＩＰＴＧ）诱导表达ＨＣＶＮＳ_３可溶性单链可变区抗体。ＥＬＩＳＡ和斑点吸印杂交检测其与不同来源的抗原的结合活性。结果筛选到的ＨＣＶＮＳ_３的单链抗体基因，经限制性内切酶酶切和序列分析表明，该抗体基因由７５０ｂｐ组成，ＥＬＩＳＡ和斑点吸印杂交结果表明，在大肠杆菌ＸＬＩ-Ｂｉｌｌ６中表达的ＨＣＶＮＳ_３的单链抗体，可与不同来源的ＮＳ_３抗原结合。结论大肠杆菌ＸＬ_Ｉ－Ｂｌｕｅ表达的ＮＳ_３－ＳＣＦＶ具有结合不同来源的ＨＣＶＮＳ３的活性和特异性。

关键词：丙型肝炎病毒单链可变区抗体 ns3蛋白

鉴别蓝舌病野毒感染ELISA检测方法的建立与初步应用

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中国兽医学报 2020年第8期40卷 1438-1442页

作者：黄超华史卫军曹琛福王潇花群义林彦星陈金顶华南农业大学兽医学院广东广州510642 深圳海关动植物检验检疫技术中心广东深圳518045

利用原核表达系统表达并纯化获得蓝舌病病毒ns3蛋白。以ns3重组蛋白作为包被抗原,经过对包被浓度、样品稀释度以及二抗工作浓度和作用时间等一系列条件的优化,建立了一种鉴别蓝舌病野毒感染的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该方法的... 详细信息

利用原核表达系统表达并纯化获得蓝舌病病毒ns3蛋白。以ns3重组蛋白作为包被抗原,经过对包被浓度、样品稀释度以及二抗工作浓度和作用时间等一系列条件的优化,建立了一种鉴别蓝舌病野毒感染的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该方法的检测灵敏度可达1∶1280,批内、批间变异系数均小于10%,具有良好的重复性。与商业化的蓝舌病试剂盒对比检测的结果显示,两者的蓝舌病阳性样品符合率为100%,本试验建立的间接ELISA方法可以区分蓝舌病自然感染和疫苗免疫动物。

关键词：蓝舌病病毒 ns3蛋白间接ELISA

牛病毒性腹泻病毒HB-1株的分离鉴定及间接ELISA检测方法的建立

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牛病毒性腹泻病毒HB-1株的分离鉴定及间接ELISA检测方法的建立

作者：王妍瑾河北科技师范学院

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea,BVD）又称粘膜病,是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的一种以肠黏膜脱落为主要特征的一种呈世界性分布的传染病,早期诊断和检测是防控、净化该病的重要环节。ns3蛋白... 详细信息

牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea,BVD）又称粘膜病,是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的一种以肠黏膜脱落为主要特征的一种呈世界性分布的传染病,早期诊断和检测是防控、净化该病的重要环节。ns3蛋白是BVDV编码的重要的非结构蛋白,保守性强,是BVDV的免疫优势蛋白。因此,利用ns3蛋白建立BVDV检测方法具有重要意义。主要研究内容包括:1.BVDV毒株的分离鉴定收集了实验室2019～2020年送检发病牛的9份病料,经RT-PCR检测鉴定其中3份BVDV阳性。将阳性病料进行病毒分离,盲传5代后通过RT-PCR进行验证,验证正确后继续传5代。最终本研究成功分离了一株NCP型BVDV毒株,将其命名为HB-1。通过设计全基因组引物,对基因序列进行扩增,最终得到了HB-1的全基因组序列。全基因组核苷酸序列同源性显示HB-1与ZM-95的同源性最高,为86.9%,系统发育进化树显示HB-1与BVDV-1m几个参考毒株处于同一分支,证明HB-1分离株为BVDV-1m亚型;E0、E2和ns3蛋白氨基酸序列分析结果与全基因组分型结果一致。2.间接ELISA检测方法的建立本研究通过RT-PCR扩增出HB-1的ns3基因,构建了重组表达质粒p ET-32a-ns3,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中表达,通过SDS-PAGE鉴定ns3蛋白在上清中表达。经Western blot分析鉴定ns3蛋白具有反应原性。之后用纯化浓缩后的ns3蛋白作为包被抗原建立了BVDV抗体间接ELISA检测方法。ns3重组蛋白仅与BVDV阳性血清发生特异性反应,不与BRV、IBRV阳性血清发生反应,特异性良好;该方法的敏感性实验显示BVDV阳性血清在1:12800倍稀释时结果仍呈阳性,敏感性高;该方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性好。用建立的方法对临床收集的68份免疫血清,289份未免血清进行抗体检测,免疫血清总体阳性率95.59%,未免血清总体阳性率86.16%。建立的该检测方法为国内BVDV抗体的检测提供了技术支撑。

关键词：牛病毒性腹泻病毒分离鉴定 ns3蛋白间接ELISA方法

PSMB5蛋白对猪瘟病毒增殖的影响及其机制研究

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PSMB5蛋白对猪瘟病毒增殖的影响及其机制研究

作者：杨超华南农业大学

学位级别：硕士

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染猪引起的一种重大烈性传染病,给我国养猪业造成重大的经济损失,严重影响养猪业的发展。细胞20S蛋白酶体亚单位β5(Proteasome subunit beta 5,PSMB5)是细胞蛋白酶体关键的蛋白亚基,位于细胞蛋白酶体催化中心并主导其发挥蛋白水解的功能,可影响病毒在细胞中的增殖。目前关于PSMB5蛋白影响CSFV增殖的研究较少,本文旨在研究PSMB5蛋白对CSFV增殖的影响及其机制,为CSF的防控提供理论基础。为了研究CSFV与PSMB5蛋白的相互作用关系,本研究首先探究CSFV感染PK-15细胞对PSMB5蛋白表达的影响,将CSFV石门株感染PK-15细胞,分别运用q RT-PCR和Western blot试验检测细胞中PSMB5的m RNA与蛋白水平。结果显示,与未感染的细胞相比,CSFV感染的细胞中PSMB5的m RNA和蛋白水平均降低,表明CSFV感染抑制了细胞PSMB5蛋白的表达。为进一步研究PSMB5对CSFV增殖的影响,本研究将p3×Flag-PSMB5重组质粒转染3D4/2细胞以过表达PSMB5蛋白、将靶向PSMB5基因的si RNA-PSMB5转染3D4/2细胞以抑制PSMB5蛋白的表达,同时分别设立p3×Flag-CMV和si RNA-NC转染的对照组,转染后24 h再感染CSFV石门株,q RT-PCR检测CSFV基因拷贝数,间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)测定CSFV的TCID。结果显示,与p3×Flag-CMV转染细胞对照相比,p3×Flag-PSMB5转染细胞的PSMB5蛋白水平升高、CSFV的基因拷贝数减少、CSFV的病毒滴度降低;与si RNA-NC转染细胞对照相比,si RNA-PSMB5转染细胞的PSMB5蛋白水平降低、CSFV的基因拷贝数增加、CSFV的病毒滴度升高。结果表明,过表达PSMB5蛋白可抑制CSFV的增殖,而PSMB5蛋白基因功能干扰则促进了CSFV的增殖。为进一步探讨PSMB5是否通过与CSFV ns3相互作用从而影响CSFV的增殖,本研究将p3×Flag-PSMB5与HA-ns3重组质粒共转染3D4/2细胞,转染后48 h用HA标签抗体、Flag标签抗体与对应的荧光二抗孵育细胞,通过激光共聚焦显微镜观察。结果显示,在p3×Flag-PSMB5与HA-ns3共转染的细胞浆中可以观察到特异性的橙黄色荧光。结果表明,PSMB5与ns3共定位于细胞浆中,两者可能存在互作关系。接着本研究将0μg、1μg、2μg的p3×Flag-PSMB5质粒分别与2μg的HA-ns3质粒共转染3D4/2细胞,检测PSMB5蛋白和ns3蛋白的表达情况。结果显示,随着p3×Flag-PSMB5质粒转染剂量的增加,ns3蛋白的表达量随之下降,表明细胞蛋白PSMB5可抑制CSFV ns3蛋白的表达。为研究PSMB5蛋白是否通过泛素-蛋白酶体途径降解ns3蛋白,本研究将HA-ns3质粒转染3D4/2细胞,转染后24 h用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,同时设立HA-ns3质粒转染并用DMSO处理的细胞对照组,通过免疫沉淀试验检测ns3蛋白是否被泛素化。结果显示,转染并用MG132处理的细胞能检测到泛素蛋白的表达,而用DMSO处理的转染细胞未见泛素蛋白的表达,表明CSFV ns3蛋白在3D4/2细胞中被泛素化。上述实验表明,细胞蛋白PSMB5对ns3蛋白的表达具有抑制作用,其作用与泛素-蛋白酶体途径对ns3蛋白的泛素化修饰和降解有关。为了初步研究JAK/STAT(Janus activated kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)通路是否介导CSFV感染对PSMB5蛋白表达的调控,本研究在CSFV感染PK-15细胞后加入STAT3(Signal transducers and activators of transcription 3)抑制剂STATTIC,同时设立未处理的空白对照组与感染CSFV后未加入STATTIC的细胞对照组,感染后72 h检测细胞中PSMB5的蛋白水平。结果显示,感染CSFV后STATTIC处理组的PSMB5的蛋白水平高于未处理组,与空白对照组差异不显著,表明STATTIC抑制STAT3后减轻了CSFV对PSMB5的抑制。在γ-干扰素(Interferon-gamma,IFN-γ)、病毒入侵等因素的刺激下,部分PSMB5蛋白会被免疫蛋白酶体亚基LMP7替代,两者共同参与MHC-I类抗原递呈途径降解病毒蛋白的过程,加强MHC-I类抗原递呈效率。为了研究PSMB5与LMP7是否通过M

关键词：蛋白酶体亚基PSMB5 猪瘟病毒 ns3蛋白 STAT3 MHC-I类抗原递呈途径

HCV核心区与ns3区抗原表位分析及融合基因表达

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军事医学科学院院刊 1997年第3期21卷 176-176页

作者：逯好英徐东刚朱分禄孟文华孟庆华军事医学科学院基础医学研究所

ＨＣＶ核心区与ＮＳ３区抗原表位分析及融合基因表达逯好英徐东刚朱分禄孟文华孟庆华军事医学科学院基础医学研究所北京１００８５０丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）区及ＮＳ３区抗原是第二代抗－ＨＣＶ抗体诊断试剂的主要组分。核心... 详细信息

ＨＣＶ核心区与ＮＳ３区抗原表位分析及融合基因表达逯好英徐东刚朱分禄孟文华孟庆华军事医学科学院基础医学研究所北京１００８５０丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）区及ＮＳ３区抗原是第二代抗－ＨＣＶ抗体诊断试剂的主要组分。核心蛋白（Ｃ２２）含有１９１个氨基酸，...

关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白 ns3蛋白抗原

庚型肝炎病毒ns_3蛋白片段在大肠杆菌中的表达及免疫反应性

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中华肝脏病杂志 1998年第1期6卷 18-20页

作者：张建军黄爱龙罗娅张定凤四川泸州医学院附属医院传染病科 646000 重庆医科大学病毒性肝炎研究所

目的初步研究庚型肝炎病毒 ns_3蛋白片段在大肠杆菌中的表达及其免疫反应性。方法采用 RT-PCR和基因重组技术从中国重庆市的庚型肝炎病毒(HGV)感染者血清中分离出 HGV-ns_3区基因,定向克隆到质粒 pQE-30中,构建高效表达质粒 pQE-ns_3,... 详细信息

目的初步研究庚型肝炎病毒 ns_3蛋白片段在大肠杆菌中的表达及其免疫反应性。方法采用 RT-PCR和基因重组技术从中国重庆市的庚型肝炎病毒(HGV)感染者血清中分离出 HGV-ns_3区基因,定向克隆到质粒 pQE-30中,构建高效表达质粒 pQE-ns_3,并在大肠杆菌中表达重组 ns_3蛋白。结果经 ELISA 鉴定,该重组蛋白能特异性地与血清中的 ns_3特异性 IgG 型抗体结合。结论重组 ns_3蛋白经进一步纯化后,可用于血清学检测。

关键词： HGV ns3蛋白免疫反应性庚型肝炎大肠杆菌

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丙型肝炎

传染病网络动态 2005年第5期 99-102页

丙型肝炎病毒不同基因型ns3蛋白的抗原异质性分析——乔伟振等(江苏无锡市第一人民医院中心实验室214001)《中华微生物学和免疫学杂志》2005，25(1)：10-14（探讨不同基因型丙型肝炎病毒(HCV)ns3蛋白的抗原特性及其用于抗．HCV检测的意... 详细信息

丙型肝炎病毒不同基因型ns3蛋白的抗原异质性分析——乔伟振等(江苏无锡市第一人民医院中心实验室214001)《中华微生物学和免疫学杂志》2005，25(1)：10-14（探讨不同基因型丙型肝炎病毒(HCV)ns3蛋白的抗原特性及其用于抗．HCV检测的意义。方法：分别构建和表达含有HCVl型和6型ns3基因片段的重组质粒和重组蛋白，以ELISA法和Westernblot分析不同基因型重组蛋白与已知抗．HCV阳性血清的抗原反应性。结果：HCV1型和6型ns3重组蛋白氨基酸序列的同源性为83．2％；85份抗-HCV阳性血清以此不同基因型HCVns3单片段抗原检测，

关键词：丙型肝炎病毒(HCV) Westernblot HCV阳性血清不同基因型 ns3蛋白第一人民医院重组蛋白 ELISA法中心实验室 HCV检测抗原反应性氨基酸序列微生物学抗原特性重组质粒基因片段抗原检测免疫学无锡市异质性同源性