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An unexpected similarity between antibiotic-resistant ndm-1 and beta-lactamaseⅡfrom Erythrobacter litoralis

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Protein & Cell 2011年第3期2卷 250-258页

作者： Beiwen Zheng Shuguang Tan Jia Gao Huiming Han Jun Liu Guangwen Lu Di Liu Yong Yi Baoli Zhu George F.Gao CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology Institute of MicrobiologyChinese Academy of SciencesBeijing 100101China College of Life Sciences Graduate UniversityChinese Academy of SciencesBeijing 100101China The Key Laboratory of Ministry of Education for Microbial and Plant Genetic Engineering Guangxi UniversityNanning 530004China Network Information Center Institute of MicrobiologyChinese Academy of SciencesBeijing 100101China The 306th Hospital of Chinese PLA China Beijing Institutes of Life Science Chinese Academy of SciencesBeijing 100101China

ndm-1(New Delhi metallo-beta-lactamase)gene encodes a metallo-beta-lactamase(MBL)with high carbapenemase activity,which makes the host bacterial strain easily dispatch the last-resort antibiotics known as carbapenems and cause global concern.Here we present the bioinformatics data showing an unexpected similarity between ndm-1 and beta-lactamase II from Erythrobacter litoralis,a marine microbial isolate.We have further expressed these two mature proteins in E.coli cells,both of which present as a monomer with a molecular mass of 25 kDa.Antimicrobial susceptibility assay reveals that they share similar substrate specificities and are sensitive to aztreonam and tigecycline.The conformational change accompanied with the zinc binding visualized by nuclear magnetic resonance,Zn2+-bound ndm-1,adopts at least some stable tertiary structure in contrast to the metal-free protein.Our work implies a close evolutionary relationship between antibiotic resistance genes in environmental reservoir and in the clinic,challenging the antimicrobial resistance monitoring.

关键词： ndm-1 metallo-β-lactamase Erythrobacter litoralis similarity antibiotics resistance

亚胺培南对携带bla_(ndm-1)耐药基因的Escherichia coli耐药性及内膜secY、secE和secG转录水平的影响

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中国抗生素杂志 2023年第9期48卷 1048-1056页

作者：吴兆猛赵琼吴玲玲王祖华余春芳金志雄湖北医药学院基础医学研究所十堰442000 湖北医药学院附属国药东风总医院检验部十堰442008 湖北医药学院附属太和医院输血科十堰442000

目的探讨亚胺培南(IPM)对bla_(ndm-1)阳性Escherichia coli耐药性及其内膜secY、secE和secG转录水平的影响。方法以重组质粒pET28a(+)-bla_(ndm-1)转化菌株E.coli DH5α-bla_(ndm-1)和E.coli BL21(DE3)-bla_(ndm-1)为研究对象,在梯度浓度增加或撤消IPM暴露下传代培养菌株,检测17种抗生素对IPM暴露菌株的MIC值;SDS-PAGE凝胶电泳检测ndm-1表达;蛋白活性实验检测ndm-1活性;qRT-PCR检测bla_(ndm-1)及内膜secY、secE和secG转录水平。结果12μg/mL和0_(20)μg/mL IPM暴露的E.coli DH5α-bla_(ndm-1)菌株CFZ、CXM、FOX、CRO、CAZ、FEP等头孢类药物的MIC值(≥8μg/mL/≥8μg/mL、≥32μg/mL/≥32μg/mL、≥32μg/mL/≥32μg/mL、≥64μg/mL/=32μg/mL、≥32μg/mL/≥32μg/mL、≥32μg/mL/=8μg/mL)与0μg/mL IPM暴露MIC值(≤2μg/mL、=16μg/mL、≤8μg/mL、≤1μg/mL、≤4μg/mL、≤2μg/mL)相比均显著增高,而IPM和MEM的MIC值与0μg/mL IPM暴露(≤1μg/mL和≤1μg/mL)相比也显著增高(=8μg/mL/=8μg/mL和=4μg/mL/=4μg/mL)。12μg/mL和0_(20)μg/mL IPM暴露的E.coli BL21(DE3)-bla_(ndm-1)菌株FOX、CRO、FEP等头孢类药物的MIC值(≥32μg/mL/≥32μg/mL、≥64μg/mL/≥64μg/mL、=16μg/mL/=16μg/mL)与0μg/mL IPM暴露(≤8μg/mL、≤1μg/mL、≤2μg/mL)相比也均显著增高,而IPM和MEM的MIC值与0μg/mL IPM暴露(≤1μg/mL和≤1μg/mL)相比也均显著增高(≥16μg/mL/≥16μg/mL和≥16μg/mL/≥16μg/mL)。SDS-PAGE显示,随12μg/mL IPM暴露时间的延长,菌株ndm-1水解IPM活性增加。qRT-PCR显示,12μg/mL IPM暴露的E.coli DH5α-bla_(ndm-1)和E.coli BL21(DE3)-bla_(ndm-1)的bla_(ndm-1)、secY、secE和secG转录水平分别上调2.31/2.5、3.05/1.96、2.83/1.24和2.71/1.45倍。结论IPM可使bla_(ndm-1)阳性E.coli由碳青霉烯类敏感变为耐药且保持稳定,细菌内膜SecYEG跨膜通道蛋白参与菌株耐药性调控,这为认识抗生素压力下肠杆菌科细菌耐药性变化及指导临床合理用药提供理论支撑。

关键词：亚胺培南暴露 Escherichia coli ndm-1 SecYEG

同时产碳青霉烯酶ndm-1和ndm-5的猪源大肠埃希氏菌的鉴定及耐药性研究

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生物技术通报 2022年第9期38卷 106-115页

作者：李海利郎利敏张青娴游一朱文豪王治方张立宪王克领河南省农业科学院畜牧兽医研究所郑州450002

为了解携带碳青霉烯酶ndm-1及其亚型在猪场的流行情况,对来自猪场产房仔猪腹泻病例分离鉴定的87株大肠杆菌进行了碳青霉烯酶ndm-1和ndm-5的耐药基因扩增及测序。从87株大肠杆菌中分离鉴定出一株同时携带碳青霉烯酶ndm-1和ndm-5的大肠埃... 详细信息

为了解携带碳青霉烯酶ndm-1及其亚型在猪场的流行情况,对来自猪场产房仔猪腹泻病例分离鉴定的87株大肠杆菌进行了碳青霉烯酶ndm-1和ndm-5的耐药基因扩增及测序。从87株大肠杆菌中分离鉴定出一株同时携带碳青霉烯酶ndm-1和ndm-5的大肠埃希菌(Escherichia coli),并命名为HN2106。为深入了解HN2106全基因组及其携带的质粒和耐药基因情况,对NH2106进行了16S rRNA菌种鉴定,bla耐药基因确认,全基因组测序,应用BLAST和MEGA软件对序列进行生物信息学分析、系统进化树分析。结果显示,该菌株含有7个质粒(plasmid A、plasmid B、plasmid C、plasmid D、plasmid E、plasmid F 和plasmid G),3种类型,分别为Col、IncFII、IncQ1。同时携带ndm-1和ndm-5基因,属B族β-内酰胺酶,其中bla位于质粒pndm-HN2106(plasmid C)上,bla位于质粒pndm5-HN2106(plasmid B)上,分别介导bla和bla耐药基因,是耐药菌传播的重要载体。全基因组耐药基因预测HN2106同时还携带21种类型的抗生素耐药基因。对HN2106菌株进行了85种抗菌药物敏感性测试,结果显示,HN2106菌株对亚胺培南、青霉素G等均耐药,对磺胺甲恶唑、头孢美唑等敏感。研究结果表明,养殖场ndm-1耐药质粒是ndm-1及其亚型耐药基因的重要载体,对养殖产业健康养殖和公共卫生安全带来较大隐患和威胁,应加强抗菌药物的合理应用和感染的防控措施,重视细菌耐药性的监测工作,以期为临床耐药菌株感染的防治提供理论参考。

关键词：碳青霉烯酶 ndm-1 ndm-5 大肠埃希氏菌细菌耐药

Characterization of ndm-1-producing carbapenemase in Acinetobacter spp.and E.coli isolates from diseased pigs

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Frontiers of Agricultural Science and Engineering 2015年第3期2卷 223-229页

作者： Rongmin ZHANG Yang WANG Zhihai LIU Jiyun LI Wenjuan YIN Lei LEI Congming WU Jianzhong SHEN Beijing Key Laboratory of Detection Technology for Animal-Derived Food Safety College of Veterinary MedicineChina Agricultural UniversityBeijing 100193China

In recent years,the mobile metallo-β-lactamase(MBL)genes have been found to correspond to one of the most important resistance characters identified in Gramnegative bacteria,severely affecting clinical chemotherapy and threatening public health.The prevalence of mobile MBL genes and their flanking regions in Gram-negative bacteria from diseased pigs in China was investigated.A total of 334 lung samples from diseased pigs were screened for Gram-negative bacteria classified as non-susceptible to meropenem(MIC≥4mg·L^(–1)).Six isolates,including three Escherichia coli,two Acinetobacter baumanii and one A.calcoaeticus,exhibitedMBL production and carried the blandm-1 gene.S1-PFGE and Southern blot analysis showed that the blandm-1 gene was located on the chromosome of one A.baumanii isolate and on plasmids of various sizes in the other five isolates.MIC testing using broth microdilution revealed that all blandm-1-carrying isolates and some of their transconjugants exhibited resistance to almost allβ-lactams tested.Whole genome sequencing revealed that the flanking region of the blandm-1 gene from all porcine isolates had high levels of similarity with the corresponding regions in human isolates.One porcine E.coli isolate carrying blandm-1 was typed as ST48,a common sequence type in human E.coli isolates.These results suggest the possibility of human-tofood animal transfer of blandm-1-producing E.coli,highlighting the need for surveillance of carbapenemase producers among bacteria from food animals.In addition,the prudent use of antimicrobial agents to decrease the opportunities for co-selection of carbapenemase genes in food animals is also urgently needed.

关键词： carbapenemase ndm-1 ISAba125 Enterobacteriaceae food safety

碳青霉烯酶ndm-1抑制剂的ELISA筛选方法的建立

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中国动物传染病学报 2023年

作者：蔡鑫姚晓慧聂万森杜汉宇周黎笋李宗杰魏建超刘珂邵东华邱亚峰马志永李蓓蓓夏利宁新疆农业大学动物医学学院中国农业科学院上海兽医研究所

本研究之目的为建立一种新型的筛选碳青霉烯酶ndm-1抑制剂的ELISA方法，该方法基于细菌青霉素结合蛋白（PBP）与碳青霉烯药物完整结构和水解产物的亲和力差异极大的原理。其基本步骤为：BSA与美罗培南的偶联物（BSA-MEM）包被于ELISA板... 详细信息

本研究之目的为建立一种新型的筛选碳青霉烯酶ndm-1抑制剂的ELISA方法，该方法基于细菌青霉素结合蛋白（PBP）与碳青霉烯药物完整结构和水解产物的亲和力差异极大的原理。其基本步骤为：BSA与美罗培南的偶联物（BSA-MEM）包被于ELISA板封闭后，将待筛化合物与ndm-1蛋白同时加入反应，随后加入生物素标记的PBP蛋白（PBP-BIO），PBP-BIO可与未被水解的BSA-MEM进行结合，通过生物素-链霉亲和素系统产生的信号来表征结合的PBP蛋白以及未被水解的BSA-MEM的量，从而间接指征待筛化合物对ndm-1是否有抑制活性。通过原核表达系统，表达纯化碳青霉烯酶ndm-1，利用EDC偶联法和生物素标记法，制备BSA-MEM和PBP-BIO的偶联物，采用棋盘滴定法确定BSA-MEM量、ndm-1、待筛化合物和PBP-BIO的最佳工作浓度和反应时间等参数，并利用该方法对FDA批准药物库中的300余种化合物进行初步筛选。结果显示，最佳ELISA方案为：BSA-MEM偶联物包被量为1 μg，100 μL/孔；封闭液为1%的牛血清白蛋白，作用时间为2 h；ndm-1使用量为4 μg；待筛化合物的使用浓度为30 μmol/L，反应时间为15 min；PBP-BIO稀释度为1︰1 000，反应时间为15 min；SA-HRP作用时间为30 min，稀释度为1:3 000；TMB显色时间为15 min。利用上述建立的ELISA方法，成功从FDA批准药物库中筛选到两个潜在的ndm-1抑制剂。本研究成功建立了一种新型的ndm-1抑制剂的ELISA筛选方法，具有快速和高通量的优点，为ndm-1抑制剂的筛选提供了新方法和新思路。

关键词：碳青霉烯酶 ndm-1 ELISA 抑制剂高通量筛选

亚胺培南对携带bla耐药基因的Escherichia coli耐药性及内膜secY、secE和sec G转录水平的影响

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中国抗生素杂志 2023年 1048-1056页

作者：吴兆猛赵琼吴玲玲王祖华余春芳金志雄湖北医药学院附属国药东风总医院检验部湖北医药学院附属太和医院输血科湖北医药学院基础医学研究所

目的探讨亚胺培南(IPM)对blandm-1阳性Escherichia coli耐药性及其内膜secY、secE和secG转录水平的影响。方法以重组质粒pET28a(+)-blandm-1转化菌株E.coli DH5α-blandm-1和E.coli BL21(DE3)-blandm-1为研究对象，在梯度浓度增加或撤消IPM暴露下传代培养菌株，检测17种抗生素对IPM暴露菌株的MIC值；SDS-PAGE凝胶电泳检测ndm-1表达；蛋白活性实验检测ndm-1活性；qRT-PCR检测blandm-1及内膜secY、secE和secG转录水平。结果12μg/mL和020μg/mL IPM暴露的E.coli DH5α-blandm-1菌株CFZ、CXM、FOX、CRO、CAZ、FEP等头孢类药物的MIC值(≥8μg/mL/≥8μg/mL、≥32μg/mL/≥32μg/mL、≥32μg/mL/≥32μg/mL、≥64μg/mL/=32μg/mL、≥32μg/mL/≥32μg/mL、≥32μg/mL/=8μg/mL)与0μg/mL IPM暴露MIC值(≤2μg/mL、=16μg/mL、≤8μg/mL、≤1μg/mL、≤4μg/mL、≤2μg/mL)相比均显著增高，而IPM和MEM的MIC值与0μg/mL IPM暴露(≤1μg/mL和≤1μg/mL)相比也显著增高(=8μg/mL/=8μg/mL和=4μg/mL/=4μg/mL)。12μg/mL和020μg/mL IPM暴露的E.coli BL21(DE3)-blandm-1菌株FOX、CRO、FEP等头孢类药物的MIC值(≥32μg/mL/≥32μg/mL、≥64μg/mL/≥64μg/mL、=16μg/mL/=16μg/mL)与0μg/mL IPM暴露(≤8μg/mL、≤1μg/mL、≤2μg/mL)相比也均显著增高，而IPM和MEM的MIC值与0μg/mL IPM暴露(≤1μg/mL和≤1μg/mL)相比也均显著增高(≥16μg/mL/≥16μg/mL和≥16μg/mL/≥16μg/mL)。SDS-PAGE显示，随12μg/mL IPM暴露时间的延长，菌株ndm-1水解IPM活性增加。qRT-PCR显示，12μg/mL IPM暴露的E.coli DH5α-blandm-1和E.coli BL21(DE3)-blandm-1的blandm-1、secY、secE和secG转录水平分别上调2.31/2.5、3.05/1.96、2.83/1.24和2.71/1.45倍。结论IPM可使blandm-1阳性E.coli由碳青霉烯类敏感变为耐药且保持稳定，细菌内膜SecYEG跨膜通道蛋白参与菌株耐药性调控，这为认识抗生素压力下肠杆菌科细菌耐药性变化及指导临床合理用药提供理论支撑。

关键词：亚胺培南暴露 Escherichia coli ndm-1 SecYEG

健康人肠道中肺炎克雷伯菌携带blandm-1耐药质粒并介导抗性转移

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中国人兽共患病学报 2023年第3期39卷 221-227页

作者：曾薇罗铭刘佳琦李哲吴炎农卢昕阚飙山东大学公共卫生学院济南250012 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206 广西玉林市疾病预防控制中心玉林537000 北京工商大学轻工科学技术学院北京100048

目的通过探究健康人群肠道中携带的blandm-1基因的肺炎克雷伯菌的基因组特征,明确健康人肠道定植菌及病原菌的耐药基因组,建立以耐药质粒基因组完成图为基础的耐药质粒监管体系。方法对健康人群肠道耐药菌监测中携带blandm-1基因的肺炎... 详细信息

目的通过探究健康人群肠道中携带的blandm-1基因的肺炎克雷伯菌的基因组特征,明确健康人肠道定植菌及病原菌的耐药基因组,建立以耐药质粒基因组完成图为基础的耐药质粒监管体系。方法对健康人群肠道耐药菌监测中携带blandm-1基因的肺炎克雷伯菌开展抗菌药物敏感性实验,同时进行二代和三代测序以获得菌株及质粒全基因组完成图,利用核心基因组及泛基因组方法对该株菌进行序列比对分析,并进行接合转移实验确定质粒转移效率及最优转移条件。结果基于完成图的序列分析,发现本研究中所获得的肺炎克雷伯菌与来自公共数据库中的临床感染患者的菌株属于同一流行克隆,提示该克隆既可以引起人体感染,也可定植在健康人肠道内。明确blandm-1基因所在质粒为IncX3型,是易于携带blandm-1基因的流行质粒,泛基因组分析发现该类质粒可以突破宿主菌的种属屏障进行跨宿主传播;接合转移实验显示该质粒可转移、介导高水平的碳青霉烯类抗生素耐药性的传递。结论携带blandm-1基因的肺炎克雷伯菌可以在健康人肠道中定植,并通过耐药质粒实现耐药基因的跨宿主及宿主菌传播。因此有必要加强对健康人肠道定植菌群以及病原菌的耐药基因组监测、并建立以耐药质粒基因组完成图为基础的耐药质粒监管体系,能够从耐药基因转移因子的特征上进一步揭示耐药性传播的风险和人群扩散途径。

关键词：碳青霉烯酶 ndm-1 肺炎克雷伯菌质粒细菌耐药

ndm-1天然产物抑制剂的筛选与体外抗菌活性评价

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NDM-1天然产物抑制剂的筛选与体外抗菌活性评价

作者：刘海宾东北农业大学

学位级别：硕士

细菌感染是一类肆虐全球的疾病,曾经给人类和畜牧养殖业带来了巨大的危害。抗生素作为对抗细菌感染的武器,其发现与应用既延长了人类的寿命,也显著提高了养殖业的经济效益。大肠杆菌既是畜禽肠道的共栖菌,也是重要的条件性致病菌,致病... 详细信息

细菌感染是一类肆虐全球的疾病,曾经给人类和畜牧养殖业带来了巨大的危害。抗生素作为对抗细菌感染的武器,其发现与应用既延长了人类的寿命,也显著提高了养殖业的经济效益。大肠杆菌既是畜禽肠道的共栖菌,也是重要的条件性致病菌,致病性大肠杆菌感染引起的仔猪黄、白痢、奶牛乳腺炎、禽的慢性呼吸道病等疾病的发病率较高,而抗菌药物是控制畜禽大肠杆菌病的主要措施之一,其中β-内酰胺类抗生素是治疗畜禽大肠杆菌病常用一线药物。但由于β-内酰胺类抗生素的不合理使用,大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性越来越严重,甚至出现了多重耐药大肠杆菌。产β-内酰胺酶是大肠杆菌对β-内酰胺类药物耐药的主要机制,其中影响最广泛最严重的是以新德里金属β-内酰胺酶-1(ndm-1)为代表的金属β-内酰胺酶(MBLs),其可以水解包括新型头孢菌素和碳青霉烯类在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素,产ndm-1酶多重耐药菌的出现使得临床治疗几乎面临无药可用的局面。研究开发有效的ndm-1抑制剂与β-内酰胺类抗生素联用被认为是治疗ndm-1耐药菌感染的有效途径之一,目前临床缺乏有效的ndm-1抑制剂。因此,本研究以期从天然产物中筛选出一种有效的ndm-1抑制剂,可以协同β-内酰胺类抗生素治疗ndm-1阳性大肠杆菌所引起的感染。本研究以PDB蛋白数据库中以大肠杆菌为表达系统的ndm-1蛋白(PDB:4EY2)为初始的为受体蛋白,以天然产物库的化合物为配体,应用计算机辅助设计的分子对接技术,采用Discovery Studio(DS)软件虚拟筛选与ndm-1受体匹配的天然产物配体,受体和配体对接方式采用半柔性对接,将打分函数“-CDOCKER Energey”值从高到低进行排序,根据打分函数和类药性五规则选择6种天然产物作为候选抑制剂,分析其与ndm-1结合模式的共性,发现候选抑制剂是通过氢键、范德华力等多种化学作用力与ndm-1的活性位点结合。同时本研究以临床分离鉴定的ndm-1阳性大肠杆菌的bla为DNA模板,在扩增、纯化及鉴定bla的基础上构建bla的重组克隆质粒p GEM-T-bla和重组表达质粒p ET-28a-bla,经PCR鉴定和双酶切鉴定表明两种重组质粒构建成功;对重组质粒p ET-28a-bla插入片段进行测序,插入片段与NCBI基因库bla的同源性为100%,表明目的基因插入正确。采用大肠杆菌表达系统表达了ndm-1,优化了pET-28a-bla重组表达质粒的表达条件,最终获得了浓度和纯度较高的ndm-1蛋白。建立了以美罗培南(MEM)为底物的ndm-1酶抑制剂筛选体系,并评价了该体系的可行性,该体系的Z’因子达到了0.7,表明建立的筛选体系符合要求。采用ndm-1酶抑制剂筛选体系从6种天然产物候选抑制剂中进一步筛选有效的ndm-1抑制剂,并研究了其体外抗菌活性。通过测定6种ndm-1候选天然产物抑制剂的酶抑制活性,获得两种活性较好的天然产物抑制剂二水槲皮素及异水飞蓟宾,二者对ndm-1的酶抑制率分别为90.7%和86.4%,IC值分别为28±4μM和32±5μM,表明这二种天然产物可以较好的抑制ndm-1酶的水解活性。采用微量肉汤稀释法分别测定二水槲皮素、异水飞蓟宾、MEM对ndm-1阳性大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC),两种天然产物的MIC均大于512μg/m L、MEM的MI C为64μg/m L,表明二种天然产物抑制剂对ndm-1阳性大肠杆菌抗菌活性很弱,ndm-1阳性大肠杆菌对MEM也表现为耐药;采用棋盘稀释法测得两种天然产物抑制剂与MEM联用对ndm-1阳性大肠杆菌的部分浓度抑菌指数(FIC)均为0.375,均ndm-1阳性大肠杆菌的MIC值降低2-8倍,表明MEM与二水槲皮素或异水飞蓟宾联用具有较好的协同抗菌作用;通过细菌生长曲线和时间-杀菌曲线试验发现两种天然产物抑制剂对ndm-1阳性大肠杆菌的生长没有明显的影响,但是二者分别与MEM联用后可显著增强MEM对ndm-1阳性大肠杆菌的抗菌活性。综上所述,本研究通过表达纯化体外获得了表达量高活性较好的ndm-1酶,并以ndm-1为靶标,利用分子对接的手段、酶活性和体外抗菌活性评价,得到了两种新型ndm-1潜在天然产物抑制剂二水槲皮素与异水飞蓟宾,与MEM联用对ndm-1阳性大肠杆菌具有显著的体外协同抗菌活性。综合评价发现二水槲皮素与异水飞蓟宾是ndm-1的有效抑制剂,具有潜在的研发价值,研究结果为后续ndm-1有效抑制剂的研发以及发现ndm-1阳性大肠杆菌感染的防治策略提供了理论及实践基础。

关键词： ndm-1 抑制剂分子对接天然产物大肠杆菌

新德里金属β-内酰胺酶（ndm-1）与青霉素类抗生素及抗菌肽thanatin的作用方式研究

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新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）与青霉素类抗生素及抗菌肽thanat...

作者：史祥睿沈阳化工大学

学位级别：硕士

超级细菌给人类健康带来了严重威胁,其中含新德里金属β-内酰胺酶(ndm-1)的超级细菌在全球传播的同时更是突破了人类健康的最后防线——碳青霉烯类抗生素,这主要是因为ndm-1可以水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素。设计合成有效的ndm-1... 详细信息

超级细菌给人类健康带来了严重威胁,其中含新德里金属β-内酰胺酶(ndm-1)的超级细菌在全球传播的同时更是突破了人类健康的最后防线——碳青霉烯类抗生素,这主要是因为ndm-1可以水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素。设计合成有效的ndm-1临床可用抑制剂迫在眉睫,而抑制剂的设计离不开对ndm-1水解底物机理与相互作用方式的认识。ndm-1对β-内酰胺类抗生素的水解作用位点为抗生素母核部分的β-内酰胺环,但其水解不同抗生素的反应途径与动力学过程并不一样。这些差异很可能与抗生素的侧链取代基团有关,不同的基团可导致抗生素与ndm-1活性中心周围氨基酸残基的作用方式不同,进而影响反应进程。因此,对含不同侧链取代基抗生素与ndm-1作用方式的对比研究可为抑制剂的设计提供思路。2019年,有报道称抗菌肽thanatin在体外与小鼠体内对ndm-1有很好的抑制效果,并对其抑制机理提出了猜测,但未得到证实。Thanatin全长共21个氨基酸,具有广谱的抑制细菌与真菌的效果,对其与ndm-1相互作用方式的研究或许会为我们理解相关抑制机制提供帮助,并为设计针对ndm-1的多肽类抑制剂提供思路。本文使用X-射线晶体学方法,分别解析了ndm-1与青霉素G(benzylpenicillin)、氨苄青霉素(ampicillin)、青霉素V(phenoxymethylpenicillin)三种青霉素类抗生素的复合物晶体结构,并通过分子动力学模拟深入探究了ndm-1与三种抗生素的作用方式的差异。由此得出结论:青霉素类抗生素上不同的侧链R基不会影响底物的水解过程,但很可能影响水解产物从酶活中心的脱离。我们发现,三种抗生素的R基端部的苯基越灵活,其与ndm-1 L3 loop上的Phe70作用越明显,越不利于产物的脱离,这一现象有可能成为抑制剂设计的一个方向。本文还探究了ndm-1与thanatin的复合物结晶条件,以期在结构层面解释thanatin的抑制机理,但未取得理想结果。随后我们通过分子对接与分子动力学模拟方法探究了两者的可能作用方式,并对其抑制机理提出猜测。我们认为thanatin对ndm-1的抑制作用在于竞争性抑制了ndm-1与抗生素的结合,而非驱动锌离子离开活性中心。

关键词： ndm-1 水解 β-内酰胺 thanatin 抑制剂