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RNAi沉默Nrf2基因增强煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞的毒性作用

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郑州大学学报（医学版） 2018年第1期53卷 25-29页

作者：曹会敏倪静玉崧成冯斐斐吴拥军郑州大学公共卫生学院卫生毒理学教研室郑州450001

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Nrf2基因对煤焦沥青烟提取物(CTPE)致人支气管上皮细胞(BEAS-2B)发生恶性转化过程中的作用,为肺癌的发生机制提供线索。方法:应用RNAi技术建立Nrf2基因沉默的BEAS-2B细胞稳定表达株;设立二甲基亚砜(DMSO... 详细信息

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Nrf2基因对煤焦沥青烟提取物(CTPE)致人支气管上皮细胞(BEAS-2B)发生恶性转化过程中的作用,为肺癌的发生机制提供线索。方法:应用RNAi技术建立Nrf2基因沉默的BEAS-2B细胞稳定表达株;设立二甲基亚砜(DMSO)阴性对照组、苯并(a)芘[B(a)P]阳性对照组、CTPE组、RNAi组;采用软琼脂克隆形成实验分析细胞恶变情况;采用RT-PCR法检测Nrf2和nqo1 mRNA的表达;Western blot法检测Nrf2和nqo1蛋白的表达。结果:20代以后,B(a)P组、CTPE组和RNAi组的克隆形成率高于DMSO组(P1);而RNAi组的克隆形成率高于B(a)P组和CTPE组(P1)。B(a)P组和CTPE组Nrf2 mRNA和蛋白表达水平均较DMSO组增加(P1),B(a)P组、CTPE组和RNAi组nqo1 mRNA和蛋白水平均较DMSO组上调,RNAi组的表达量低于B(a)P组和CTPE组(P1);诱导后(CTPE组)第10代、20代、30代细胞中Nrf2与nqo1的蛋白表达呈正相关(r=0.913,P1)。结论:Nrf2可能通过上调nqo1的表达对抗CTPE对BEAS-2B细胞的毒性作用从而抑制细胞恶化;Nrf2和nqo1在BEAS-2B细胞癌前病变阶段已呈现较明显表达,这可能有助于接触CTPE高危人群罹患肺癌的预警及筛查。

关键词： RNAi 煤焦沥青烟提取物 BEAS-2B细胞 Nrf2 nqo1

苯并芘在慢性阻塞性肺疾病转化肺腺癌过程中的作用及机制研究

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苯并芘在慢性阻塞性肺疾病转化肺腺癌过程中的作用及机制研究

作者：陈琪内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的:本实验欲探究慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonarydisease,COPD)转化为肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LAC)过程中起关键作用的基因表达变化以及涉及的生物过程。同时明确苯并芘(Benzo[a]pyrene,Ba P)在COPD转化为LAC过程中的作用及其机制。方法:1.借助基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus data base,GEO)收录的COPD和LAC的基因芯片数据,筛选两种疾病与各自对照组的差异表达基因,进行分类分析。2.对于筛选基因进行功能分析、表达验证、免疫浸润分析、蛋白互作分析及通路富集等常规生物信息学分析。3.使用烟雾提取物(Cigarette smoke extract,CSE)联合脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)建立体外COPD模型。4.借助CCK-8、Transwell侵袭实验、划痕实验进行细胞的增殖、侵袭及迁移能力检测,使用q PCR和Western Blot实验观察细胞的增殖、凋亡以及EMT等的相关指标变化,明确Ba P对体外COPD模型肿瘤特性的影响。nqo1作为在两种疾病中表达趋势相反的独特基因,观察nqo1在COPD模型暴露于Ba P前后的变化情况。5.通过分别添加nqo1的激动剂(t BHQ)和抑制剂(DIC)的实验方法明确nqo1对A549细胞增殖、凋亡、迁移以及EMT的影响。6.通过敲低nqo1基因后再使用Ba P处理细胞的实验手段,明确Ba P是否通过nqo1对细胞增殖、凋亡、迁移以及EMT产生影响。结果:1.经过筛选得到GSE151052、GSE118370及GSE140797数据集。GSE151052包括77个COPD样本和40个对照样本,GSE140797包括7对LAC组织以及对照组织样本,GSE118370包括6对LAC组织和对照组织样本。疾病组相对于各自对照组差异表达结果为,GSE151052上调基因52个,下调基因44个;GSE118370上调基因245个,下调基因152个;GSE140797上调基因1291个,下调基因1483个。分类分析发现COPD上调且LAC下调基因为RTKN2、SLC6A4、HBB;COPD下调且LAC上调基因为nqo1;COPD及LAC均上调基因,在筛选条件下未有目标基因;COPD及LAC均下调基因,共有基因为FPR1、LYVE1、PKHD1L1。2.目标富集到的主要通路为细胞周期、EMT、PI3K/AKT及细胞凋亡等。在GEPIA收录的数据中,相对于对照组,在LAC中PKHD1L1、FPR1、LYVE1、RTKN2、HBB、SLC6A4显著下调(Pnqo1上调(P100 ng/m L LPS+10%CSE刺激时,根据COX-2的表达提示体外COPD模型建立成功。4.与对照组相比,Ba P组的细胞增殖数量和侵袭细胞数增加(P1),迁移距离进一步缩短(P1)。进一步发现nqo1在COPD模型中以及Ba P的刺激下表达趋势不一致,与对照组相比,COPD模型中的nqo1表达降低(P1),Ba P组的nqo1表达升高(P1);与COPD模型相比,COPD+Ba P组的nqo1表达明显升高(P1)。其次与对照组相比,COPD以及Ba P组的PCNA,Vimentin以及Snail的表达明显升高(P1);与COPD组相比,COPD+Ba P组的PCNA,Vimentin以及Snail表达升高(P1)。5.与对照组相比,当受到t BHQ刺激后,细胞的增殖能力以及侵袭活性增加(P1),迁移距离缩小(P1);与t BHQ组相比,t BHQ+DIC组细胞的增殖以及侵袭能力有所下降(P1),同时迁移距离增加(Pnqo1、PCNA、Vimentin以及Snail表达明显升高(P1),Caspase-3以及E-cadherin表达明显降低(P1)。与t BHQ组相比,t BHQ+DIC组的N

关键词：慢性阻塞性肺疾病肺腺癌苯并芘转化 nqo1

Nrf2与肝细胞凋亡在非酒精性脂肪性肝病小鼠中的作用及相互关系

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Nrf2与肝细胞凋亡在非酒精性脂肪性肝病小鼠中的作用及相互关系

作者：孙健山东大学

学位级别：硕士

背景与目的：非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是最常见的导致肝功能紊乱的疾病之一。NAFLD包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化等肝损伤各个阶段,指的是无过量饮酒史,肝细胞内甘油三酯沉积,出... 详细信息

背景与目的：非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是最常见的导致肝功能紊乱的疾病之一。NAFLD包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化等肝损伤各个阶段,指的是无过量饮酒史,肝细胞内甘油三酯沉积,出现脂肪变性,伴随着肝内炎症和纤维化反应,导致肝细胞坏死、凋亡,最终可能发展成为肝硬化或肝癌的一类疾病,有研究表明肝细胞凋亡可能在其疾病的发展过程中起促进作用。核因子相关因子-2（NF-E2-related Factor 2, Nrf2）作为新近发现的转录因子,几乎存在于各种细胞中,国内外许多文献表明它在肝脏疾病中也起着重要作用,通过调节肝内细胞抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶,如NADPH醌氧化还原酶1[NAD（P）H quinine oxidoreductasel, nqo1)]等的表达来发挥抗氧化应激、减轻肝脏炎症、抗肝细胞凋亡等作用。因此,Nrf2有可能在NAFLD以后的临床治疗中发挥关键作用,其在NAFLD的病程进展中的作用及意义值得深入研究,且Nrf2在NAFLD发生发展过程中与肝细胞凋亡、增殖的关系未见报道。本课题采用高脂饮食构建非酒精性脂肪性肝病的小鼠模型,通过检测Nrf2、nqo1、肝细胞凋亡及增殖（Ki-67）在NAFLD发生发展过程中表达情况,旨在探讨Nrf2、肝细胞凋亡在NAFLD病程进展中的作用,明确Nrf2对肝细胞凋亡、增殖的影响,从Nrf2的角度出发为NAFLD临床治疗提供可能的新思路。方法：将24只清洁级雌性小鼠随机分为三组：正常对照组8只、8周高脂实验组（nonalcoholic fatty liver group, NAFL组）8只和12周高脂实验组（nonalcoholicsteatohepatitis group,NASH组）8只,对照组给予普通饲料喂养8周,NAFL组和NASH组分别给予高脂饮食喂养8周和12周,3组小鼠均分笼饲养在温度22-26℃的动物室内,自由进食饮水。于8周末处死对照组和NAFL组,12周末处死NASH组小鼠,处死时以10%的水合氯醛（3-5ml/kg）腹腔注射麻醉,迅速摘取肝脏用10%的甲醛固定,制作石蜡切片,用HE染色法观察肝脏组织病理学改变,免疫组化法检测肝组织中Nrf2、nqo1、Ki-67的表达情况,TUNEL法检测肝细胞凋亡。结果： 1.高脂饮食组小鼠肝脏较对照组有明显的病理改变,NAFL组小鼠出现轻至中度脂肪变性,NASH组出现脂肪性肝炎,小鼠肝细胞脂肪变性程度及炎症程度均加重（p＜0.05）;2.高脂饮食组小鼠Nrf2、nqo1表达和肝细胞凋亡均明显高于同期对照组（p＜0.05）,NASH组Nrf2、nqo1表达和肝细胞凋亡与NAFL组相比都有明显的上升（p＜0.05）;***组Ki-67表达高于NAFL组、对照组（p＜0.05）,NAFL组Ki-67与对照组无明显变化p＞0.05);***2表达与脂肪变性程度、炎症程度呈正相关（r=0.948,r=0.850,p＜0.01）,凋亡程度与脂肪变性程度、炎症程度呈正相关（r=0.731,r=0.786,p＜0.01）,且Nrf2的表达与肝细胞凋亡、Ki-67、nqo1表达呈正相关（r=0.754,r=0.640,r=0.805,p＜0.01）。结论： 1.在病情进展过程中,小鼠肝脏炎症程度及脂肪变性程度均较前增加,肝细胞凋亡增加,Nrf2表达增强,RNrf2和肝细胞凋亡与脂肪变性程度和炎症程度呈正相关,说明Nrf2与肝细胞凋亡可能对NALFD病情进展起重要作用。 ***2与肝细胞凋亡呈正相关,提示Nrf2可能通过影响肝细胞凋亡发挥其保护作用。 3.随着NAFLD病情发展,nqo1表达增强,Nrf2与nqo1的表达呈正相关,说明Nrf2可能通过抗氧化酶nqo1发挥作用。 4.随着病情进展,Ki-67表达增加,且Nrf2与Ki-67表达呈正相关,表明Nrf2可能影响肝细胞增殖。

关键词：核因子相关因子-2 非酒精性脂肪性肝病细胞凋亡 Ki-67 nqo1

PARP抑制剂Rucaparib增强β-lapachone诱导胰腺癌细胞的细胞焦亡

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PARP抑制剂Rucaparib增强β-lapachone诱导胰腺癌细胞的细胞焦亡

作者：张恒策福建医科大学

学位级别：硕士

目的:靶向药物杀死癌细胞是临床中治疗胰腺癌(PAAD)的手段之一,其中,nqo1已被作为药物靶点之一。nqo1在大多数实体癌症中过表达,是非常理想的癌症治疗靶点。β-拉帕酮(β-lapachone,β-lap),一种nqo1生物活性药物,是FDA批准用于临床试... 详细信息

目的:靶向药物杀死癌细胞是临床中治疗胰腺癌(PAAD)的手段之一,其中,nqo1已被作为药物靶点之一。nqo1在大多数实体癌症中过表达,是非常理想的癌症治疗靶点。β-拉帕酮(β-lapachone,β-lap),一种nqo1生物活性药物,是FDA批准用于临床试验的药物。当前已有许多研究表明,β-lap会引发nqo1+细胞程序性坏死并且激活机体CD8+T细胞,因此,β-lap的免疫刺激特性和肿瘤选择性使其成为有发展前景的化合物。然而,在这一抗肿瘤过程中,β-lap对免疫激活的作用机制尚不清楚。并且前期临床试验数据表明有必要降低β-lap剂量限制其毒性。因此,β-lap对抗nqo1+肿瘤的确切机制需要进一步阐明。本研究旨在研究β-lap单处理和β-lap与PARP抑制剂Rucaparib共处理对nqo1+胰腺癌细胞死亡的影响及其机制,寻找新的潜在靶点,为临床肿瘤药物靶向治疗提供新的治疗思路。方法:1.通过对多个胰腺癌细胞株的药物浓度筛选,确定nqo1的靶向作用;2.通过流式细胞术对β-lap引起的细胞死亡进行分析;3.通过检测试剂盒测定NAD+、ATP和H2O2含量的变化,并通过蛋白免疫印迹验证β-lap无效氧化循环圈的产生;4.采用免疫荧光共定位、流式细胞术和蛋白免疫印迹探索细胞线粒体形态及相关蛋白的变化;5.通过酶联免疫吸附测定试剂盒、蛋白免疫印迹对细胞焦亡通路蛋白的分析;结果:1.利用生物信息学统计分析数据库发现,相比于正常胰腺组织,nqo1、GSDMD、GSDME在胰腺癌组织中的mRNA水平更高;***1+胰腺癌细胞株MiaPaCa2与BxPC3在5 μM β-lap致死率超过80%,HS766T也在7 μM β-lap致死率接近80%,而nqo1-胰腺癌细胞株几乎对β-lap不敏感;流式结果表明,细胞死亡百分比与β-lap剂量呈正相关;3.高浓度β-lap处理后,nqo1+细胞通过无效氧化循环圈,产生大量ROS,并会过度激活PARP1行使DNA修复作用,导致大量NAD+、ATP的消耗;4.β-lap可引起线粒体膜电位下降;呼吸链部分相关蛋白mRNA表达水平下降;免疫荧光定位和蛋白免疫印迹表明,在β-lap作用下线粒体形态由纤维状变成粉末状;5.β-lap处理会诱导Caspase1 P20和GSDMD-N的切割条带的出现,并释放IL-18和 IL-1β;6.β-lap与Rucaparib共处理后,可有效降低β-lap致死剂量,提高MiaPaCa2细胞对β-lap的敏感性,并产生了具有活性的Caspase3条带,以及GSDME-N切割条带的出现,同时IL-18和IL-1β释放量也高于β-lap单处理组。结论:1.高浓度β-lap通过无效氧化循环圈,靶向使nqo1+胰腺癌细胞死亡;2.高剂量β-lap引起线粒体形态破坏和呼吸链相关功能紊乱;3.β-lap导致nqo1+胰腺癌细胞死亡有Capase1/GSDMD细胞焦亡途径的参与,并释放炎症因子;4.β-lap与Rucaparib共处理,有效降低β-lap有效剂量,并激活了 Caspase3/GSDME焦亡通路。

关键词： β-lap nqo1 胰腺癌细胞细胞凋亡细胞焦亡

褪黑素抑制铁死亡保护APAP诱导肝损伤的机制研究

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褪黑素抑制铁死亡保护APAP诱导肝损伤的机制研究

作者：吴坤山东大学

学位级别：硕士

对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）是一种使用非常广泛的解热镇痛类药物。不合理用药和一些偶然因素作用下,服用APAP会导致肝脏损伤,肝脏损伤严重者甚至可能会发生急性肝衰竭。APAP诱导的肝细胞死亡与细胞抗氧化系统紊乱导致的脂质过... 详细信息

对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）是一种使用非常广泛的解热镇痛类药物。不合理用药和一些偶然因素作用下,服用APAP会导致肝脏损伤,肝脏损伤严重者甚至可能会发生急性肝衰竭。APAP诱导的肝细胞死亡与细胞抗氧化系统紊乱导致的脂质过氧化物过度产生有关。铁死亡（ferroptosis）是依赖于铁与氧化应激相关细胞的死亡方式,其不同于经典细胞死亡,如凋亡和坏死。铁死亡有独特的形态学特征,其主要包括线粒体嵴溶解和线粒体轮廓变小等。此外,脂质过氧化物在细胞内积聚是铁死亡发生的直接因素。细胞内铁离子和活性氧所介导的芬顿反应（Fenton reaction）进一步促进脂质过氧化物在细胞内积聚。铁离子螯合剂能明显抑制铁死亡。APAP诱导而受损的小鼠肝脏存在大量脂质过氧化物的积累,并伴随着细胞内铁的蓄积,近来研究发现铁死亡在其中发挥重要作用。褪黑素（melatonin）是松果体产生的一种高效的抗氧化物质。褪黑素具有直接和间接的抗氧化和自由基清除的生物活性。褪黑素可以抑制肝损伤和肝细胞氧化应激,提高APAP诱导的肝损伤小鼠生存能力,但机制研究还不透彻。本课题旨在研究褪黑素对APAP诱导的肝细胞死亡进程中对铁死亡这一过程的影响。1.本研究首先考察了褪黑素对APAP肝损伤小鼠的保护作用。使用C57BL/6J小鼠和400 mg/kgAPAP建立APAP肝损伤模型。从肝功能与病理学损伤和过氧化指标方面检验褪黑素的肝脏保护作用,然后探讨褪黑素是否通过铁死亡途径发挥肝脏保护作用。以铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）作为阳性药物,设置正常对照组、APAP模型组、Fer-1（5 mg/kg）组以及褪黑素高（100 mg/kg）、低剂量（25 mg/kg）组。褪黑素与Fer-1的给药方式分别为灌胃和腹腔注射。（1）采用小鼠血清转氨酶（ALT和AST）为肝功能指标检测肝脏损伤程度。结果发现,相比于正常组,APAP组的ALT和AST水平显著上升（P＜0.01,P＜0.01）;相比于APAP组,高低剂量褪黑素组的ALT和AST水平显著降低（P＜0.01,P＜0.05;P＜0.01,P＜0.05）;相比于 APAP 组,Fer-1 组 ALT 和AST水平显著降低（P＜0.05,P＜0.05）。该结果表明褪黑素对APAP诱导小鼠ALI有显著的保护作用。（2）分别采用H＆E和TUNEL染色法检测小鼠肝组织损伤的病理学特征。结果发现,APAP诱导ALI模型小鼠的肝脏组织出现明显坏死、出血等病理特征,而高和低剂量褪黑素均能很好缓解这些病理损伤;Fer-1也同样缓解这些病理损伤。（3）采用微板法分别检测了肝脏丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽（GSH）水平,以评估肝脏过氧化状态。结果发现,APAP诱导的C57小鼠肝脏组织中MDA水平明显上升（P＜0.01）,同时显著耗竭肝脏GSH（P＜0.01）,而高和低剂量褪黑素均能明显降低MDA水平,同时能明显提高GSH水平（P＜0.05,P＜0.05;P＜0.05,P＜0.05）;相比于APAP组,Fer-1也能显著降低MDA水平,同时显著提高肝脏GSH水平（P＜0.05,P＜0.05）。（4）采用RT-PCR检测了铁死亡的生物标志--前列腺素内过氧化物合成酶2（Ptgs2）mRNA水平急剧升高。结果发现,APAP诱导的肝脏组织内Ptgs2 mRNA含量明显上升（P＜0.01）。相比于APAP模型组,高和低剂量褪黑素组均能明显降低Ptgs2 mRNA水平（P＜0.01,P＜0.01）;相比于APAP模型组,Fer-1组也能明显降低肝脏Ptgs2 mRNA水平（P＜0.05）。（5）采用透射电镜观察了 C57小鼠肝细胞线粒体的铁死亡相关特征结构变化。结果发现,APAP诱导的ALI小鼠肝脏组织中出现典型的铁死亡相关细胞线粒体病理性改变,包括线粒体明显增大和线粒体嵴损伤等;对于高、低剂量褪黑素组铁死亡相关线粒体的病理改变有显著改善;Fer-1同样改善了线粒体病理变化。以上结果表明,400mg/kg APAP诱导的C57小鼠肝脏发生铁死亡,褪黑素与铁死亡选择性抑制剂Fer-1均可以抑制APAP诱导C57小鼠肝细胞铁死亡,从而发挥保护肝脏的作用。2.采用APAP的HepaRG肝细胞铁死亡模型,进一步考察了褪黑素对该肝细胞毒性的保护作用。（1）采用细胞存活率分析（CCK-8法）的方法筛选确立Fer-1对APAP诱导HepaRG铁死亡的最佳保护浓度。结果发现,DFO在20 μM、Fer-1在1 μM,褪黑素在50 μM分别对10 mM APAP对HepaRG肝细胞损伤有显著的保护作用;。（2）在此基础上,检测MDA以考察该模型HepaRG细胞内脂质过氧化物的积聚情况,以探讨褪黑素对肝细胞的保护作用以及对铁死亡的影响。结果发现,

关键词：铁死亡对乙酰氨基酚急性肝损伤褪黑素脂质过氧化 Nrf2 nqo1

雷公藤甲素衍生物CX-23的抗肺癌活性及在大鼠体内的药代动力学研究

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雷公藤甲素衍生物CX-23的抗肺癌活性及在大鼠体内的药代动力学研究

作者：徐玲湖北大学

学位级别：硕士

肺癌的全球发病率和死亡率分别位于第二位和第一位,因此肺癌也被称为“群癌之首”。目前,治疗肺癌的药物均出现了一定的副作用和耐药性。雷公藤甲素(triptolide,TP)是一种从植物中提取分离的具有抑制多种肿瘤增殖活性的环氧二萜内酯化合... 详细信息

肺癌的全球发病率和死亡率分别位于第二位和第一位,因此肺癌也被称为“群癌之首”。目前,治疗肺癌的药物均出现了一定的副作用和耐药性。雷公藤甲素(triptolide,TP)是一种从植物中提取分离的具有抑制多种肿瘤增殖活性的环氧二萜内酯化合物,但因其毒性较大、水溶性低限制了其临床研究。课题组前期合成的TP衍生物CX-23在体内外均具有良好的抗肝癌活性。在前期研究基础上,本课题组进一步研究CX-23的抗肺癌活性及其体内外代谢特征,并开展系列工作:(1)体内外实验研究CX-23抗肺癌活性。通过MTT法测定了其抑制A549肺癌细胞增殖活性,实验结果表明,在等摩尔浓度下CX-23对肺癌细胞的抑制活性与TP相当,其IC为52.4 n M。体内抗肺癌活性研究表明,与对照组相比,CX-23能显著性抑制肺肿瘤的增殖。(2)探究CX-23体外代谢稳定性。CX-23与肺癌细胞匀浆液温孵的结果表明,CX-23在肺癌细胞匀浆液中能很快被代谢,代谢产物为CX-21和TP,半衰期为4.27 min。CX-23与正常大鼠肺组织、脑组织匀浆液温孵的结果表明,CX-23在正常肺组织、脑组织中十分稳定,不被代谢。同时研究了CX-23在肺癌脑转移组织匀浆液中的代谢转化,研究结果显示CX-23在肺癌脑转移组织匀浆液中能被代谢转化生成TP和CX-21,而在正常脑组织中不被代谢转化。(3)评价CX-23在大鼠体内的药代动力学性质。结果表明大鼠经腹腔注射后CX-23能够快速被吸收、分布、消除,其半衰期分别为9 min、26.9 min、4.42 h。化合物进入体内后在5 min达到最大血药浓度,达峰浓度为124μg/L。静脉注射给药后,药物表观分布容积(Vd值)达到73.2 L/kg,表明药物在体内分布很广。腹腔注射后CX-23在大鼠体内的生物利用度为12.3%。腹腔注射和静脉注射后脑组织中AUC和血浆中AUC的比值分别为12.5%、13.1%,表明CX-23能够透过血脑屏障进入脑组织,对肺癌脑转移患者有潜在治疗效果。(4)CX-23载体的结构优化与初筛:药代结果显示CX-23生物利用度极低且化合物水溶性较低需进一步改造。为保持其良好的抗肿瘤活性,我们对载体结构进行进一步的结构修饰。我们设计并合成了7种载体衍生物,通过计算机虚拟筛选,对接结果显示CX-12及CX-92能更充分填充受体口袋,与受体结合更加稳定。通过MTT法对载体衍生物在体内产生的还原产物进行毒性评价,结果显示均无明显毒性。

关键词：抗肺癌活性 CX-23 nqo1 药代动力学靶向抗肿瘤药物载体

罗格列酮对凝血酶激活的小胶质细胞PPARγ表达的影响及其抗氧化应激机制

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罗格列酮对凝血酶激活的小胶质细胞PPARγ表达的影响及其抗氧化应...

作者：杭航贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:体外原代培养新生大鼠脑小胶质细胞,采用凝血酶激活,观察罗格列酮预处理对小胶质细胞PPARγ、Nrf2、HO-1、nqo1、γ-GCS表达的影响,探讨罗格列酮预处理对凝血酶激活小胶质细胞抗氧化的反应机制。方法:用新生的SD大鼠的脑组织,体外... 详细信息

目的:体外原代培养新生大鼠脑小胶质细胞,采用凝血酶激活,观察罗格列酮预处理对小胶质细胞PPARγ、Nrf2、HO-1、nqo1、γ-GCS表达的影响,探讨罗格列酮预处理对凝血酶激活小胶质细胞抗氧化的反应机制。方法:用新生的SD大鼠的脑组织,体外培养原代神经胶质细胞,14 d左右分离收集小胶质细胞,进行小胶质细胞鉴定成功,分为5组:正常对照组(对照组)、凝血酶刺激组(刺激组)、罗格列酮干预组(罗格列酮+凝血酶组)、维甲酸干预组(维甲酸+凝血酶组)、莱菔硫烷干预组(莱菔硫烷+凝血酶组)进行实验。对照组加入与刺激组所加凝血酶等体积的培养基,刺激组予凝血酶(20U/ml)处理24h,罗格列酮干预组用罗格列酮(25?mmol/L)预处理1h后再用凝血酶(20U/ml)刺激小胶质细胞24h,维甲酸干预组用维甲酸(1?mmol/L)预处理1 h后再用凝血酶(20 U/mL)刺激小胶质细胞24 h,莱菔硫烷干预组用莱菔硫烷(5?mmol/L)预处理1h后再用与刺激组等量凝血酶刺激小胶质细胞24h。分别采用免疫组化染色、real time-PCR、Western-blot检测各组PPARγ、Nrf2、HO-1、nqo1、γ-GCS的表达并进行统计分析。结果:免疫组化染色显示,与对照组比较,刺激组、罗格列酮+凝血酶组、维甲酸+凝血酶组及莱菔硫烷+凝血酶组的PPARγ、Nrf2、HO-1、nqo1、γ-GCS染色细胞数均增多;real time-PCR结果显示罗格列酮+凝血酶组PPARγmRNA表达均显著高于对照组、刺激组、维甲酸+凝血酶组及莱菔硫烷+凝血酶组(P1);莱菔硫烷+凝血酶组Nrf2、HO-1、nqo1、γ-GCS的mRNA表达均较对照组、刺激组、罗格列酮+凝血酶组及维甲酸+凝血酶组升高(P1);Western blot结果显示,罗格列酮+凝血酶组PPARγ的蛋白表达也明显高于对照组、刺激组、维甲酸+凝血酶组及莱菔硫烷+凝血酶组(P1);莱菔硫烷+凝血酶组Nrf2、HO-1、nqo1、γ-GCS的蛋白表达均较对照组、刺激组、罗格列酮+凝血酶组及维甲酸+凝血酶组升高(P1)。结论:罗格列酮可增加凝血酶激活的小胶质细胞PPARγ、Nrf2、HO-1、nqo1、γ-GCS的表达,通过维甲酸预处理抑制Nrf2以及莱菔硫烷预处理活化Nrf2的表达后,其下游基因HO-1、nqo1、γ-GCS表达受影响,PPARγ抗氧化作用可能是通过Nrf2调控下游基因实现的。

关键词：小胶质细胞罗格列酮凝血酶 PPARγ Nrf2 HO-1 nqo1 γ-GCS

曲克芦丁对糖尿病大鼠认知功能障碍及海马NAD（P）H：醌氧化物还原酶1的影响

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曲克芦丁对糖尿病大鼠认知功能障碍及海马NAD（P）H：醌氧化物还...

作者：康亚星河北医科大学

学位级别：硕士

目的：糖尿病认知功能障碍为血糖异常引起的学习、记忆、计算等认知能力的损害，其中糖尿病导致的氧化应激与抗氧化应激系统之间的失衡参与了疾病的发生、发展过程。酶类抗氧化系统中NAD(P)H:醌氧化物还原酶1(nqo1)为黄素类蛋白酶，亦... 详细信息

目的：糖尿病认知功能障碍为血糖异常引起的学习、记忆、计算等认知能力的损害，其中糖尿病导致的氧化应激与抗氧化应激系统之间的失衡参与了疾病的发生、发展过程。酶类抗氧化系统中NAD(P)H:醌氧化物还原酶1(nqo1)为黄素类蛋白酶，亦为保护性还原酶,当机体受到氧化应激刺激时，nqo1表达增多，从而增强机体的抗氧化能力。本实验重点观察糖尿病大鼠出现认知功能障碍时海马中nqo1的变化以及具有抗氧化作用的中药曲克芦丁对糖尿病认知功能障碍的影响。方法：雄性Sprague Dawley(SD)大鼠70只，体重15070g，随机分为正常对照组(NC组，n=10)，糖尿病组(DM组，n=60),普通饲料适应性喂养1周，禁食12小时后，DM组大鼠腹腔内一次性注射1%链脲佐菌素(STZ)60mg/kg，NC组大鼠腹腔内一次性注射等体积柠檬酸缓冲液，72小时尾静脉取血测定血糖，≥16.7mmol/L为造模成功，后每周测血糖，若＜16.7mmol/L则剔除。造模成功后分别于第1周、12周时对NC组、DM组大鼠进行Morris水迷宫测试，第12周水迷宫测试结束后将DM组大鼠随机分为糖尿病对照组(DC组，n=15)、糖尿病盐水组(DN组，n=15)、曲克芦丁干预组(DT组,n=15)、α-硫辛酸干预组(DL组,n=15)，第13周时DT组大鼠给予腹腔注射曲克芦丁***，DL组大鼠给予腹腔注射α-硫辛酸注射液***，DN组、NC组各给予等体积生理盐水，干预6周，第18周时各组行Morris水迷宫测试后，处死大鼠取海马，应用实时荧光定量-聚合酶链反应法(Real-time PCR)及蛋白质免疫印迹法(Western-blot)分别检测海马中nqo1mRNA和蛋白的表达水平，同时采用黄嘌呤氧化酶法测定海马中超氧化物歧化酶(SOD)活力，硫代巴比妥法测定海马中丙二醛(MDA)含量。所得数据均采用SPSS13.0统计软件包处理，应用重复测量方差分析、多元方差分析及完全随机设计的单因素方差分析统计数据，用均数±标准差表示统计结果，p＜0.05为差异有统计学意义。结果： 1.一般观察糖尿病组大鼠于造模成功后出现明显的多尿、多饮、多食、体重下降，随着实验的进行，糖尿病大鼠血糖波动于较高水平(＞20.0mmol/L)，同时出现毛色枯黄、皮肤变薄、精神萎靡、易激惹现象。干预过程中DT组大鼠一般情况优于DL组。正常对照组大鼠生长状态及营养情况良好，无上述糖尿病症状。 2.血糖及体重的变化造模前DM组与NC组相比,大鼠的血糖及体重均无统计学差异(p＞0.05)，干预结束时(第18周)，DC组(28.29±2.79)、DN组(29.25±3.18)、DT组(27.77±2.66)、DL组(30.54±3.31)大鼠血糖均明显高于NC组(7.63±0.77，p＜0.01)，但体重均明显低于NC组大鼠同期体重(p＜0.01)。干预结束时，糖尿病组各亚组间(DC、DN、DT、DL)大鼠血糖及体重均无统计学差异(p＞0.05)。 3. Morris水迷宫测试结果第1周时Morris水迷宫测试结果显示：与NC组相比，DM组大鼠逃避潜伏期无统计学差异(p＞0.05)，说明两组大鼠认知功能无差异。第12周干预结束时Morris水迷宫测试结果显示：与NC组相比，DM组大鼠逃避潜伏期明显延长(p＜0.05)，在相同时间点两组逃避潜伏期有统计学差异(p＜0.05)，证明第12周时糖尿病大鼠出现了认知功能障碍。第18周干预结束后水迷宫测试结果显示：与NC组相比，DC、DN、DT、DL组大鼠逃避潜伏期均延长(p＜0.05);与DC/DN组相比，DT、DL组大鼠逃避潜伏期均显著缩短(p＜0.05);DT组与DL组相比，DC组与DN组相比，大鼠逃避潜伏期均无统计学差异(p＞0.05)。 4.海马中nqo1mRNA的表达 Real-time PCR显示：与NC组(1.00±0.00)相比，DC组(0.70±0.04)DN组(0.72±0.08)大鼠海马中nqo1mRNA表达量明显减少(p＜0.05);与DC/DN组相比，DT组(1.18±0.09)、DL组(1.13±0.05)大鼠海马中nqo1mRNA表达量均明显增加(p＜0.05);DT组与DL组相比，DN组与DC组相比，海马中nqo1mRNA表达量均无统计学差异(p＞0.05)。 5.海马中nqo1蛋白的表达 Western-blot显示：与NC组(1.00±0.00)相比，DC组(0.44±0.05)、DN组(0.44±0.04)大鼠海马中nqo1蛋白表达量明显减少(p＜0.01);与DC/DN组相比，DT组(1.14±0.05)、DL组(1.19±0.05)大鼠海马中nqo1蛋白表达量明显增加(p＜0.0

关键词： α-硫辛酸曲克芦丁糖尿病认知障碍海马 nqo1

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抗氧化应激作用及对IL-6和IL-12的抑制作用初步研究

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沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抗氧化应激作用及对IL-6和IL-12的抑制作...

作者：李群南华大学

学位级别：硕士

目的:探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct.)pORF5质粒蛋白能否通过上调宿主细胞nqo1的表达抑制氧化应激反应及IL-6和IL-12的产生,为进一步阐明pORF5质粒蛋白在Ct的致病机制中的作用提供理论依据。方法:pGEX-6p-1/pORF5重组质粒转... 详细信息

目的:探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct.)pORF5质粒蛋白能否通过上调宿主细胞nqo1的表达抑制氧化应激反应及IL-6和IL-12的产生,为进一步阐明pORF5质粒蛋白在Ct的致病机制中的作用提供理论依据。方法:pGEX-6p-1/pORF5重组质粒转化的大肠杆菌*** XLl-blue接种至含Amp的LB固体平板,扩大培养后经IPTG诱导表达GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白用Glutathione Sepharose 4B纯化及PreScission Protease切除GST标签后得到pORF5质粒蛋白,SDS-PAGE及Western blotting分析并鉴定GST-pORF5融合蛋白和pORF5质粒蛋白。BCA法测定pORF5质粒蛋白浓度,多粘菌素B处理去除内毒素。以不同浓度(0、5、10、15 μg/mL)pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞24 h及最佳浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞不同时间(0、6、12、18、24 h)后,RT-qPCR 检测 HeLa 细胞 nqo1的mRNA转录水平,Western blotting检测HeLa细胞nqo1的蛋白表达情况;收集不同浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞18 h的细胞或培养液上清,LPS刺激为阳性对照组,分别检测丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)及总抗氧化能力(T-AOC);10 μg/mL pORF5质粒蛋白刺激感染Ct的HeLa细胞不同时间,并以相同时间点PBS处理感染衣原体的HeLa细胞作为对照,分别检测MDA、T-SOD及T-AOC,间接免疫荧光法检测包涵体形成;不同浓度pORF5质粒蛋白刺激经PMA处理的THP-1细胞24 h及最佳浓度pORF5质粒蛋白刺激经PMA处理的THP-1细胞不同时间,收集细胞培养液上清,ELISA分别检测IL-6和IL-12的水平。10 μg/mL pORF5质粒蛋白刺激经siRNA-nqo1干扰nqo1表达的HeLa细胞及未干扰的对照细胞18 h后,分别检测MDA、T-SOD及T-AOC;15μg/mL pORF5质粒蛋白刺激经siRNA-nqo1干扰nqo1表达的THP-1细胞及未干扰的对照细胞18 h后,ELISA分别检测IL-6和IL-12的水平。结果:***-6p-1/pORF5重组质粒转化菌经诱导表达分子量约为54 kDa的GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经纯化及切除GST标签后得到分子量约为28 kDa的pORF5质粒蛋白。2.不同浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞24h后,RT-qPCR及Western blotting结果显示HeLa细胞中nqo1的mRNA水平及蛋白水平呈浓度依赖性上升,且在10 μg/mL时上调最明显;以10μg/mL浓度的pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞不同时间后Western blotting结果显示当刺激时间为18h,HeLa细胞中nqo1的蛋白水平上调最明显。3.不同浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞18 h后,MDA、T-SOD及T-AOC检测结果显示:与LPS 阳性对照组相比,当pORF5质粒蛋白刺激浓度为10 μg/mL时,MDA含量最少,为0.21±0.02 nmol/mg(P1),T-SOD 及 T-AOC 含量最高,分别为 48.79±1.83 U/mL(P1)和 50.76±0.94U/mL(P1)。4.10 μg/mL pORF5质粒蛋白刺激感染Ct的HeLa细胞不同时间后,相比于PBS对照组,MDA检测结果显示在18h时,MDA的减少程度最明显,为1.35±0.04 nmo1/mg(P1):T-SOD和T-AOC检测结果均显示在18h时,二者的升高程度最明显,分别为26.61士2.21 U/mL(P1)和 34.40±2.50U/mL(P1)。间接免疫荧光结果显示:对照组IFU为7.13 × 105/mL,pORF5刺激组IFU为9.03 X 105/mL,包涵体数量较对照组多26.7%(P1细胞24 h后,ELISA结果显示IL-6及IL-12的水平呈浓度依赖性减少且在浓度为15μg/mL时,IL-6及IL-12的水平分别为3.83±0.37 pg/mL(P1)和 2.24±0.01pg/mL(P1);15 μg/mL pORF5 质粒蛋白刺激经PMA预处理后的THP-1细胞不同时间后,ELISA结果显示IL-6及IL-12的水平呈时间依赖性减少且在刺激时间为18 h时,IL-6及 IL-12 的水平分别为 2.07±0.55 pg/mL(P

关键词：沙眼衣原体 pORF5质粒蛋白 nqo1 氧化应激 IL-6 IL-12