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CD44介导TGEV调控nhe3诱导仔猪Na+失衡的研究及激活剂的筛选

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CD44介导TGEV调控NHE3诱导仔猪Na+失衡的研究及激活剂的筛选

作者：徐沙沙西南大学

学位级别：硕士

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种以仔猪严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的急性、高度接触性肠道传染病,2周龄内的仔猪最易感染,死亡率... 详细信息

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种以仔猪严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的急性、高度接触性肠道传染病,2周龄内的仔猪最易感染,死亡率最高可达100%,严重影响养猪业的生产和发展,给养猪业造成严重损失。生理情况下,水在肠腔内大部分是通过渗透作用被吸收,当致泻物质作用于肠道时,存在于腔膜上的各种功能实体如离子转运体、通道和构成上皮屏障的多蛋白连接复合体的功能和/或表达丧失。这一系列的反应导致肠道内电解质吸收和/或分泌过程平衡的紊乱,进而破坏了渗透压梯度,导致水潴留和腹泻。nhe3通过将胞外Na转运到胞内、将胞外H转运到胞外来发挥其主要生理功能,实验室前期研究表明,TGEV感染猪小肠后在小肠上皮细胞(Porcine small intestinal epithelial cell,IPEC-J2)内大量复制,破坏了上皮细胞Na转运功能,导致肠道渗透压升高,并可促进仔猪腹泻,但其具体作用机制尚不清楚。而CD44的主要生理作用是介导细胞与细胞间及细胞与细胞外基质间的相互作用,可调控许多生物过程,包括细胞黏附、迁移和增殖,有研究表明CD44可参与病毒的感染,其在冠状病毒性疾病的致病过程中可抑制或促进病毒复制。基于上述原理,本课题在细胞层面通过RT-q PCR、火焰原子吸收法、免疫荧光法等方法,检验TGEV感染情况下CD44与nhe3的数量变化情况;同时探索了nhe3数量及活性是否对TGEV有剂量依赖性;进而通过构建CD44过表达载体及干扰载体,探究CD44变化对病毒复制及nhe3活性/数量的影响,阐明了CD44在TGEV感染造成的Na失衡性腹泻中的作用;最后通过计算机辅助筛选出针对CD44蛋白激活剂考尼伐坦(Conivaptan),且体内实验证明Conivaptan有效阻止病毒的复制。主要研究内容如下:1、TGEV感染猪小肠转录组学分析及验证本章通过对实验室前期TGEV感染仔猪肠道组织转录组学数据进行分析,发现肠道上皮细胞中负责Na/H交换体nhe3出现了显著下调,而细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)通路中的CD44出现了显著上调,实验也证明了TGEV感染可抑制nhe3 m RNA表达,促进CD44m RNA的表达;通过对CD44和nhe3进行蛋白互作预测,发现CD44与nhe3可能存在潜在联系。本章实验结果表明,nhe3和CD44可能存在调控关系。2、TGEV感染IPEC-J2细胞对nhe3和CD44的影响本章实验通过RT-q PCR、Western blot与免疫荧光等方法检测了nhe3、CD44的表达情况,并利用火焰原子吸收法检测了细胞内外液Na的交换情况。结果表明,TGEV可促进CD44的表达;TGEV可抑制nhe3的表达,影响IPEC-J2细胞对Na的吸收;通过用不同的感染复数(MOI=0.5,MOI=1,MOI=2)的TGEV感染IPEC-J2细胞,并利用上述方法检测nhe3的m RNA、总蛋白和膜蛋白水平,发现nhe3的表达对TGEV具有剂量依赖性。3、CD44对nhe3和TGEV复制的影响为探究CD44与nhe3的关系,本章通过构建CD44重组过表达质粒p EFGP-CD44和干扰质粒p LVX-CD44,同时利用Western blot与免疫荧光检测了CD44对nhe3表达的影响,结果发现CD44与nhe3间没有直接调控关系;在TGEV感染情况下,通过调控CD44检测nhe3蛋白的表达,并利用火焰原子吸收法检测了细胞内外Na浓度,结果发现,CD44蛋白可导致的nhe3质膜表达显著下调并影响细胞内外Na的交换;利用Western blot与TCID检测了CD44蛋白对TGEV复制的影响,结果发现CD44可以影响TGEV的复制,即过表达CD44能抑制TEGV的复制,而干扰CD44能促进TGEV的复制。上述结果证明,CD44可通过调节TGEV的复制影响nhe3的数量和活性。4、CD44小分子激活剂的筛选及效果验证从NCBI下载CD44蛋白的序列,利用Trrosetta基于蛋白质序列对CD44进行了蛋白质模型的构建;使用Smina等对CD44与候选配体进行了分子对接筛选到了潜在激活剂Conivaptan;细胞试验发现,4×10mol/L的Conivaptan可显著激活CD44的表达;而在动物试验中,在对仔猪饲喂Conivaptan后使用TGEV感染,剖检后无明显病理变化。利用Western blot与绝对荧光定量PCR检测,结果发现Conivaptan可减少TGEV N基因在肠上皮细胞上的表达,也可降低TGEV感染后nhe3的减少,并有效阻止病毒的复制。综上所述,本研究证明了CD44可以介导TGEV调控nhe3,从而影响Na的交换,并

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 CD44 nhe3 Na+失衡性腹泻小分子激活剂

温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠PepT1和nhes mRNA表达差异及发育性变化

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华北农学报 2012年第5期27卷 96-100页

作者：黎相广严会超曾佩玲束刚张德祥罗庆斌王修启华南农业大学动物科学学院广东广州510642

为研究温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠寡肽转运载体PepT1(Solute carrier family 15 member 1)以及Na+/H+交换载体nhe2(Solute carrier family 9 member 2)和nhe3(Solute carrier family 9 member 3)mRNA的表达规律,选取产蛋日龄相近的温氏土鸡和白洛克鸡所产种蛋各96枚,每个品种随机分为6组,每组16枚,在相同的条件下进行孵化。分别在9,12,14,17,19胚龄(E)和出壳当天(DOH),每个品种选取16枚鸡胚,采集小肠样品,采用Real-time RT-PCR方法检测小肠PepT1、nhe2和nhe3 mRNA的相对表达丰度。结果显示:从发育性变化来看,PepT1、nhe2和nhe3mRNA在温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠的表达丰度都表现为随着胚龄的增加而上调,19胚龄后上调幅度较大;双因素方差分析表明,PepT1、nhe2和nhe3 mRNA的表达丰度在2个品种间无显著差异,但受发育阶段影响,PepT1 mRNA的表达丰度存在"品种×胚龄"的互作效应(Pnhe2和nhe3 mRNA表达丰度无"品种×胚龄"的互作效应(P>0.05)。说明PepT1、nhe2和nhe3 mRNA表达丰度在温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠中具有相同的发育模式,其表达量受发育水平的影响,但品种间差异不显著。

关键词： PepT1 nhe2 nhe3 表达规律鸡胚小肠

高盐饮水升高Ang Ⅱ介导肉鸡腹水综合征和肾脏损伤

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高盐饮水升高Ang Ⅱ介导肉鸡腹水综合征和肾脏损伤

作者：彭宇轩华中农业大学

学位级别：硕士

盐的过多摄入是导致肉鸡发生腹水综合征(Ascites Syndrome,AS)和肾脏损伤的重要因素之一。相较于日粮中的盐,肉鸡对饮水中的盐更为敏感。本研究将80只1日龄AA肉鸡正常饲养7d后随机分为4组,喂以不同浓度盐水:对照组(Control,C;0%Na Cl);... 详细信息

盐的过多摄入是导致肉鸡发生腹水综合征(Ascites Syndrome,AS)和肾脏损伤的重要因素之一。相较于日粮中的盐,肉鸡对饮水中的盐更为敏感。本研究将80只1日龄AA肉鸡正常饲养7d后随机分为4组,喂以不同浓度盐水:对照组(Control,C;0%Na Cl);低盐组(Freshwater,L-SW;0.1%Na Cl);中盐组(Low-salt water,M-SW;0.25%Na Cl);高盐组(High-salt water,H-SW;0.5%Na Cl),于35d进行取样;使用鸡胚肾细胞(CEK cells)作为试验对象,使用外源Ang Ⅱ处理细胞。经血液生化检查,ELISA检测,肾组织切片及TUNEL检测,CCK-8检测,流式细胞凋亡检测,荧光实时定量PCR和免疫印迹等试验,结果发现:(1)M-SW组肉鸡HCT>0.36占30%,AHI>0.28占5%;H-SW组肉鸡HCT>0.36占65%;AHI>0.28占30%;同时H-SW组肉鸡出现腹水症状。M-SW组和H-SW组肉鸡肾脏指数(肾重/体重)较C组显著性升高(P3磷酸化显著升高(P3型钠氢交换体(nhe3)表达显著升高(P35d时M-SW组肉鸡血清Ang Ⅱ浓度高于H-SW组(P3磷酸化。10M Ang Ⅱ(Pnhe3表达(Pnhe3异常增加影响肉鸡水盐代谢;同时通过激活JAK2/STAT3通路,诱导肾脏损伤。

关键词：肉鸡腹水综合征肾脏损伤高盐血管紧张素 nhe3 AQP2

猪δ冠状病毒通过miR-361-3p-SLC9A3调控轴抑制IPI-2I细胞nhe3活性

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猪δ冠状病毒通过miR-361-3p-SLC9A3调控轴抑制IPI-2I细胞NHE3活性

作者：曹梦景安徽农业大学

学位级别：硕士

猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCo V)是一种有包膜的单链正义RNA病毒,属于冠状病毒科下δ冠状病毒属的成员。PDCo V感染的主要症状是急性呕吐、严重腹泻和消瘦,严重消瘦大大增加了哺乳仔猪的淘汰率及死亡率,因此对仔猪危害... 详细信息

猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCo V)是一种有包膜的单链正义RNA病毒,属于冠状病毒科下δ冠状病毒属的成员。PDCo V感染的主要症状是急性呕吐、严重腹泻和消瘦,严重消瘦大大增加了哺乳仔猪的淘汰率及死亡率,因此对仔猪危害尤为严重。目前为止,PDCo V已在包括中国、美国、加拿大、泰国和韩国等多个国家暴发与流行,同时给全球养猪业造成了巨大经济损失,但对PDCo V导致仔猪严重腹泻的致病机理及分子机制知之甚少。溶质载体家族9亚家族A成员3(Solute carrier family 9 subfamily A member 3,SLC9A3)属于溶质载体家族,是编码钠氢交换器3(Sodium-hydrogen exchanger member 3,nhe3)的核心基因,nhe3是小肠表面上皮细胞顶膜上参与Na/H交换的主要转运载体,当nhe3活性长期处于抑制状态时,会引起腹泻甚至导致死亡。本实验室前期利用PDCo V CHN-GD16-05分离株对2日龄仔猪进行攻毒试验,取肠道组织样品送到相关公司进行转录组学高通量测序,对部分结果进行软件分析并绘制可视化关系网络图。结果表明表达差异且具有生物学意义的mi RNA-m RNA调控主要富集在消化系统的蛋白质消化信号通路上,相关基因m RNA显著下调,相关mi RNA显著上调,其中SLC9A3基因具有最高富集度。本研究以PDCo V为研究对象,探索PDCo V感染IPI-2I细胞对候选mi RNAs、SLC9A3基因和nhe3蛋白的表达以及nhe3活性之间的关系。首先通过对IPEC-J2细胞进行胰酶耐受度测试、最佳感染复数筛选及不同猪源细胞系病毒感染能力测试,成功利用IPI-2I细胞建立PDCo V体外研究细胞模型。为验证高通量测序结果可信度,收取病毒感染不同时间点细胞裂解液,q RT-PCR检测结果显示关联网络图中涉及的10个基因m RNAs及12个mi RNAs均能够在PDCo V感染细胞后发生差异性表达,表明前期试验高通量测序结果真实可信。接着本研究探究SLC9A3/nhe3功能。为验证PDCo V感染IPI-2I细胞后影响SLC9A3基因和nhe3蛋白的表达及nhe3活性,收取病毒感染不同时间点样品进行q RT-PCR、western blotting和nhe3活性检测,结果显示SLC9A3基因表达下调、nhe3蛋白表达下调和nhe3活性下调,表明PDCo V感染能够抑制nhe3活性。为验证SLC9A3基因表达影响nhe3蛋白表达及nhe3活性,对SLC9A3基因进行过/失表达,结果表明SLC9A3基因正向调控nhe3蛋白表达和nhe3活性。使用在线靶基因预测软件将与SLC9A3基因有关系的7个mi RNAs筛选后,预测出4个与SLC9A3基因可能有靶向结合的候选mi RNAs(ssc-mi R-133a-3p、ssc-mi R-326、ssc-mi R-338、ssc-mi R-361-3p)。为探究各候选mi RNAs对SLC9A3/nhe3的影响,使用mi RNA mimics/inhibitors对mi RNA进行过/失表达,q RT-PCR和western blotting检测显示各候选mi RNAs均能不同程度负调控SLC9A3基因及nhe3蛋白的表达。通过双荧光素酶活性验证试验确定ssc-mi R-361-3p与SLC9A3基因之间存在靶向结合关系,同时转染ssc-mi R-361-3p mimics能够使nhe3活性下调,而转染ssc-mi R-361-3p inhibitors可以使nhe3活性上调,表明SLC9A3基因是ssc-mi R-361-3p的靶向基因,且ssc-mi R-361-3p负调控nhe3活性。最后通过对细胞抑制ssc-mi R-361-3p并感染PDCo V后检测nhe3活性,结果显示与对照组无显著差异,表明ssc-mi R-361-3p inhibitors逆转了PDCo V对nhe3活性的抑制作用。综上所述,本研究证实PDCo V通过mi R-361-3p-SLC9A3调控轴对IPI-2I细胞nhe3活性起抑制作用,为解析PDCo V导致仔猪严重腹泻的致病机理提供理论依据。

关键词： PDCoV ssc-mi R-361-3p SLC9A3 nhe3 腹泻

cGMP regulates Na+/H+ exchanger nhe3 by phosphorylating it at the same amino acids as cAMP but with a different time course

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cGMP regulates Na+/H+ exchanger NHE3 by phosphorylating it a...

功能性腹泻脾虚证模型大鼠肠组织钠离子通道蛋白的变化

2008北京国际生理科学学术大会

作者： CHEN TE KOCHINSKY H CHA BY ARONSON P DONOWITZ M Departments of Medicine and Physiology GI DivisionThe Johns Hopkins University School of MedicineBaltimoreMarylandUSA Departments of Internal Medicine Yale University School of MedicineNew HavenConnecticutUSA Departments of Internal Medicine Yale University School of Medicine.New HavenConnecticutUSA

＜正＞Background:The epithelial brush border Na/H exchanger nhe3 is regulated by second messengers during digestion and inhibited in diarrheal diseases.cAMP and cGMP both inhibit nhe3 activity.While cAMP is known to act by phosphorylating nhe3 at two amino acids,S552 and S605 and reducing plasma membrane nhe3 amount,how elevated cGMP acts is unknown.This study tested the hypothesis that cGMP inhibits nhe3 activity by phosphorylating nhe3 and reducing its plasma membrane expression.Methods:Studies were carried out in OK cells,a polarized renal proximal tubule cell line expressing HA-nhe3,the multi-PDZ protein nheRF2 and cGKⅡ. Inhibition by cGMP was measured with BCECF fluorometery and was correlated with changes in phosphorylation of nhe3 determined with anti-phospho-nhe3 S552 and S605 antibodies.Surface nhe3 was determined by cell surface biotinylation.Results:In the presence of nheRF2 and cGKII,cGMP inhibited nhe3 activity.This occurred rapidly,onset was at 15 min after addition of cGMP,maxium at 45mins and lasted at least 60 min.cGMP increased nhe3 phosphorylation at both S552 and S605 similar to the effect of cAMP.cGMP phosphorylation of nhe3 did not involve PKA since H89,a PKA inhibitor,did not alter cGMP-induced nhe3 phosphorylation.Unlike the time course of cAMP changes in phosphorylation which occurred quickly but lasted at least 60 min,the effect of cGMP was shorter lived,occurring at 30 but not 60 min at both S552 and S605.Cell surface biotinylation in OK/ nheRF2/HA-nhe3/cGKⅡcells showed that cytosolic nhe3 was increased by both cAMP and cGMP.Conclusions: （1）cGMP inhibits nhe3 by a cGKⅡ,nheRF2 dependent process that involves phosphorylation of nhe3 at S552 and S605 but does not involve PKA.（2）cGMP inhibition of nhe3 appears to involve a change in nhe3 trafficking. （3）cGMP-induced phosphorylation of but not inhibition of nhe3 is shorter lived than that by cAMP,suggesting involvement of different phosphatases,perhaps binding to nheRF2.（4）There is an additional,as yet unidentified, step in nhe3 inhibition by c

关键词： cGMP nhe3 phosphorylation

来源： cnki会议评论

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中国医药导报 2020年第16期17卷 8-10,15页

作者：李家立王亮白艳香季庆洁康楠济宁医学院附属医院中医科山东济宁272029 济宁医学院附属医院成人康复科山东济宁272029 济宁医学院附属医院检验科山东济宁272029

目的观察功能性腹泻脾虚证模型大鼠肠组织nhe3、Na+-K+-ATPase、ENaC等离子通道蛋白的表达变化。方法采用随机数字表法将24只3周龄雄性Wistar大鼠分为正常组和模型组,利用小平台站立法联合高乳糖饲料喂养建立功能性腹泻脾虚证模型,造模1... 详细信息

目的观察功能性腹泻脾虚证模型大鼠肠组织nhe3、Na+-K+-ATPase、ENaC等离子通道蛋白的表达变化。方法采用随机数字表法将24只3周龄雄性Wistar大鼠分为正常组和模型组,利用小平台站立法联合高乳糖饲料喂养建立功能性腹泻脾虚证模型,造模14 d后取材,采用Western blot检测肠组织中的各指标蛋白表达变化。结果造模后1 d,两组大鼠体重均显著重于造模前1 d(Pnhe3、Na+-K+-ATPase相对表达量均低于正常组(PnheRF2、PKAR2相对表达量均高于正常组(Pnhe3等Na+通道蛋白的表达下调可能是功能性腹泻脾虚证发生的分子生物学基础,值得进一步研究证实。

关键词：腹泻脾虚 Na+通道 nhe3 Na+-K+-ATPase

肾脏局部多巴胺对nhe3、ENaC的调控作用

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中国病理生理杂志 2010年第A10期26卷 2077-2077页

作者：李洪岩宋文霞郑向雨刘菲饶艳伟吉林大学白求恩医学院病理生理学系吉林长春130000