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nkx2-5基因诱导P19细胞分化中心肌标志物的表达

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南方医科大学学报 2010年第12期30卷 2658-2662页

作者：张金平王慧娟史玉兰王立轩赵昱郭艳红赵春芳张雷河北医科大学组胚教研室河北石家庄050017 白求恩军医学院生理教研室河北石家庄050081 石家庄妇产医院河北石家庄050011

目的研究同源框基因nkx2-5在心肌发生中的作用。方法实验分转染组和未转染组,转染组细胞为稳定表达nkx2-5的P19细胞,未转染组细胞为P19细胞。两组细胞悬浮培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4、8、12、16d,免疫细胞化学检测α横... 详细信息

目的研究同源框基因nkx2-5在心肌发生中的作用。方法实验分转染组和未转染组,转染组细胞为稳定表达nkx2-5的P19细胞,未转染组细胞为P19细胞。两组细胞悬浮培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4、8、12、16d,免疫细胞化学检测α横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin,α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)、心房利钠因子(atrial natriuretic factor,ANF)基因的表达。结果转染组α-SA和cTnT两种蛋白在聚集体贴壁的8、12、16d出现表达,表达量有增高趋势;16d与8d比有显著差异(P2d表达逐渐增多,16d时表达有所下降。α-MHC和ANF在贴壁培养的8d有表达,12d和16d时表达逐渐增多。统计结果表明GATA-4在8、12、16d的表达量与4d比有显著差异(P5或P2、16d的表达量与8d比有显著差异(P5,P2d比也有显著差异(Pnkx2-5基因可诱导P19细胞逐渐表达心肌标志物。

关键词：同源框基因 nkx2-5 P19细胞心肌标志物

急性心肌缺血对骨髓nkx2-5^+心脏祖细胞的动员作用(英文)

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生理学报 2009年第2期61卷 185-193页

作者：董红燕徐志伟张中明于红丽徐夏红徐州医学院神经生物学研究中心附属医院胸心外科徐州221002

骨髓源性nkx2-5+心脏祖细胞(bone marrow-derived nkx2-5+ cardiac progenitor cells)具有高度特异性分化为心肌细胞的潜能,在病理状态下可能参与内源性心肌修复。但在器官缺血、特别在急性心肌缺血病理状态下,该细胞如何被动员的机制... 详细信息

骨髓源性nkx2-5+心脏祖细胞(bone marrow-derived nkx2-5+ cardiac progenitor cells)具有高度特异性分化为心肌细胞的潜能,在病理状态下可能参与内源性心肌修复。但在器官缺血、特别在急性心肌缺血病理状态下,该细胞如何被动员的机制尚不清楚。本研究在观察nkx2-5+心脏祖细胞在骨髓中分布特征的基础上,分析急性心肌缺血对骨髓源性nkx2-5+心脏祖细胞的动员作用,探讨其细胞动员的可能机制。分别建立小鼠急性心肌缺血及脑、后肢急性缺血动物模型。采用纳米金-银免疫标记透射电镜、免疫荧光标记及分子生物学等检测方法,观察骨髓nkx2-5+心肌祖细胞的定位及其形态学特征;检测急性心肌缺血后外周血nkx2-5+细胞比例变化、缺血不同时段骨髓及外周血中nkx2-5蛋白表达的变化;比较不同器官缺血对nkx2-5+心脏祖细胞的动员作用;应用SDF-1/CXCR4通路特异性阻断剂AMD3100,分析SDF-1在急性心肌缺血后对nkx2-5+心脏祖细胞动员作用的影响。结果显示:nkx2-5+心脏祖细胞呈散在分布于骨髓血窦旁。与对照组相比,急性心肌缺血后,外周血nkx2-5+心脏祖细胞比例显著增加(Pnkx2-5蛋白表达显著增加(Pnkx2-5蛋白表达立即升高,随后则降低。应用AMD3100阻断剂后,心肌缺血组外周血nkx2-5蛋白表达受到明显抑制(P5)。脑、后肢缺血后,外周血nkx2-5蛋白表达显著少于急性心肌缺血组(Pnkx2-5+心脏祖细胞亚群;急性心肌缺血对骨髓nkx2-5+心脏祖细胞具有显著的动员作用,且该动员作用具有显著的器官特异性,SDF-1/CXCR4通路在该动员作用中发挥了重要的趋化作用。

关键词：心脏祖细胞骨髓 nkx2-5 动员心肌缺血

先天性室间隔缺损患者nkx2—5基因新突变的识别

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中华医学杂志 2009年第34期89卷 2395-2399页

作者：刘兴元杨奕清杨颖林小平陈义汉上海同济大学附属同济医院儿科 200065 上海同济大学附属同济医院心内科 200065

目的识别先天性室间隔缺损（VSD）患者新的分子遗传缺陷。方法收集2006年3月至2008年6月在上海儿童医学中心、上海同济医院和上海市儿童医院160例先天性VSD患者的临床资料和血标本，以200名健康者为对照。应用聚合酶链反应扩增nkx2-5基... 详细信息

目的识别先天性室间隔缺损（VSD）患者新的分子遗传缺陷。方法收集2006年3月至2008年6月在上海儿童医学中心、上海同济医院和上海市儿童医院160例先天性VSD患者的临床资料和血标本，以200名健康者为对照。应用聚合酶链反应扩增nkx2-5基因的全部外显子，采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序。借助BLAST程序将所测序列与GenBank中的已知序列进行比对以识别基因突变，并用Clustal W软件分析突变氨基酸的保守性。结果在3例VSD患者的nkx2-5基因识别出2个新的杂合错义突变，即2例VSD患者的第179位密码子TCC变为TTC，导致第179位的丝氨酸变为苯丙氨酸，1例VSD患者的第36位密码子CGC变为AGC，导致第36位的精氨酸变为丝氨酸。200名健康对照者均无此突变，多物种nkx2．5序列比对显示突变氨基酸在进化上均高度保守。此外，还发现了2个不改变氨基酸的单核甘酸多态，即常见的c．63A〉G多态和少见的C．606G〉C多态，但这些多态在VSD患者和健康对照者间的分布差异均无统计学意义（c．63A〉G多态：χ^2=3．403、P=0．0651，c．606G〉C多态：χ^2=3．278、P=0．0702）。结论在先天性VSD患者识别出新的nkx2．5基因突变，揭示了VSD新的分子病因。

关键词：心脏缺损,先天性室间隔缺损调节元件,转录 nkx2-5

外源表达nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化

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解剖学杂志 2007年第6期30卷 725-729页

作者：张金平张雷王惠娟王多赵昱尹青赵春芳河北医科大学组织学与胚胎学教研室石家庄050017

目的:构建人nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-nkx2-5,探讨外源性nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用。方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-nkx2-5为模板,PCR扩增得到人nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正... 详细信息

目的:构建人nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-nkx2-5,探讨外源性nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用。方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-nkx2-5为模板,PCR扩增得到人nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确。将重组质粒pEGFP-N1-nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d。以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达。结果:将nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白。结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-nkx2-5,外源表达nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化。

关键词： nkx2-5 质粒构建 P19细胞基因转染心肌分化

nkx2-5基因突变与室间隔缺损及房间隔缺损关系研究

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NKX2-5基因突变与室间隔缺损及房间隔缺损关系研究

作者：唐孕佳苏州大学

学位级别：硕士

研究背景及目的室间隔缺损(Ventricular Septal Defect,VSD)是最常见的先天性心脏病,总发病率占先天性心脏病的20%左右,房间隔缺损(Atrial Septal Defect,ASD)的发病率仅次于室间隔缺损,总发病率占6-10%。若心房或心室水平持续存在左向... 详细信息

研究背景及目的室间隔缺损(Ventricular Septal Defect,VSD)是最常见的先天性心脏病,总发病率占先天性心脏病的20%左右,房间隔缺损(Atrial Septal Defect,ASD)的发病率仅次于室间隔缺损,总发病率占6-10%。若心房或心室水平持续存在左向右分流,将引起不可逆的肺动脉高压(pulmonary hypertension)、心房心室的扩大、心功能衰竭、艾森曼格综合征(Eisenmenger’s Syndrome)、心律失常,甚至猝死,给社会及家庭带来严重的经济负担。nkx2-5是人类心脏发育早期最早表达的转录因子,其突变将导致先天性心脏病及房室传导阻滞的发生。本研究以先天性室间隔缺损及房间隔缺损患儿为研究对象,以排除先天性心脏病的外科手术病人为对照,筛查nkx2-5基因的突变及单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP),为nkx2-5在室间隔缺损及房间隔缺损中的相关性提供理论依据。研究方法根据Genbank数据库中nkx2-5序列,发现nkx2-5除已验证的3个亚型之外,有一电脑预测亚型,为验证该亚型在心肌组织中是否表达,取两名在苏州大学附属儿童医院心胸外科行心脏外科手术患儿的病变心肌组织,用Trizol法提取RNA、逆转录聚合酶链式反应(Reverse Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)验证该亚型的表达。同时取抽在苏州大学附属儿童医院心脏内科或心脏外科就诊的单纯室间隔缺损患儿50名,单纯房间隔缺损患儿51名以及50名排除先天性心脏病、血液系统疾病及染色体疾病的外科患儿的外周静脉血,用DNA试剂盒提取DNA,PCR扩增,DNA测序仪直接测序NKKX2-5外显子序列,与NCBI中nkx2-5基因序列进行比对,并与对照组比较,观察该基因突变情况。结果1.预测亚型在两个患儿心肌组织中无表达。2.在一例单纯性房间隔缺损患儿中发现一罕见SNP突变位点(c.104G>T,rs376790353),该突变位点在其他患儿及对照组中均未发现。3.在51例单纯房间隔缺损,50例单纯室间隔缺损及50例对照样本的外显子中,均找到已报道的三个常见SNP(c.63G>C,rs2277923,c.606A>G,rs3729753及c.195G>C,rs3131915),在实验组及对照组中基因型分布及等位基因频率无统计学差异(P>0.05)。4.在一例房间隔缺损的患儿外显子2(NM04387.3)中还发现了一处同义突变(c.460C>G,***264 Ser)。结论1.预测亚型在本研究样本患儿的心肌组织中无表达。***位点rs376790353可能与房间隔缺损的发生有关,而SNP位点rs2277923,rs3729753及rs3131915可能跟房间隔缺损及室间隔缺损无相关性。

关键词：先天性心脏病房间隔缺损室间隔缺损 nkx2-5 基因突变单核苷酸多态性

nkx2-5基因和GATA4基因多态性与中国藏族人群先天性心脏病的关系

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NKX2-5基因和GATA4基因多态性与中国藏族人群先天性心脏病的关系

作者：马强青海大学

学位级别：硕士

目的通过对nkx2-5基因和GATA4基因外显子序列及非编码区单核苷酸多态性（SNP）进行分析和关联研究,探究其与高原藏族先天性心脏病（CHD）的关系。方法收集2016年至2019年在青海大学附属医院被诊断为CHD的藏族患者（实验组）和健康藏族... 详细信息

目的通过对nkx2-5基因和GATA4基因外显子序列及非编码区单核苷酸多态性（SNP）进行分析和关联研究,探究其与高原藏族先天性心脏病（CHD）的关系。方法收集2016年至2019年在青海大学附属医院被诊断为CHD的藏族患者（实验组）和健康藏族血液样本（对照组）,其中第一部分实验共有实验组样本70例,对照组样本70例;第二部分实验共有实验组样本103例,对照组样本267例。对nkx2-5基因2个外显子和GATA4基因7个外显子分段设计引物并测序;采用Sequenom Mass ARRAY?SNP技术对nkx2-5基因和GATA4基因候选SNP进行分型检测。实验数据采用SPSS19.0统计软件处理。实验组及对照组间年龄比较采用χ2检验,性别比较采用t检验。样本群体的代表性用哈迪-温伯格平衡检验。各组间基因型、等位基因频率、连锁不平衡和单体型分析采用网页http://***计算,用相对危险度（OR）、95%置信区间（CI）和p值表示分析结果。结果1、外显子测序结果发现:在实验组和对照组发现nkx2-5基因外显子1第63位密码子碱基（rs2277923）和外显子2第606位密码子碱基（rs3729753）发生了同义替换,GATA4基因外显子6第1129位密码子碱基（rs3729856）发生了非同义替换,未发现其他外显子序列的改变。nkx2-5基因rs2277923基因型和等位基因频率无差异,rs3729753不符合哈迪-温伯格平衡定律,统计分析时予以剔除;GATA4基因rs3729856基因型和等位基因频率无差异。2、nkx2-5基因非编码区发现rs6882776和rs2546741共2个SNP位点在实验组和对照组之间差异有统计学意义,GATA4基因非编码区发现rs117982404和rs12458共2个SNP位点在实验组和对照组之间差异有统计学意义。3、nkx2-5基因的8个SNP位点和GATA4基因的20个SNP位点进行连锁不平衡分析,发现各基因位点之间存在强连锁不平衡。nkx2-5基因的单体型CAACTCAG（OR=1.674,95%CI=1.062-2.638,p=0.025）、CGGCTCAG（OR=51.860,95%CI=11.972-224.658,p＜0.001）和GATA4基因的CCACGAGCCCG GCTACTCAC（OR=1.887,95%CI=1.023-3.481,p=0.040）、CTGCGAGTCCGG CTACTTTC（OR=19.238,95%CI=4.848-76.339,p＜0.001）是CHD的危险性因素,但nkx2-5基因的单体型CAGCTCAG（OR=0.158,95%CI=0.070-0.356,p＜0.001）、CAGCTCGG（OR=0.043,95%CI=0.006-0.306,p＜0.001）和GATA4基因的单体型CCACGAGCCCGGCCACCCAC（OR=0.475,95%CI=0.227-0.992,p=0.043）、CTGCGAGTCCGGCTACTCTC（OR=0.110,95%CI=0.017-0.725,p=0.006）、CTGCGAGTCCGGCTACTTAC（OR=0.162,95%CI=0.050-0.519,p=0.001）是CHD的保护性因素。结论1、nkx2-5基因外显子的rs2277923位点和GATA4基因外显子的rs3729856位点与高原藏族CHD的易感性无关。2、nkx2-5基因非编码区的rs6882776、rs2546741位点以及GATA4基因非编码区的rs117982404、rs12458位点在实验组和对照组间基因型和等位基因频率对比有显著性差异,但是否与CHD的发生有关联性,有待今后做进一步地研究。3、nkx2-5基因和GATA4基因选取的SNP位点之间存在强连锁不平衡,nkx2-5基因和GATA4基因的单体型与CHD相关。

关键词：先天性心脏病 nkx2-5 GATA4 单核苷酸多态性藏族

转录因子nkx2-5和GATA-4在胚胎心肌发育早期的作用

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北京大学学报（医学版） 2002年第6期34卷 732-734页

作者：林钊周春燕北京大学基础医学院生物化学和分子生物学系北京100083

移植不同来源的干细胞以修复梗死的心肌组织、改善心功能已成为目前研究的热点。虽然人们已成功地将非心源性的干细胞（如胚胎干细胞、造血干细胞和骨骼肌卫星细胞等），移植至梗死的心肌区域并观察到它们分化成心肌样细胞，但是对这一... 详细信息

移植不同来源的干细胞以修复梗死的心肌组织、改善心功能已成为目前研究的热点。虽然人们已成功地将非心源性的干细胞（如胚胎干细胞、造血干细胞和骨骼肌卫星细胞等），移植至梗死的心肌区域并观察到它们分化成心肌样细胞，但是对这一横向分化的具体机制所知甚少。许多研究者推测横向分化的机制与胚胎的发育过程类似。从分子水平考虑，横向分化的过程和胚胎的发育均始于某个或某些关键基因的启动。通常这些基因的蛋白产物都是转录因子，它们可以使下游的靶基因呈级联式地激活，直至分化完成。对胚胎心分化和发育中基因调控的研究将有助于我们认识干细胞横向分化的机制。

关键词： nkx2-5 GATA-4 转录因子心脏胚胎学

心肌微环境下nkx2-5基因诱导MSCs向心肌分化

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心肌微环境下NKX2-5基因诱导MSCs向心肌分化

作者：褚勤河北医科大学

学位级别：硕士

目的：缺血性心脏病是是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。心脏衰竭最终导致冠状动脉疾病。心脏病最常见的死因主要是很多心脏病患者会发生急性心肌梗死。急性心肌... 详细信息

目的：缺血性心脏病是是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。心脏衰竭最终导致冠状动脉疾病。心脏病最常见的死因主要是很多心脏病患者会发生急性心肌梗死。急性心肌梗死的特征是突然的冠状动脉闭塞，并导致氧气供应不足(缺血)，不可逆的肌肉损伤，心肌坏死。心脏的缺血随后会启动个重构的程序，其包括在幸存细胞代谢的修饰，左心室结构的一系列改变：心脏的肥大、纤维化和心室的扩张。这些改变都伴随着一个对心脏不利的因素，并逐渐导致心脏代偿功能失调和进行性心力衰竭。骨髓间充质干细胞表现出多向分化潜能，各种干细胞可以从骨髓，脂肪组织，脐带血，外周血中发现并分离出来。比如胚胎干细胞，骨髓来源的骨髓间充质干细胞(MSCs)有广泛的自我扩增能力，在合适的微环境下能分化成多种细胞：心肌细胞、神经细胞、成骨细胞、平滑肌细胞。在MSCs移植后，MSCs分泌的可溶性因素在心肌梗死后的心肌修复中起着非常重要的作用。MSCs的移植已显示可以预防急性心肌缺血性损伤，而且可以通过促进保护性细胞因子的释放以促进血管的再生。再者，最近的研究表示：缺血性心脏的干细胞移植会通过免疫抑制行为产生保护性作用。该研究也显示MSCs的潜在刺激因素是一种新颖的心脏修复机制。总之，越来越多的动物实验和临床实验证实了通过抑制细胞凋亡，免疫抑制，血管再生，分化等，MSCs移植改变了心脏的功能。然而，没有证据表明MSCs是否能防止心脏细胞的早衰。许多研究已经证实自体和异体MSCs的移植对于急性心肌损伤有很大的改善。因此，MSCs通过在不同培养条件下分化为各种不同的细胞，包括血管平滑肌细胞，内皮细胞和心肌细胞，从而减弱了心肌的损伤。同样也有资料显示MSCs产生的营养物质能够通过这些物质的联合作用改进心脏的功能，包括减少炎症，刺激宿主干细胞，减少血管再生和纤维化的重构。所以，MSCs能够而且通过替代病变的心肌细胞，提供大量的抑制细胞凋亡和促有丝分裂因子来改善心脏的损伤。许多实验已研究了对乳鼠心肌细胞(cardiomyocyte,CM)的原代培养的方法。在体外分离，培养的心肌细胞，不但可以保持原来结构和功能，乳鼠的心肌会提供一个简单的实验系统。与成年的心肌细胞相比，乳鼠心肌细胞具有分裂能力，适于培养，而且适合于进行非病毒基因的转染。 nkx2.5是NK型同源盒基因家族NK2型的成员, nkx2.5对早期心肌的分化、整个心管的形成与环化起重要作用，且参与房室分隔、传导系统及成熟心脏正常功能的维持,因此也成为心脏发育过程中最重要的转录因子。nkx2-5在早期心脏组细胞中有很高的表达，在小鼠胚胎的发生和成年心脏中有高水平持续表达。尤其是，在转导系统形成时期，nkx2-5基因在特殊的心脏转导细胞显示出瞬时表达提高。微环境由两方面组成：细胞周围影响能够细胞兴奋、抑制活动的微环境的因素;该细胞自身在分化过程中形成的特殊结构和受体。细胞的反应决定于微量因素质与量,和自身相关部位的机能状态，这两方面共同产生的综合效应,其相互影响、相互协调,使细胞生长、增殖和定向分化能够适应机体需要。MSCs同样处于这种互动的促进式的微环境的调控下,包括来源于:心肌细胞自身的理化因素，以及由自身分化所形成的感应外界的结构。有研究者将周围环境中的理化因素化分为直接因素，间接因素。前者是指对MSCs所产生各种外部刺激、以及一些离子、小分子物质的作用，这些物质都是通过“通道”进行传递的;后者是指分泌的各种可溶性可供MSCs利用的因子。现在的组织工程技术主要是利用靶细胞和生物学的材料，用以研究和探讨组织和器官的再生的问题。但是当前面临的问题是在移植这些材料后，如何促进血管的再生和重构，以及机体能不能耐受这种外界的物质的问题。如今骨髓内皮祖细胞和骨髓间质干细胞的共培养已经等到广泛的应用。已有实验研究表明向骨髓间充质干细胞中转染nkx2-5基因，单纯通过基因的瞬时表达诱导其向心肌样细胞分化，通过诱导MSCs细胞分化成心肌样细胞。本研究利用脂质体转染法将nkx2-5基因瞬时转染SD的MSCs，观察其在与心肌共培养的条件下向心肌分化的情况，并与单纯经nkx2-5转染后的MSCs向CM分化的情况作比较，通过研究探讨心肌细胞在分化过程中具有的一些特征性的规律，为干细胞作为靶细胞治疗心肌疾病提供实验依据。方法： 1PEGFP-N1-nkx2-5真核表达质粒的激活与扩增科室保存的含有PEGFP-N1-nkx2-5质粒的大肠杆菌DH5α感受态细菌，涂布于含卡那青霉素的LB固体培养基上，在37℃恒温箱中倒置培养12-16h;挑取单个克隆的菌落,进行下一步的扩增。用质粒小提抽提试剂盒提取质粒，并检测其浓度。 2SD大鼠的MSCs的体外分离、纯化、扩增取SD大鼠的胫骨和股骨中的骨髓组织，分离纯化出M

关键词： MSCs细胞 nkx2-5 PEGFP-N1-nkx2-5质粒转染心肌细胞心肌微环境共培养

高糖或缺氧对原代心肌细胞nkx2-5、Tbx5表达的影响

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高糖或缺氧对原代心肌细胞Nkx2-5、Tbx5表达的影响

作者：卞云飞河北医科大学

学位级别：硕士

目的：心脏是胚胎发育过程中第一个形成的器官，作为高度特化的器官，一直被认为没有再生的能力，受损后以瘢痕修复为主替代之，严重影响心肌收缩功能，是不可逆心衰的病理基础。但在2011年Porrello等人手术切除1日龄小鼠15%的心室肌，2... 详细信息

目的：心脏是胚胎发育过程中第一个形成的器官，作为高度特化的器官，一直被认为没有再生的能力，受损后以瘢痕修复为主替代之，严重影响心肌收缩功能，是不可逆心衰的病理基础。但在2011年Porrello等人手术切除1日龄小鼠15%的心室肌，21天后小鼠心脏完全再生且功能正常无瘢痕形成，证明哺乳动物心肌有再生能力;2013年Senyo等人证实哺乳动物预先存在的心肌细胞是维持心肌日常更替和受损后心肌再生的主要细胞来源。nkx2-5与其下游基因Tbx5是心脏发育早期转录因子，是心肌前体细胞的标志基因，在功能上紧密关联。nkx2-5、Tbx5随着心脏发育成熟表达逐渐降低维持低水平状态。研究发现nkx2-5、Tbx5表达升高与心肌再生相关。因此nkx2-5、Tbx5表达升高是参与心肌再生的重要因素。高糖或缺氧是临床常见心肌受损因素，可导致心肌肥大和心肌纤维化，最终造成心脏功能不可逆损伤。高糖缺氧与损伤之间的关系认识清楚，但高糖缺氧与心肌再生的关系没有明确的认识。高糖或缺氧能否刺激心肌细胞早期转录因子nkx2-5、Tbx5表达上调参与心肌细胞再生未有报道。高糖缺氧均可刺激诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase，iNOS）活性增强，iNOS催化底物可以大量生成一氧化氮（NO）,过量NO和超氧阴离子迅速反应生成的过氧亚硝基阴离子（ONOO-）是已知氧化活性最强的一类物质，也是体内造成氧化应激损伤的重要原因。那么，高糖缺氧刺激心肌细胞不同时间后iNOS、nkx2-5、Tbx5表达如何变化？ONOO-水平是否影响nkx2-5、Tbx5表达未见报道。通心络是国药准字中药复方制剂，是临床用于治疗心脏疾病的常用药物。不同浓度通心络干预高糖或缺氧刺激的原代心肌细胞是否影响iNOS、nkx2-5、Tbx5表达未见研究。本实验旨在探讨高糖或缺氧能否使原代心肌细胞nkx2-5、Tbx5基因表达上调;ONOO-水平是否是影响nkx2-5、Tbx5表达的重要机制;不同浓度通心络的干预作用。本实验采用出生3天以内SD大鼠乳鼠原代培养心肌细胞。免疫荧光法鉴定心肌细胞。检测高糖或缺氧刺激原代心肌细胞不同时间iNOS、nkx2-5、Tbx5基因的表达;不同浓度的通心络干预高糖或缺氧刺激的原代心肌细胞，检测iNOS、nkx2-5、Tbx5的基因表达;应用ONOO-的供体（SIN-1）和清除剂（FeTTPs），检测ONOO-对nkx2-5、Tbx5基因表达影响。方法：1原代心肌细胞分离及培养取出生3天以内的SD大鼠乳鼠7-8只，75%酒精消毒，用眼科剪在胸骨角上2肋剪开胸腔，轻挤胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏，将取下的心脏剪碎，用胰酶少量多次消化组织块，采用物理和化学方法去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。用含15%胎牛血清的DMEM（低糖）的培养基接种于六孔板中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，培养7天用以实验。2分组实验分为高糖组和缺氧组，应用25mM的DMEM培养基模拟高糖环境，应用终浓度为100uM的氯化钴模拟缺氧环境;（1）检测细胞在高糖刺激下不同时间iNOS，nkx2-5，Tbx5转录水平，将细胞分为正常组（即0h组）、高糖刺激1h、2h、3h、4h、5h组。（2）检测ONOO-水平对nkx2-5，Tbx5转录水平的影响，将细胞分为正常组，高糖组，高糖+铁卟啉组，SIN-1组。（3）检测不同浓度通心络在高糖刺激下对心肌细胞iNOS、nkx2-5、Tbx5转录水平的影响，将细胞分为高糖组，通心络360μg/ml组、通心络540μg/ml组、通心络720μg/ml组。（4）检测细胞在缺氧刺激下不同时间iNOS、nkx2-5、Tbx5转录水平，将细胞分为正常组（即0h组），缺氧1h、2h、3h、4h、5h组。（5）检测ONOO-水平对nkx2-5、Tbx5转录水平的影响，将细胞分为正常组，缺氧组，缺氧+铁卟啉组，SIN-1组。（6）检测不同浓度通心络在缺氧刺激下对心肌细胞iNOS、nkx2-5、Tbx5转录水平的影响，将细胞分为缺氧组，通心络360μg/ml组、通心络540μg/ml组、通心络720μg/ml组。3形态学观察刚提取的心肌细胞为球形，12小时之后细胞基本贴壁，细胞逐渐伸出伪足，细胞与细胞之间逐渐建立联系;48小时细胞逐渐出现跳动，细胞渐渐成片跳动，跳动频率一致。4利用免疫荧光的方法检测提取细胞中cTNT表达，鉴定心肌细胞5心肌细胞通过不同刺激培养后，检测心肌细胞中iNOS、nkx2-5、Tbx5的基因转录水平。Trizol一步法提取心肌细胞中总RNA;用β-act

关键词：心肌细胞高糖缺氧 iNOS nkx2-5 Tbx5