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胞质npm1突变蛋白稳定丙酮酸激酶增强白血病细胞有氧糖酵解表型

胞质NPM1突变蛋白稳定丙酮酸激酶增强白血病细胞有氧糖酵解表型

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作者：鲜敬荣重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:肿瘤细胞的有氧糖酵解能够促进其恶性转化,目前已知多种基因可参与调控该过程。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,npm1)是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中最常见的基因突变,对AML的发生、治疗以及预后有重要影响。然而,N... 详细信息

目的:肿瘤细胞的有氧糖酵解能够促进其恶性转化,目前已知多种基因可参与调控该过程。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,npm1)是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中最常见的基因突变,对AML的发生、治疗以及预后有重要影响。然而,npm1突变在AML有氧糖酵解表型中的调控作用尚未阐明。本文探讨npm1突变对AML有氧糖酵解表型的影响及相关分子机制,进一步观察有氧糖酵解表型对npm1突变AML细胞体外增殖能力的影响。方法:采用基因过表达的方法,在白血病细胞株THP-1中过表达npm1 A型突变蛋白(npm1-mA),观察npm1-mA对白血病细胞糖酵解表型的影响。采用慢病毒RNA干扰的方法,感染天然携带npm1-mA的白血病细胞株OCI/AML3后,观察干扰npm1-mA对白血病细胞糖酵解表型的影响。qRT-PCR和Western blot方法检测髓系白血病细胞株中npm1-mA基因和蛋白的表达。Glucose Assay Kit和Lactate Assay Kit试剂盒检测培养基中葡萄糖消耗量和乳酸生成量。利用2?,7?-Dichlorofluorescin Diacetate(DCF-DA)探针检测细胞内活性氧(ROS)水平。在OCI/AML3细胞中,利用免疫共沉淀(IP)联合质谱检测(MS)技术筛选出与npm1-mA蛋白相互作用的糖酵解相关蛋白。通过内源性co-ip实验验证蛋白间的相互作用。免疫荧光实验验证npm1-ma与糖酵解相关目的蛋白(pkm2)的亚细胞共定位。进一步利用放线菌酮处理oci/aml3细胞,检测pkm2的蛋白稳定性变化。之后,采用rna干扰和过表达方法调控pkm2蛋白表达,观察npm1-ma白血病细胞糖酵解水平的改变。通过cck-8法和克隆形成实验进一步观察pkm2对npm1-ma白血病细胞体外增殖能力的影响。结果:成功建立npm1-ma过表达的thp-1细胞株,npm1-ma组细胞糖酵解水平上升(pnpm1-ma的oci/aml3细胞株中,sh-npm1组细胞糖酵解水平下降(pnpm1-ma蛋白相互作用的两种糖酵解关键酶(pfkl和pkm2)。采用westernblot方法在6株白血病细胞株中检测pfkl和pkm2蛋白表达水平,结果发现pkm2蛋白高表达而pfkl蛋白表达水平难以检测。细胞内co-ip实验证实了npm1-ma蛋白与pkm2蛋白的相互作用,且二者共定位于细胞质中。过表达npm1-ma促进pkm2蛋白水平,而干扰npm1-ma则下调pkm2蛋白水平,同时细胞内pkm2蛋白的稳定性下降。此外,干扰oci/aml3细胞株pkm2的表达,结果发现sh-pkm2组细胞糖酵解水平下降(pnpm1-ma下调的oci/aml3细胞株中恢复pkm2的表达,则发现白血病细胞的糖酵解水平上升(pnpm1-mA参与调控白血病细胞的高糖酵解表型。移位至胞质中的npm1-mA蛋白可与糖酵解关键限速酶PKM2结合并稳定PKM2蛋白分子。PKM2介导的高糖酵解水平增强了白血病细胞的体外增殖能力。靶向PKM2抑制糖酵解水平可能成为携带npm1突变白血病临床治疗研究的一种新策略。

关键词： npm1,基因突变 PKM2 有氧糖酵解急性髓系白血病

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