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nodal信号通路相关基因NOMO1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

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南京医科大学学报（自然科学版） 2013年第9期33卷 1186-1190页

作者：曹娜张浩盛燕辉杨荣孔祥清南京医科大学第一附属医院心血管内科江苏南京210029

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况。方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT-PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚... 详细信息

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况。方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT-PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达情况。结果:通过半定量RT-PCR及原位杂交技术显示NOMO1从受精卵时期开始即有表达,在24 hpf(受精后24 h)之前,NOMO1基因表达广泛,并主要集中在中、内胚层。从24 hpf开始其表达主要集中于神经系统如前脑、中脑、小脑、脊索前板、眼和耳囊等处。在心脏处也有少量表达。结论:NOMO1基因对斑马鱼早期胚胎发育具有一定的作用,推测NOMO1基因影响早期心脏发育。

关键词：斑马鱼 NOMO1基因基因克隆 nodal信号通路

激活nodal信号通路促进小鼠胚胎干细胞向定型内胚层分化

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中国病理生理杂志 2015年第11期31卷 2070-2075页

作者：钟娃夏忠胜欧阳慧袁宇红于涛单体栋陈其奎中山大学孙逸仙纪念医院消化内科广东广州510120

目的：探讨激活nodal信号通路在小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESC）向定型内胚层（definitive endoderm,DE）分化中的作用,寻找小鼠ESC向DE分化的最佳培养体系。方法：根据培养基的不同,实验分为3组：胚胎干细胞组（基础培养＋... 详细信息

目的：探讨激活nodal信号通路在小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESC）向定型内胚层（definitive endoderm,DE）分化中的作用,寻找小鼠ESC向DE分化的最佳培养体系。方法：根据培养基的不同,实验分为3组：胚胎干细胞组（基础培养＋LIF）、自然分化组（基础培养基）和activin A组（基础培养基＋50μg/L activin A）。细胞培养1~7 d,收集不同作用时点（1、3、5、7 d）的细胞及细胞爬片。用流式细胞术检测CXCR4阳性细胞的比例;免疫细胞化学法检测CXCR4蛋白的表达;Western blot检测OCT4及CXCR4蛋白的表达。结果：流式细胞术检测结果提示,随着培养时间的延长,CXCR4阳性细胞的比例,胚胎干细胞组在1~7 d无明显变化,自然分化组和activin A组逐渐增高,第5天达高峰（P〈0.05）,其中activin A组最高（P〈0.05）。细胞免疫组化结果显示CXCR4阳性细胞呈棕褐色或棕黄色。Western blot的结果提示,随着培养时间的延长,胚胎干细胞组OCT4和CXCR4蛋白表达无明显变化;自然分化组和activin A组的CXCR4蛋白的表达逐步增高,OCT4蛋白的表达逐步下降,第5天达高峰（P〈0.05）,其中activin A组的表达最明显（P〈0.05）。结论：在小鼠ESC分化过程中,在诱导培养的第5天,DE的比例最高。激活nodal信号通路可以促进小鼠ESC向具有CXCR4分子标志的DE分化,有利于获取更多的DE细胞。

关键词： nodal信号通路小鼠胚胎干细胞定型内胚层细胞分化

nodal信号通路、nodal纤毛与先天性心脏病研究进展

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兰州大学学报（医学版） 2015年第4期41卷 55-61页

作者：孙晓玮张建刚谢小冬兰州大学医学院病理学研究所甘肃兰州730000 兰州大学医学院遗传学研究所甘肃兰州730000

心脏的形成是非常复杂的过程,涉及多个基因及信号通路的时空表达。nodal信号在心脏发育中发挥极其重要的作用,研究证实,信号通路中主要成员的变异参与多种先天性心脏病的发生。另外还发现,nodal纤毛在心脏左右不对称形态的发生中发挥关... 详细信息

心脏的形成是非常复杂的过程,涉及多个基因及信号通路的时空表达。nodal信号在心脏发育中发挥极其重要的作用,研究证实,信号通路中主要成员的变异参与多种先天性心脏病的发生。另外还发现,nodal纤毛在心脏左右不对称形态的发生中发挥关键作用,部分是通过调控nodal信号来诱导,nodal纤毛的异常可引起一系列纤毛相关性先天性心脏病。本文阐述了nodal信号通路、nodal纤毛与先天性心脏病发病之间的关系。

关键词： nodal信号通路 nodal纤毛先天性心脏病

热激活的Vg1转基因文昌鱼品系构建及表型分析

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厦门大学学报（自然科学版） 2024年第1期63卷 119-126页

作者：商留珂陈钰薇刘惠敏石成刚李光王义权洛阳职业技术学院基础医学院河南洛阳471000 厦门大学生命科学学院福建厦门361102

[目的] Vg1作为nodal信号通路的重要配体之一参与了早期胚胎发育过程中的背腹分化调控及左右不对称模式的建立.构建Vg1转基因文昌鱼品系以研究其在文昌鱼胚胎不同发育阶段的功能.[方法]结合Tol2转座子转基因系统和热敏启动子Hsp70构建... 详细信息

[目的] Vg1作为nodal信号通路的重要配体之一参与了早期胚胎发育过程中的背腹分化调控及左右不对称模式的建立.构建Vg1转基因文昌鱼品系以研究其在文昌鱼胚胎不同发育阶段的功能.[方法]结合Tol2转座子转基因系统和热敏启动子Hsp70构建文昌鱼BbHsp70-BfVg1稳定转基因品系;并用热激实验、表型统计和原位杂交等手段对该转基因品系的有效性进行评估.[结果]热激结果显示,在囊胚晚期热激处理Vg1转基因文昌鱼导致胚胎背腹轴形成异常;在原肠胚中期热激处理Vg1转基因文昌鱼导致胚胎原本左右不对称的器官变为对称分布.基因表达分析结果显示,在囊胚晚期热激F1代胚胎中有部分比例胚胎的Vg1呈现全身性表达,背部中胚层标记基因Gsc表达扩张,腹部标记基因Evx表达下调,神经标记基因SoxB1a向腹侧蔓延;在原肠胚中期热激F1代胚胎中有部分比例胚胎的左侧特异基因Pitx呈现两侧对称表达,左侧口前窝标记基因Pit呈现两侧对称表达.[结论]初步构建了一个能够实现实时热激活Vg1的文昌鱼稳定转基因品系,并为后续在文昌鱼中进行基因功能研究提供了一个新手段.

关键词：转基因文昌鱼 nodal信号通路 Vg1基因 Hsp70启动子 Tol2转座子

nodal信号靶基因dusp4抑制斑马鱼中内胚层形成

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遗传 2012年第9期34卷 1153-1158页

作者：刘昭廷魏奭王强中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室北京100101

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-2(MKP-2/DUSP4)具有酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性,可以作用于MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)底物,使其去磷酸化。但dusp4在脊椎动物胚胎发育中的功能还所知甚少。为深入了解dusp4在发育... 详细信息

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-2(MKP-2/DUSP4)具有酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性,可以作用于MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)底物,使其去磷酸化。但dusp4在脊椎动物胚胎发育中的功能还所知甚少。为深入了解dusp4在发育中的作用,文章首先检测了其在斑马鱼胚胎的表达。通过整胚原位杂交实验,发现dusp4是斑马鱼母源表达的基因,并且随着发育的进行,在原肠早期特异表达在中内胚层区域。进一步的实验表明,nodal信号对dusp4的表达至关重要。过表达nodal信号的配体sqt、dusp4的表达水平明显升高,而在缺失nodal信号的突变体MZoep中,几乎检测不到dusp4的表达。此外,文章利用反义核苷酸Morpholino(MO)敲降dusp4的表达,中内胚层标识基因gsc、sox17和sox32的表达水平显著升高,而过表达dusp4对中内胚层的形成没有明显的影响,表明dusp4对中内胚层形成的抑制作用是必需的,但不是充分的,可能还有其他未被鉴定的协同作用因子。以上研究结果表明,dusp4基因的表达受到nodal信号调控,在原肠期具有抑制中内胚层形成的作用。

关键词： dusp4 nodal信号通路转录调控中内胚层形成

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叶酸缺乏对斑马鱼体轴发育的影响

复旦学报（医学版） 2009年第6期36卷 663-669页

作者：孙淑娜桂永浩蒋璆钱林溪宋后燕复旦大学附属儿科医院心血管中心上海201102 复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系-分子医学教育部重点实验室上海200032

目的构建叶酸缺乏斑马鱼模型,观察叶酸缺乏斑马鱼胚胎的体轴发育情况,初步探讨叶酸缺乏导致胚胎体轴发育异常的机制。方法分别应用二氢叶酸还原酶(dhfr)抑制剂甲氨蝶呤(MTX)以及二氢叶酸还原酶(dhfr)基因阻抑技术,通过下调二氢叶酸还原... 详细信息

目的构建叶酸缺乏斑马鱼模型,观察叶酸缺乏斑马鱼胚胎的体轴发育情况,初步探讨叶酸缺乏导致胚胎体轴发育异常的机制。方法分别应用二氢叶酸还原酶(dhfr)抑制剂甲氨蝶呤(MTX)以及二氢叶酸还原酶(dhfr)基因阻抑技术,通过下调二氢叶酸还原酶功能构建叶酸缺乏斑马鱼模型。在胚胎发育至17 hpf时在显微镜下观察胚胎的体轴偏移情况。利用特异性探针通过胚胎整体原位杂交的方法标记肝脏、胰脏以及心脏,以观察其位于中线两侧的位置。利用胚胎整体原位杂交和Real-time PCR的方法检测与体轴发育密切相关的nodal信号通路下游因子ntl和gsc的表达情况。结果叶酸缺乏组一定比例胚胎存在体轴偏移以及肝脏、胰脏和心脏左右轴异位。叶酸缺乏组nodal信号通路下游因子ntl以及gsc的表达强度无明显变化,但表达的空间模式发生改变,提示轴中胚层发育紊乱。结论叶酸缺乏可导致斑马鱼胚胎体轴发育异常以及轴中胚层发育紊乱,但对nodal信号通路无明显干扰作用。

关键词：叶酸二氢叶酸还原酶体轴 nodal信号通路

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淋巴瘤疾病进展相关分子标志的研究

淋巴瘤疾病进展相关分子标志的研究

作者：孙漪峰上海交通大学

学位级别：硕士

第一部分连接粘附因子-1调节nodal通路促进淋巴瘤转移的机制研究目前,淋巴瘤从淋巴结转移到其它器官的具体机制依然不清楚。肿瘤干细胞对肿瘤转移具有重要意义。我们的研究显示,连接粘附因子-1(junctional adhesion molecule-A,JAM-A)... 详细信息

第一部分连接粘附因子-1调节nodal通路促进淋巴瘤转移的机制研究目前,淋巴瘤从淋巴结转移到其它器官的具体机制依然不清楚。肿瘤干细胞对肿瘤转移具有重要意义。我们的研究显示,连接粘附因子-1(junctional adhesion molecule-A,JAM-A)在结外器官累及的弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)患者中高表达。JAM-A高表达维持了淋巴瘤细胞的细胞干性,导致基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)以及MHC I类分子相关链A(MHC class I-related chain A,MICA)的脱落,降低自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)对靶细胞的杀伤作用,从而增强了淋巴瘤细胞的侵袭性。更重要的是,JAM-A选择性激活了nodal信号通路,促进淋巴瘤细胞更易浸润到中内胚层来源的器官。免疫调节药物来那度胺和西达苯胺能显著下调JAM-A,同时使其下游分子nodal和MMP-2的表达降低,使淋巴瘤细胞对NK细胞介导的免疫监视更加敏感,最终抑制了淋巴瘤的转移。总之,我们的研究结果证明了JAM-A是一个具有干细胞特性并能导致淋巴瘤对NK细胞免疫逃逸的生物学标志,为靶向JAM-A/nodal/MMP-2轴的抗淋巴瘤作用奠定了扎实的理论基础。第二部分外周T细胞淋巴瘤中的长链非编码RNA的检测及功能研究外周T细胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma,PTCL)是侵袭性淋巴瘤的重要类型之一。疾病进展迅速,化疗耐药,易复发,预后差。发现PTCL的治疗靶点是提示PTCL疗效的关键。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是一类不编码蛋白质的RNA,可以调节细胞的生物学行为,参与血液肿瘤的发生发展。绝大多数的lnc RNA功能目前未知,尤其在PTCL方面更是研究甚少。本研究主要通过lnc RNA芯片与m RNA芯片相结合,筛选出与PTCL密切相关的lnc RNA—ST20-AS1,并对其做了初步的功能研究,探讨lnc RNA在PTCL化疗耐药的作用,开拓相应的靶向治疗。

关键词：连接粘附因子-1 nodal信号通路基质金属蛋白酶-2 MHCⅠ类分子相关链A 免疫调节药物外周T细胞淋巴瘤长链非编码RNA 芯片筛选 ST20-AS1

文昌鱼Lefty基因在胚胎发育中的功能研究

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文昌鱼Lefty基因在胚胎发育中的功能研究

作者：张桦洋厦门大学

学位级别：硕士

在脊椎动物胚胎发育过程中,位于组织者处的信号中心对于胚胎体轴和胚层的形成具有重要作用。组织者的形成需要诸多因子协同作用,如局域具有活性的Wnt/β-catenin信号通路、nodal信号通路以及nodal信号通路的抑制因子Lefty等。文昌鱼是... 详细信息

在脊椎动物胚胎发育过程中,位于组织者处的信号中心对于胚胎体轴和胚层的形成具有重要作用。组织者的形成需要诸多因子协同作用,如局域具有活性的Wnt/β-catenin信号通路、nodal信号通路以及nodal信号通路的抑制因子Lefty等。文昌鱼是无脊椎动物到脊椎动物的过渡类群,已有研究表明在原肠胚期,文昌鱼的背唇结构与脊椎动物的组织者同源,但其发育机制和功能尚不清楚。文昌鱼是体外受精,胚胎发育过程简单,且具有与脊椎动物相似的体轴结构,但其结构较脊椎动物简单,因此便于对基因在胚胎发育中的功能进行研究。文昌鱼Lefty基因是最早表达在将来发育为组织者区域的基因,因此研究文昌鱼Lefty基因在胚胎发育中的功能对研究组织者的发育机制及功能提供帮助。本文首先对文昌鱼Lefty基因在不同发育时期的空间表达谱进行了系统的研究,结果显示,文昌鱼Lefty基因为非母源性表达,32-细胞时期在胚胎的植物极细胞内启动合子表达,随后在64-细胞和128-细胞时期也都表达在一部分植物极细胞内,在原肠胚期,Lefty基因集中表达在文昌鱼胚胎背唇处,在神经胚早期,该基因主要集中表达在背部中央的外胚层和中胚层组织,而在后端胚孔处的表达消失,待胚胎发育至神经胚早中期,主要表达在胚胎左侧前部和中部的背神经板、体节中胚层和咽区内胚层,在神经胚中期,Lefty基因在背部的表达逐渐减弱,主要在左侧前端咽区和后端尾芽处表达,待胚胎发育至神经胚晚期,Lefty基因在背部的表达完全消失,主要表达在胚胎左侧的内柱和棒状腺原基位置以及左侧尾芽的体节中胚层和肠道内胚层,幼体时期Lefty基因在内柱和棒状腺处的表达消失,仅在左侧尾芽的体节中胚层和肠道内胚层表达。为了进一步研究文昌鱼Lefty基因在胚胎发育中的功能,本文采用过表达、敲除和挽救3种途径对该基因进行详细地研究。首先,我们通过注射文昌鱼Lefty mRNA进行基因过表达研究,结果显示,过表达Lefty基因后,胚胎在进入原肠胚晚期后出现形态异样的表型,主要表现为:原肠胚晚/神经胚早期的胚胎背部预定神经板区域无法变平,自神经胚中期后,胚胎前端器官和背部组织(神经管、脊索、体节)消失,至幼体时期,口、鳃裂及咽部前部器官均不能形成,随后由于胚胎严重畸形而逐渐死亡。此外,我们还进一步检测了过表达文昌鱼Lefty基因后胚胎发育相关基因的表达情况,结果显示,原肠胚期组织者基因(nodal和Vg1)、背部发育相关基因(Gsc和Chordin)和前端发育相关基因(FoxQ2和Cer)的表达量均下降,甚至一些基因的表达完全消失,而腹部(EvxA)和后端(Wnt8)的标记基因表达向背部扩张,神经外胚层(Sox1/2/3)和体节中胚层(Six1/2)的标记基因表达消失,而表皮外胚层(AP2)的标记基因表达范围扩张。其次,本文通过TALEN技术敲除文昌鱼Lefiy基因后,发现胚胎出现了与过表达文昌鱼Lefty基因相反的表型,主要表现在:在神经胚早期,部分胚胎出现异常的形态,背部神经板中间弯曲,腹部形态正常,随着胚胎发育,出现前端膨大,背部体节明显,后端腹侧消失的表型,待胚胎发育至幼体时期,前端腹侧的吻体腔消失,口前窝明显增大,且左右两侧各形成一个口前窝和口,内柱和棒状腺向腹侧突出,鳃裂不能正常形成,后端腹侧的肠道消失,由于胚胎严重畸形导致胚胎逐渐死亡,最多仅能存活一周左右。同时,我们还检测了敲除文昌鱼Lefty基因后与胚胎发育相关基因在早期的表达情况,结果显示,与组织者(nodal和Vg1)、背部(Gsc和Chordin)和前端(Cer)发育相关基因的表达明显上升,且表达范围扩大,而腹部(EvxA)和后端(Wnt8)发育相关基因表达明显下降,且表达范围缩小,神经外胚层(Sox1/2/3)和体节中胚层(Six1/2)标记基因的表达范围明显增大,而表皮外胚层标记基因(AP2)的表达消失。最后,为了探究文昌鱼Lefty基因是否通过抑制nodal信号通路调控胚胎发育,我们采用共注射Lefty mRNA和nodal信号通路激活剂Vg1mRNA的方法,观察过表达Lefty基因后的胚胎表型能否被Vg1所挽救,结果显示,共注射文昌鱼Lefty mRNA和Vg1mRNA后,胚胎背部和前端组织得到了恢复,并且原位杂交的结果也显示,在原肠胚期,组织者中心的组织者基因nodal和与背部发育相关基因GSC的表达部分恢复正常,在神经胚中期,背部脊索的标记基因Brachyury的表达也基本恢复正常,说明文昌鱼Lefty基因过表达后的表型能够被Vg1挽救。由此可以说明,在文昌鱼中最早表达在组织者区域的Lefty基因通过抑制nodal信号通路调控胚胎组织者和体轴的发育。此外,为了探究文昌鱼Lefty基因的合子表达是否受到nodal信号通路调控,本文在封闭或过度激活nodal信号通路后,检测胚胎早期Lefty基因的表达情况,结果发现封闭nodal信号通路后导致Lefty基因在胚胎

关键词：文昌鱼胚胎发育 Lefty 组织者 nodal信号通路

先天性心脏病相关基因nodal c.T182A突变的初步功能研究

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先天性心脏病相关基因NODAL c.T182A突变的初步功能研究

作者：苏兆冰暨南大学

学位级别：硕士

背景:先天性心脏病是一种由环境因素与遗传因素共同参与的疾病,越来越多的基因及信号通路被发现在先天性心脏病的发病过程中起作用。nodal是nodal信号转导通路的主要配体,在心脏胚胎发育的过程中,nodal信号通路精确诱导中胚层及内胚层... 详细信息

背景:先天性心脏病是一种由环境因素与遗传因素共同参与的疾病,越来越多的基因及信号通路被发现在先天性心脏病的发病过程中起作用。nodal是nodal信号转导通路的主要配体,在心脏胚胎发育的过程中,nodal信号通路精确诱导中胚层及内胚层的形成,间接调控心脏祖细胞的定向分化,调控心脏左右不对称模式的发育。既往的研究发现在先天性心脏病患者中筛查出nodal基因编码序列中的一个罕见突变（c.T182A,p.L61Q）。本研究就nodal基因这一突变引起的nodal功能改变进行探讨。方法:使用生物信息学技术分析nodal基因,分别构建野生型及突变型的nodal表达质粒,采用双荧光素酶报告基因检测系统分析nodal转录因子突变对下游靶基因的转录活性的影响,并通过亚细胞定位及Western blot分析nodal蛋白突变对自身的亚细胞定位及表达情况的影响。结果:生物信息学程序预测nodal p.L61Q变异是有害的,突变的nodal（p.L61Q）不改变nodal蛋白正常的亚细胞定位,但p.L61Q突变降低了nodal蛋白激活下游靶基因的转录活性,并且抑制了nodal蛋白的表达。结论:转录因子nodal基因突变（c.T182A）突变具有损害性,抑制了nodal蛋白对下游靶基因的激活作用,降低自身表达量,但对自身亚细胞定位没有影响,提示该nodal基因突变（c.T182A）极有可能是一个致病基因突变。拓展了nodal基因的突变信息谱,为先天性心脏病的发病遗传机制研究提供新的线索。

关键词：先天性心脏病心脏发育 nodal信号通路 nodal基因突变