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Neural EGF-like protein 1(nell-1):Signaling crosstalk in mesenchymal stem cells and applications in regenerative medicine

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Genes & Diseases 2017年第3期4卷 127-137页

作者： Mikhail Pakvasa Alex Alverdy Sami Mostafa Eric Wang Lucy Fu Alexander Li Leonardo Oliveira Aravind Athiviraham Michael J.Lee Jennifer Moriatis Wolf Tong-Chuan He Guillermo A.Ameer Russell R.Reid The University of Chicago Pritzker School of MedicineChicagoIL 60637USA Laboratory of Craniofacial Biology and Development Section of Plastic and Reconstructive SurgeryDepartment of SurgeryThe University of Chicago Medical CenterChicagoIL 60637USA Rosalind Franklin University Chicago Medical SchoolNorth ChicagoIL 60064USA Molecular Oncology Laboratory Department of Orthopaedic Surgery and Rehabilitation MedicineThe University of Chicago Medical CenterChicagoIL 60637USA Department of Biomedical Engineering Northwestern UniversityEvanstonIL 60208USA Center for Advanced Regenerative Engineering Northwestern UniversityEvanstonIL 60208USA Department of Surgery Feinberg School of MedicineNorthwestern UniversityChicagoIL 60611USA

Bone tissue regeneration holds the potential to solve both osteoporosis and large skeletal defects,two problems associated with significant *** differentiation of mesenchymal stem cells into the osteogenic lineage requires a specific microenvironment and certain osteogenic growth *** EGF Like-Like molecule 1(nell-1)is a secreted glycoprotein that has proven,both in vitro and in vivo,to be a potent osteo-inductive ***,it has been shown to repress adipogenic differentiation and ***-1 can work synergistically with other osteogenic factors such as Bone Morphogenic Protein(BMP)2 and9,and has shown promise for use in tissue engineering and as a systemically administered drug for the treatment of *** we provide a comprehensive up-to-date review on the molecular signaling cascade of nell-1 in mesenchymal stem cells and potential applications in bone regenerative engineering.

关键词： Bone tissue engineering Mesenchymal stem cells nell-1 NEL-like protein 1 Osteogenic differentiation

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nell-1在骨组织工程中的作用与应用

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中国组织工程研究 2020年第20期24卷 3217-3225页

作者：靳良宇李伟明哈尔滨医科大学黑龙江省哈尔滨市150000 哈尔滨医科大学附属第一医院黑龙江省哈尔滨市150001

背景:Nel样分子Ⅰ型是一种外分泌型糖蛋白蛋白,一系列体内、体外研究表明Nel样分子Ⅰ型是一种有效的骨诱导因子,可以有效地促进骨的生长。此外,Nel样分子Ⅰ型还抑制脂肪分化和炎症反应。目的:就Nel样分子Ⅰ型目前在骨组织工程中的研究... 详细信息

背景:Nel样分子Ⅰ型是一种外分泌型糖蛋白蛋白,一系列体内、体外研究表明Nel样分子Ⅰ型是一种有效的骨诱导因子,可以有效地促进骨的生长。此外,Nel样分子Ⅰ型还抑制脂肪分化和炎症反应。目的:就Nel样分子Ⅰ型目前在骨组织工程中的研究进展进行综述。方法:检索PubMed数据库1996年1月至2019年6月相关文献,检索词为“nell-1;bone regeneration and repair;regulatory factor;signal path;bone morphogenetic protein;osteoporosis;marrow derived mesenchymal stem cells”。排除重复研究及与综述内容关系不密切的文献,对最终纳入的61篇文献进行分析。结果与结论:经过研究,Nel样分子Ⅰ型已被证实为是一种可以有效促进骨组织生长的因子,局部应用对长骨、脊柱生长及颅缝闭合和软骨生长具有良好的促进作用。作为一种全新的生长因子,Nel样分子Ⅰ型的生物学效应相对单一,所以相比其他骨生长因子Nel样分子Ⅰ型的生物安全性和精准性更高。Nel样分子Ⅰ型可与骨形态发生蛋白2,9等其他成骨因子产生协同作用,Nel样分子Ⅰ型抑制骨形态发生蛋白2引起的炎症反应及脂肪生成并促进其成骨作用,为Nel样分子Ⅰ型和骨形态发生蛋白2结合提高临床骨再生的安全性和有效性提供了理论基础。

关键词： nell-1 骨再生与修复调控因子信号通路骨形态发生蛋白协同作用骨质疏松骨髓间充质干细胞

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nell-1基因转染骨髓基质干细胞复合可吸收纤维蛋白胶修复犬下颌骨缺损

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第三军医大学学报 2008年第14期30卷 1327-1329页

作者：张宇陈明高杰南方医科大学南方医院口腔科广州510515 解放军总医院第二附属医院口腔科北京100091

目的探讨利用nell-1基因转染骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)复合可吸收纤维蛋白胶(fibrin glue,FG)构建组织工程化骨组织并修复犬下颌骨缺损的可行性。方法制备含nell-1真核细胞表达载体的逆转录病毒液PT-PLNCX2-nell-... 详细信息

目的探讨利用nell-1基因转染骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)复合可吸收纤维蛋白胶(fibrin glue,FG)构建组织工程化骨组织并修复犬下颌骨缺损的可行性。方法制备含nell-1真核细胞表达载体的逆转录病毒液PT-PLNCX2-nell-1并转染BMSC,使用免疫组织化学的方法检测nell-1在BMSC中的表达。犬下颌骨缺损修复实验分为4组:转染组、未转染组、单纯FG组和对照组,每组4个样本。分别于术后8、16周采用大体观察、X线、组织学检测等方法对骨缺损修复情况进行对比。结果免疫组织化学检测显示经nell-1病毒液转染的BMSC中有较强的阳性结果出现。定量检测分析结果证实经转染的BMSC修复骨缺损的成骨速度和成骨量均优于未转染组,单纯FG组和对照组中均未见骨缺损得到修复。结论nell-1基因转染能够提高BMSC形成组织工程化骨组织和修复骨缺损的能力,可用于以BMSC为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。

关键词： nell-1 骨缺损基因转染

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成骨诱导因子nell-1及Noggin短发卡RNA联合转染脂肪间充质干细胞的促成骨分化能力

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中国组织工程研究 2020年第31期24卷 4966-4970页

作者：刘浩刘军芮永军汤峰林陆淼丁涛无锡市第九人民医院骨科江苏省无锡市214000 南京医科大学附属无锡人民医院骨科江苏省无锡市214000

背景:nell-1在诱导成骨分化和新骨形成中的作用已有报道,但试图通过双基因联合转染起协同成骨作用的研究很少。目的:体外环境下抑制细胞中Noggin基因的同时上调nell-1基因,观察其对脂肪间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:取健康成... 详细信息

背景:nell-1在诱导成骨分化和新骨形成中的作用已有报道,但试图通过双基因联合转染起协同成骨作用的研究很少。目的:体外环境下抑制细胞中Noggin基因的同时上调nell-1基因,观察其对脂肪间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:取健康成年大鼠脂肪组织获取脂肪间充质干细胞。将细胞分为3组,对照组转染空载体病毒Lv-EGFP(增强型绿色荧光蛋白),nell-1组单纯转染Lv-nell-1,nell-1+Noggin shRNA组同时转染Lv-nell-1和Lv-Noggin shRNA。转染后3,7,14 d,应用实时荧光定量PCR检测nell-1及成骨相关标志物(Col-Ⅰ、ALP、OCN)的表达,转染后14 d行茜素红染色。结果与结论:①转染后3 d,对照组nell-1 mRNA相对表达量与nell-1组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。与nell-1+Noggin shRNA组比较,对照组和nell-1组nell-1 mRNA表达量偏低,差异均有显著性意义(P14 d,nell-1+Noggin shRNA组nell-1 mRNA相对表达量仍高于对照组和nell-1组,且nell-1组高于对照组,两两比较差异均有显著性意义(P14 d,nell-1+Noggin shRNA组各成骨基因mRNA相对表达量均显著高于对照组和nell-1组,且nell-1组高于对照组,组间比较差异有显著性意义(P14 d,nell-1+Noggin shRNA组呈现较多细胞聚集形成的结节,nell-1组钙结节数量少于nell-1+Noggin shRNA组,对照组未见明显被染色的钙结节;④实验结果表明,nell-1基因可以促进大鼠脂肪间充质干细胞成骨分化,而干扰Noggin基因会上调nell-1基因的表达,形成显著的协同成骨分化作用。

关键词： nell-1 Noggin 共转染脂肪间充质干细胞成骨分化

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nell-1蛋白通过Wnt/β-catenin通路调控人上颌窦黏膜来源间充质干细胞成骨分化

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口腔医学研究 2023年第3期39卷 227-235页

作者：徐静吕慧欣王一涵鲍鑫张逸周延民吉林大学口腔医院种植科吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室吉林长春130012 吉林大学口腔医院修复科吉林长春130012

目的:研究不同浓度nell-1(Nel-like type 1 molecule)蛋白对人上颌窦黏膜来源间充质干细胞(maxillary sinus membrane-derived mesenchymal stem cells,MSMSCs)成骨分化的影响。方法:体外分离培养并鉴定人MSMSCs。使用nell-1蛋白(10、100、1000 ng/mL)诱导MSMSCs,利用CCK-8法和细胞活死染色法检测细胞活性变化;碱性磷酸酶活性检测细胞成骨能力改变;实时定量荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)检测成骨相关因子mRNA表达情况;免疫荧光染色和Western blot法检测成骨蛋白表达情况。结果:nell-1蛋白对MSMSCs有一定的促增殖作用;碱性磷酸酶活性检测显示各实验组成骨效果优于对照组;qRT-PCR、免疫荧光染色和Western blot结果显示,100 ng/mL的nell-1显著促进β-catenin、Runx-2、OCN等mRNA及蛋白的表达(P1)。结论:nell-1蛋白可通过上调Wnt/β-catenin信号通路的表达提高MSMSCs体外成骨分化能力。

关键词：间充质干细胞骨再生上颌窦 nell-1

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nell-1对LPS诱导的巨噬细胞极化的影响及机制研究

Nell-1对LPS诱导的巨噬细胞极化的影响及机制研究

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作者：陈悦山东大学

学位级别：硕士

目的巨噬细胞作为牙髓组织中重要的免疫细胞之一,具有高度的可塑性,通常被分为两个主要亚群,即经典活化的促炎型M1型巨噬细胞和选择活化的抗炎修复型M2型巨噬细胞,巨噬细胞的生理与牙髓损伤及修复密切相关,调控巨噬细胞生理对牙髓修复... 详细信息

目的巨噬细胞作为牙髓组织中重要的免疫细胞之一,具有高度的可塑性,通常被分为两个主要亚群,即经典活化的促炎型M1型巨噬细胞和选择活化的抗炎修复型M2型巨噬细胞,巨噬细胞的生理与牙髓损伤及修复密切相关,调控巨噬细胞生理对牙髓修复再生具有重要意义。Nel样1型分子(neural EGFL like 1,nell-1)作为一种新型骨生长因子,在骨再生中具有重要应用价值。近年来nell-1被发现具有多种生物学功能包括促进软骨形成,抑制破骨细胞活性,促进成骨,抑制炎症,促进血管形成等。本课题组前期研究发现nell-1在牙本质再生及牙神经再生中发挥正调节作用,且nell-1在大鼠牙髓损伤模型中能抑制早期牙髓炎症并促进修复性牙本质再生,但nell-1对巨噬细胞的调控作用未见报道,了解nell-1抗炎修复机制将为nell-1的临床应用提供理论参考依据。本课题组旨在探讨nell-1对巨噬细胞极化的影响及可能的信号调控机制,为活髓保存治疗及牙髓炎的控制提供理论参考。材料和方法1.人髓系白血病单核细胞(humanmyeloidcellline,THP-1)来源巨噬细胞的培养与诱导人单核细胞系THP-1细胞系购买于中国科学院细胞库。100 ng/ml佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导 THP-1 细胞培养 48 小时成为贴壁的巨噬细胞。***-1对THP-1巨噬细胞活力的影响及药物浓度筛选细胞活性检测试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)检测不同浓度(0、100 ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml)的 nell-1 对 THP-1 巨噬细胞活力的影响。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测不同浓度(0、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、800 ng/ml)的 nell-1 和 100 ng/ml 的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共刺激巨噬细胞24小时后,白细胞分化抗原86(cluster of differentiation 86,CD86)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的mRNA表达水平变化,筛选后续实验nell-1的最佳浓度。***-1对LPS诱导的巨噬细胞M1/M2极化的影响不同浓度的nell-1(400 ng/ml、800 ng/ml)单独或和100 ng/ml的LPS共刺激THP-1巨噬细胞24小时后,利用qRT-PCR技术检测nell-1对THP-1巨噬细胞M1极化相关基因白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)及M2极化相关基因白细胞分化抗原206(cluster of differentiation 206,CD206)、白细胞分化抗原 163(cluster of differentiation 163,CD163)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)、白细胞介素 10(interleukin-10,IL-10)及转化生长因子 β1(transforming growth factor β,TGF-β1)的表达水平的影响。酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测 nell-1 对 THP-1 巨噬细胞 M1 极化相关因子IL-1 β和TNF-α分泌的影响。蛋白质免疫印迹法Western blot检测nell-1对THP-1巨噬细胞M2极化相关蛋白VEGF和CD206表达水平的影响。流式细胞术及免疫细胞荧光检测nell-1对巨噬细胞M1极化表面标记CD86及M2极化表面标记CD163、CD206表达的影响。***-1 对 LPS 诱导的巨噬细胞核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路的影响不同浓度的nell-1(400 ng/ml、800 ng/ml)单独或和100 ng/ml的LPS共刺激THP-1巨噬细胞24小时后,利用Western blot技术检测NF-κB信号通路相关蛋白p65、IκBα、IKKβ及KKα磷酸化水平。免疫荧光技术检测NF-κB信号通路p65的核易位情况。结果1.100 ng/ml的PMA诱导THP-1细胞48 h后,细胞贴壁生长,细胞体积增大,少数细胞有伪足伸出,形态不规则。***-8结

关键词： nell-1 巨噬细胞极化细菌脂多糖炎症因子 NF-κB信号通路

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nell-1基因诱导大鼠脊柱后外侧融合的实验研究

Nell-1基因诱导大鼠脊柱后外侧融合的实验研究

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作者：邹俊苏州大学

学位级别：硕士

背景:自体骨移植的脊柱后外侧融合是临床上一种常见的脊柱融合方式,但该方法仍然有些尚未解决的问题,比如潜在的供骨区感染和顽固性疼痛,手术时间和术中失血的增加。据估计,单椎体间自体髂骨骨移植脊柱融合的病人中约5%-35%不愈合。即... 详细信息

背景:自体骨移植的脊柱后外侧融合是临床上一种常见的脊柱融合方式,但该方法仍然有些尚未解决的问题,比如潜在的供骨区感染和顽固性疼痛,手术时间和术中失血的增加。据估计,单椎体间自体髂骨骨移植脊柱融合的病人中约5%-35%不愈合。即便辅以内固定,仍有10%-15%的脊柱融合病人发生假关节。为了解决这些问题,一些骨移植替代物应运而生,其中应用最为广泛的就是骨形态发生蛋白。它是一种骨诱导能力很强的细胞因子,但经过多年来的研究和临床上的应用,一些学者也发现了BMP一些不理想之处,如异位骨化能力太强,刺激移植区骨过度生长,造成一些相应的并发症。同时BMP生理需要剂量较大,提高了医疗成本。因此,进一步探求更好的骨移植替代物就成为了一种需要。目的:评价以脱钙骨基质(DBM)作为载体由腺病毒介导的nell-1基因在大鼠脊柱后外侧融合模型中的成骨作用。nell-1是一种新型的骨诱导蛋白,发现于颅缝早闭的患者中。经过研究分析后认为nell-1可以导致了骨的成熟,加速了骨的形成。方法:20只Athymic大鼠分为两组,一组植入腺病毒介导的nell-1基因,另一组植入腺病毒介导的LacZ基因,均以DBM为载体。所有大鼠进行脊柱后外侧融合,于手术后6周被处死。我们分别在2、4、6周时对大鼠进行X线摄片,6周后进行手触力学评定,MicroCT检查和组织学切片观察。结果:6周之后腺病毒介导的Adnell-1基因组的融合率明显高于AdLacZ组。在手触力学评定和MicroCT检查中,Adnell-1组融合率为80%,AdLacZ组融合率为20%;在组织学切片观察中,Adnell-1组融合率为70%,AdLacZ组融合率为20%。骨成熟度的观察中显示Adnell-1组有着更高的骨成熟度。结论:以DBM为载体由腺病毒介导的nell-1基因可以在大鼠脊柱后外侧形成很好的骨性融合。由于它能够比BMP更加专一地作用于骨细胞分化增殖,nell-1基因将成为一个很有前景的骨诱导因子。同时本实验也证明了腺病毒作为基因治疗载体系统是十分稳定有效的,而MicoCT作为一种新的评价脊柱融合的方法,可以更准确的获得高质量图像,并根据进行三维重建,精确地评价整个脊柱的骨性结构,值得推广。

关键词： nell-1 脊柱融合骨诱导生长因子

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nell-1在小鼠牙胚发育及人牙髓牙本质复合体中表达的免疫组化研究

Nell-1在小鼠牙胚发育及人牙髓牙本质复合体中表达的免疫组化研究

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作者：唐荣华山东大学

学位级别：硕士

目的： nel样Ⅰ型基因（nel-like type Ⅰ gene,nell-1）是一种在颅缝早闭者早闭区过度表达的新型基因,因其与在鸡神经中特异性表达的nel基因结构十分相似,故命名为nel样Ⅰ型基因。nell-1基因具有调节成骨相关基因表达、诱导成骨细... 详细信息

目的： nel样Ⅰ型基因（nel-like type Ⅰ gene,nell-1）是一种在颅缝早闭者早闭区过度表达的新型基因,因其与在鸡神经中特异性表达的nel基因结构十分相似,故命名为nel样Ⅰ型基因。nell-1基因具有调节成骨相关基因表达、诱导成骨细胞分化和促进骨质形成的作用。其编码形成的蛋白nell-1是近年来新发现的一种具有类表皮细胞生长因子编码结构并在颅面部等神经嵴来源的组织中特异性表达的分泌性蛋白。动物实验及体外实验表明,nell-1可特异性地诱导成骨细胞分化,促进矿化,诱导骨的形成及再生。研究表明,nell-1是Runx2的下游基因,受Runx2的直接调控。Runx2（Runt-related transcription factor2）,作为骨和牙胚发育过程中的重要转录因子,通过调节成骨细胞和成牙本质细胞的分化,调控相关目的基因的表达来促进硬组织的形成和牙胚的发育。牙体组织与颅面骨均为神经嵴来源,成牙本质细胞和成骨细胞都来源于间充质细胞,基因结构上具有很多相似性;并且nell-1受骨和牙胚发育的重要转录因子Runx2的直接调控,因此我们推测nell-1可能在牙胚发育,成牙本质细胞分化和牙本质形成中同样发挥调节作用。基于以上推测,本课题的目的为通过免疫组织化学的方法研究nell-1在小鼠牙胚发育及人牙髓牙本质复合体中的表达和分布,为研究nell-1在牙胚发育和牙本质形成的作用提供实验依据。方法、结果和结论：实验一：利用免疫组织化学技术检测nell-1在小鼠第一磨牙牙胚发育过程中的表达和分布,初步研究nell-1在牙胚发育中的调节作用。结果显示nell-1在小鼠第一磨牙牙胚发育过程中的不同阶段呈现不同的表达和分布。在胚胎第13.5天（E13.5）和E14.5,nell-1表达于整个成釉器和其中周围的间充质细胞中。在E16.5天,nell-1在内釉上皮层、外釉上皮层、中间层、第二釉结和牙乳头细胞中有表达。在E18.5天,nell-1的阳性表达见于发育中的成釉细胞和成牙本质细胞、中间层及外釉上皮层。在出生后第2.5天（P2.5）、P5和P7,nell-1表达于成熟的成釉细胞和成牙本质细胞（包括成牙本质细胞的胞体和突起）以及未成熟的釉质中。在P7天出现的上皮根鞘中,nell-1也呈阳性表达。在P13.5天,nell-1的阳性表达仅见于缩余釉上皮和成牙本质细胞,而在成熟的釉质中无表达。在小鼠第一磨牙萌出过程中（P28）,nell-1仅在成牙本质细胞的胞体和突起以及血管内皮细胞中表达。因此,nell-1在牙胚发育过程中的时空表达提示,nell-1可能在成釉细胞和成牙本质细胞的分化、釉质基质的分泌和矿化、牙冠的形态发生以及牙根形成中发挥重要的调节作用。实验二：通过收集并制备离体人牙标本,利用免疫组织化学技术,研究nell-1在人牙髓牙本质复合体中的分布及表达情况,初步探讨nell-1在牙本质形成中的作用。实验结果显示,在正常及龋坏人牙髓牙本质复合体中,nell-1均表达于成牙本质细胞（包括成牙本质细胞的胞体和突起）、部分成纤维细胞及血管内皮细胞中。此外,在牙髓钙化的人牙髓牙本质复合体中,髓石周边、弥漫性钙化物及纤维变性的根髓组织区,同样存在nell-1的阳性表达。实验结果提示,nell-1可能在成牙本质细胞的分化、牙本质的形成及髓石矿化中发挥调节作用。

关键词： nell-1 牙胚发育成牙本质细胞分化牙骺牙本质复合体牙本质形成牙髓钙化

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生理性拉应力通过nell-1/Ihh信号调控小鼠软骨细胞分化的机制研究

生理性拉应力通过Nell-1/Ihh信号调控小鼠软骨细胞分化的机制研究

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作者：董紫薇吉林大学

学位级别：硕士

目的:探讨生理性拉应力通过nell-1/Ihh信号对小鼠软骨细胞分化的影响,进而明确拉应力通过机械力信号的生物转导调控软骨细胞分化的相关机制,以期为临床上寻找快速、高效促进颞下颌关节改建及下颌骨生长的方法提供理论依据。方法:1.体外... 详细信息

目的:探讨生理性拉应力通过nell-1/Ihh信号对小鼠软骨细胞分化的影响,进而明确拉应力通过机械力信号的生物转导调控软骨细胞分化的相关机制,以期为临床上寻找快速、高效促进颞下颌关节改建及下颌骨生长的方法提供理论依据。方法:1.体外培养小鼠软骨细胞系ATDC5,将细胞接种于79 mm×40 mm×1.38 mm的细胞应变片上,应用四点弯曲细胞力学加载仪对细胞施加生理性拉应力。加力组设置加力力值为2000μstrain,加力时间为2 h,相当于细胞发生0.2%的形变量,同时设置未加力细胞作为对照组。采用实时荧光定量PCR检测软骨分化相关基因(Col-2、Col-10、Aggrecan、Sox9、VEGF)和增殖相关标志物PCNA的表达情况。2.将出生21天的B6雄性小鼠12只随机分为前导组和对照组(n=6)。前导组:每3天剪短1 mm下前牙,促使小鼠下颌前伸,并配合正常饮食,下颌前导2周,对照组:未进行任何处置,饲养条件相同。通过HE染色进行髁突形态学观察,通过micro CT进行下颌骨及髁突线性数据测量。3.通过对ATDC5细胞施加2000μstrain/不同时间(0、1、2和4 h)和不同力值(0、1000、2000和3000μstrain)/2 h的拉应力,采用实时荧光定量PCR检测nell-1、Runx2、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1基因的表达情况,采用western blotting检测Runx2、nell-1和Ihh的表达水平。4.采用免疫组织化学验证前导组和对照组小鼠髁突nell-1和Ihh的表达情况。5.对ATDC5细胞使用Ihh信号通路抑制剂环巴胺(10μM)进行预处理,施加2000μstrain/2 h的拉应力后,采用实时荧光定量PCR检测nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1的基因表达情况,采用western blotting检测nell-1和Ihh的表达水平。结果:1.在生理性拉应力刺激下,与对照组相比,加力组的软骨分化标志物(Col-2、Col-10、Aggrecan、Sox9、VEGF)和增殖相关标志物PCNA的表达均明显上升(P1)。2.小鼠下颌前导2周,HE结果显示,与对照组相比,前导组髁突的软骨全层厚度明显增加(P1)。micro CT结果显示,下颌前伸能有效促进小鼠下颌升支增长量,下颌长度增长量和髁突长度增长量的变化。(P1)。但对髁突前后径、内外径增长量和骨矿化密度增长没有统计学差异(P>0.05)。3.对ATDC5细胞施加2000μstrain/不同时间(0、1、2和4 h)和不同力值(0、1000、2000和3000μstrain)/2 h拉应力,与对照组相比,各组Runx2、nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1的表达均明显上升(P1)。Runx2的基因表达水平随加力时间的延长或力值的增长而逐渐上升(P1),但nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1的基因表达水平则在早期逐渐升高,在条件为2000μstrain/2 h时达到最高,随后出现回落但仍明显高于对照组(P1)。4.免疫组织化学显示,对照组与前导组的髁突均有nell-1和Ihh的阳性表达。与对照组相比,前导组髁突中nell-1、Ihh的表达增多(P1、Gli-1和Hhip-1的基因表达水平与对照组相比均明显降低(P1),nell-1的表达水平与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。对经过预处理的软骨细胞加力后,nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1的表达水平均明显上升(P1)。结论:1.生理性拉应力可以促进软骨细胞的增殖分化。***-1可以对拉应力产生应答,产生时间依赖性和力值依赖性。***-1位于Ihh信号通路的上游,且在拉应力刺激下nell-1激活Ihh信号通路,从而调控软骨细胞的分化。

关键词：生理性拉应力软骨细胞 nell-1 Ihh信号通路

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正常及炎性微环境下nell-1与BMP-2联合应用对钛片上成骨细胞分化的影响

正常及炎性微环境下NELL-1与BMP-2联合应用对钛片上成骨细胞分化...

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作者：房奕漩山东大学

学位级别：硕士

目的:骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)可以促进骨再生和骨整合,在临床具有较好的应用背景,然而其带来的异位成骨、脂肪形成、炎症等问题也给临床的应用带来困扰。前期研究发现,Nel样Ⅰ型分子蛋白(Nel-like molecul... 详细信息

目的:骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)可以促进骨再生和骨整合,在临床具有较好的应用背景,然而其带来的异位成骨、脂肪形成、炎症等问题也给临床的应用带来困扰。前期研究发现,Nel样Ⅰ型分子蛋白(Nel-like molecule-1,nell-1)在成骨分化和骨再生中起重要作用。有研究表明,临床上应用的喷砂-酸蚀(sandblasted,large-grit and acid-etched,SLA)表面处理的钛种植体对骨整合、抗炎起一定作用。本实验的目的是研究nell-1和BMP-2在喷砂-酸蚀处理的钛片表面联合应用对正常环境下和炎性微环境下小鼠颅顶前骨细胞MC3T3细胞系成骨向分化的影响,为临床上减少种植体修复周期、预防种植体周围炎的发生提供理论指导及实验室依据,以期提高临床种植体修复的成功率。材料和方法:1.将MC3T3用成骨分化培养基分别诱导7d、14d、21d、28d,用ALP(碱性磷酸酶)染色、茜素红染色来鉴定MC3T3细胞系的成骨分化能力。2.将MC3T3接种到普通培养板和喷砂-酸蚀表面处理的钛片上,通过细胞计数板和CCK8细胞活性检测法检测钛片对细胞增殖活性的影响以及nell-1、BMP-2对钛片上细胞增殖活性的影响。3.用不含或含有800 ng/ml nell-1和100 ng/ml BMP-2的成骨分化培养基诱导钛片上的MC3T3细胞3 d、7 d、14 d,用qRT-PCR法检测不同时间点成骨相关基因ALP、COLα1、OPN、Runx2的表达。4.用不含或含有10 ng/ml、100 ng/ml、1μg/ml、2.5 μg/ml LPS的成骨分化培养基诱导钛片上的MC3T3细胞24 h、48 h,用qRT-PCR法检测不同时间点炎症相关基因IL6、IL8的表达。5.利用实验四得出的LPS最低有效浓度,在含有100 ng/ml LPS的成骨分化培养基中加入 100 ng/ml nell-1 或 100 ng/ml nell-1 和 100 ng/ml BMP-2,诱导钛片上的MC3T3细胞6 h、12 h、24 h,用qRT-PCR法检测不同时间点炎症相关基因IL6、IL8的表达。6.在含有100 ng/ml LPS的成骨分化培养基中加入100 ng/ml nell-1或100 ng/ml nell-1 和 100 ng/ml BMP-2,诱导钛片上的 MC3T3 细胞 3 d、7 d,用qRT-PCR法检测不同时间点成骨相关基因ALP、COLα1、Runx2的表达。结果:***3T3细胞在喷砂-酸蚀表面处理的钛片上呈指数增长,与普通培养板上相比细胞数量增长较慢。***-1对钛片上MC3T3的增殖无明显影响;BMP-2在1 d、3d时对钛片上MC3T3的增殖无明显影响,6 d时对钛片上MC3T3的增殖有抑制作用。3.用 800 ng/ml nell-1 和 100 ng/ml BMP-2 联合作用钛片上 MC3T3 细胞 3 d、7 d后,ALP、COLα1、OPN、Runx2的表达水平明显上调。作用14 d后,COLα1、OPN、Runx2的表达水平明显上调。4.用不含或含有10 ng/ml、100 ng/ml、1μg/ml、2.5μg/ml LPS的成骨分化培养基诱导钛片上的细胞24 h、48 h,结果发现LPS的致炎作用有剂量依赖性,100 ng/ml LPS能在24h、48h持续引起IL6、IL8的表达上调。5.在含有100 ng/ml LPS的成骨分化培养基中不加或加入100 ng/ml nell-1或100ng/mlnell-1 和 100ng/ml BMP-2,诱导钛片上的细胞 12h 时 nell-1 能明显抑制IL6的表达,诱导6 h、24 h时nell-1能明显抑制IL8的表达;nell-1和BMP-2联合应用后,IL6、IL8的表达量与nell-1组相比有所升高,但与对照组相比无明显差异。6.在含有100 ng/ml LPS的成骨分化培养基中不加或加入100 ng/ml nell-1或100 ng/ml nell-1 和 100 ng/ml BMP-2,nell-1 诱导钛片上的细胞 7 d 时明显促进COLα1的表达;nell-1和BMP-2联合应用后,诱导7d能明显促进ALP、COLα1和Ruxn2的表达,且对ALP的促进作用在3 d、7 d时均明显强于单独使用nell-1组。结论:***-1与BMP-2联合应用对钛片上MC3T3成骨相关基因的表达有明显促进作用。2.在炎性微环境下,nell-1对钛片上MC3T3细胞炎症相关基因的表达有抑制作用;nell-1和BMP-2联合应用对钛片上MC3T3的炎症相关基因的表达无

关键词： nell-1 BMP-2 钛炎症成骨分化

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