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中国兽医学报 2022年第9期42卷 1764-1768,1785页

作者：刘飞王仁铃孙诗惠王蓬琨宋德光关继羽陆慧君吉林大学动物医学学院/人兽共患病研究所吉林长春130062

核受体共抑制因子1(ncor1)组织分布广泛,可调节基因转录。前期研究表明,与ncor1功能密切相关的转导蛋白(β)样1X连接受体1(TBL1XR1)在水疱性口炎病毒(VSV)复制进程中发挥促进功能。为明确ncor1因子在VSV复制增殖过程中的作用及机制,首... 详细信息

核受体共抑制因子1(ncor1)组织分布广泛,可调节基因转录。前期研究表明,与ncor1功能密切相关的转导蛋白(β)样1X连接受体1(TBL1XR1)在水疱性口炎病毒(VSV)复制进程中发挥促进功能。为明确ncor1因子在VSV复制增殖过程中的作用及机制,首先设计并构建靶向ncor1的shRNA过表达质粒shncor1。将shncor1质粒与骨架质粒共转染293T细胞,获得表达shncor1的慢病毒颗粒。用慢病毒感染小鼠巨噬细胞(RAW264.7)并构建ncor1基因沉默细胞系。VSV分别感染ncor1沉默与对照细胞系后,通过Q-PCR和TCID检测VSV的转录、复制水平。结果表明,ncor1基因沉默能抑制VSV的转录及复制。此外,当ncor1基因沉默时,经VSV诱导的干扰素相关基因Ifit1及Ifit2的转录水平显著升高,提示ncor1对病毒复制的调控与干扰素信号的激活相关。本研究从宿主细胞出发为阐明VSV的致病机制提供了新的思路。

关键词： ncor1 水疱性口炎病毒病毒复制 RNA干扰

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肝细胞ncor1通过抑制CCL2介导的单核巨噬细胞浸润改善酒精性肝损伤

肝细胞NCoR1通过抑制CCL2介导的单核巨噬细胞浸润改善酒精性肝损伤

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作者：殷凡安徽医科大学

学位级别：硕士

背景和目的酒精相关性肝病(Alcohol-associated liver disease,ALD)正逐渐发展为导致临床上肝脏相关疾病发病率、死亡率升高以及成为肝移植指征的重要原因之一。长期过量的酒精摄入会引起肝脏脂肪变性、炎症、氧化应激等,造成肝细胞损伤... 详细信息

背景和目的酒精相关性肝病(Alcohol-associated liver disease,ALD)正逐渐发展为导致临床上肝脏相关疾病发病率、死亡率升高以及成为肝移植指征的重要原因之一。长期过量的酒精摄入会引起肝脏脂肪变性、炎症、氧化应激等,造成肝细胞损伤,更有甚者会发展为肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌。然而,目前尚没有针对ALD的有效治疗方案,因此,了解ALD的发病过程的潜在机制非常重要。核受体辅助抑制因子1(Nuclear receptor corepressor 1,ncor1)是表观遗传调控基因转录的辅助抑制因子,在调节脂质代谢和炎症中具有重要作用。然而,人们对ncor1在ALD中的功能尚不清楚。本研究旨在探讨ncor1在ALD发病过程中的作用和机制。方法1.本研究使用雄性野生型C57BL6/J小鼠构建Gao-binge模型(chronic-plus-binge ethanol feeding model),实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)、蛋白质印迹(western blot,WB)检测肝脏组织中ncor1的表达水平变化。2.本研究使用白蛋白-Cre/Lox P系统构建肝细胞特异性ncor1敲除(ncor1)的小鼠,采用琼脂糖凝胶电泳、q PCR验证敲除效率。3.对ncor1小鼠和同窝对照野生型小鼠(Alb-cre阴性,ncor1)构建Gao-binge模型和传统的Lieber-De Carli慢性酒精喂养模型。4.通过全自动的生化分析检测仪检测血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、甘油三酯(triglyceride,TG),总胆固醇(total cholesterol,T-CHO)等的水平。5.采用苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色来观察比较肝组织病理损伤。6.采用油红O染色观察肝脏组织脂质沉积,并采用试剂盒检测肝脏组织TG、T-CHO水平7.采用MPO和F4/80免疫组织化学(Immunohistochemical,IHC)染色来观察肝脏组织中中性粒细胞的浸润以及巨噬细胞的浸润情况。8.采用4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)的IHC染色检测肝脏组织氧化应激水平。9.采用肝脏原位灌流和流式细胞术分析肝脏巨噬细胞具体分型。10.采用q PCR、ELISA检测肝脏中炎症因子和趋化因子的m RNA水平和蛋白水平。11.体外用酒精刺激分别用ncor1 si RNA和对照si RNA转染的AML12小鼠肝细胞系,ELISA检测细胞上清趋化因子蛋白水平。结果与对照喂养小鼠相比,ALD小鼠肝脏组织中ncor1表达显著上调。研究发现,与ncor1小鼠相比,酒精喂养的ncor1小鼠的肝损伤更严重,但脂肪变性更轻微。我们进一步证明,肝细胞特异性敲除ncor1通过上调C-C基序趋化因子配体2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)招募单核细胞来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages,Mo MFs)但是并不影响中性粒细胞浸润到肝脏,加剧了酒精喂养诱导的肝脏组织炎症和氧化应激。此外,体外实验显示在小鼠肝细胞系AML12中,ncor1敲低显著增加了酒精刺激诱导的CCL2释放。结论与启示这些结果表明,在ALD中,肝细胞ncor1在控制肝脏炎症和脂肪变性方面发挥着不同的作用,一方面,肝细胞ncor1可以促进酒精性脂肪变性;另外一方面肝细胞ncor1通过抑制CCL2的产生,进而减少Mo MFs浸润,减轻酒精诱导的肝脏组织炎症和肝细胞损伤。这为开发慢性饮酒诱导的肝炎的治疗方法提供了新的见解和启示。

关键词： ALD ncor1 肝细胞 CCL2 MoMFs

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基于全外显子组测序技术筛选痛风相关基因的研究

基于全外显子组测序技术筛选痛风相关基因的研究

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作者：李凯昆明理工大学

学位级别：硕士

痛风是患有高尿酸血症后关节内尿酸结晶沉积而引起的一种常见的关节炎。在强大的基因参与调控的疾病中,痛风是一种发病率最高的炎症性关节疾病。格外值得注意的是,痛风在中国人群中已经成为第二大代谢性疾病。对痛风(Gout)病例组和健康... 详细信息

痛风是患有高尿酸血症后关节内尿酸结晶沉积而引起的一种常见的关节炎。在强大的基因参与调控的疾病中,痛风是一种发病率最高的炎症性关节疾病。格外值得注意的是,痛风在中国人群中已经成为第二大代谢性疾病。对痛风(Gout)病例组和健康对照组进行全外显子高通量测序(Whole Exome Sequencing,WES),在全外显子范围内探寻痛风疾病新的易感基因位点。本研究共纳入33名中国成年人,病例组包含了 11名被昆明医科大学第一附属医院风湿免疫科专家临床诊断为痛风的成人患者;健康对照组由来自体检中心的22名健康成年人组成。分别从患者和健康人的全血中提取基因组DNA。利用Agilent SureSelect Human All Exon Kit对研究对象进行了全基因组外显子捕获,然后用HiSeq 3000高通量测序仪进行全外显子组测序。对比分析各种测序数据分析软件的优缺点后,详细地论述SeqMule软件的特点及操作,利用SeqMule对研究对象的外显子测序数据进行自动化比对与SNP分析。对所有的变异体进行功能注释,筛选出可能对基因功能有显著影响的非同义突变(Nonsysnonymous,NS)。使用R软件对得到的基因数据进行生物信息学分析和统计学分析:过滤掉同义突变等不影响基因功能的突变,只保留影响基因功能的非同义突变;过滤掉公共遗传突变数据库(dbSNP)正常人携带的常见突变、已发表的正常对照个体的突变、以及该项目实验测序的正常对照个体的突变;然后在所有患病个体的突变集合中取交集;利用Fisher精确检验筛选具有统计学意义(P138等公共数据库的筛查,发现两个可能与痛风疾病发展显著相关的SNPs(单核苷酸多态性)的遗传变异,分别是KLRC2和ncor1基因在外显子区域的 rs3419537(c.56C>G,P = 0.00417)和 rs73281920(c.59T>G,P =0.00000143)位点。这两个位点都被蛋白质功能预测软件SIFT和PolyPhen-2预测为“有害”。KLRC2(c.56C>G)位于定位区域12p13.2上,6名患者中检测到突变,健康对照组均未突变。ncor1(c.59T>G)位于定位区域17p12-p11.2上,9名患者中检测到突变,健康对照组均未突变。利用全外显子组测序技术,使用自编R程序,经过生物信息学分析和统计学分析后,从11名痛风患者中筛选出2个可能致病突变基因位点,为痛风的诊断提供了更加快速、准确的方法。与多个分析软件的对比,发现了一站式全基因组和外显子组测序数据自动分析软件(SeqMule)能够优化许多分析软件存在的一些缺点,能够对外显子组和全基因组测序数据完成全面、灵活、高效地自动化分析,可以更好地分析高通量测序数据,最终提升数据分析的一致性和准确性。

关键词：痛风全外显子组测序生物信息学 KLRC2 ncor1

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FOXF2转录功能的乳腺癌亚型特异性调节机制

FOXF2转录功能的乳腺癌亚型特异性调节机制

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作者：于子涵天津医科大学

学位级别：硕士

背景叉头框蛋白F2(forkhead box F2,FOXF2)作为转录因子,在发育和分化的进程中起重要的调控作用。FOXF2在基底样乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)细胞中特异性高表达,通过转录抑制方式抑制BLBC细胞的上皮间质转化(epithelial-mese... 详细信息

背景叉头框蛋白F2(forkhead box F2,FOXF2)作为转录因子,在发育和分化的进程中起重要的调控作用。FOXF2在基底样乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)细胞中特异性高表达,通过转录抑制方式抑制BLBC细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和转移;而在Luminal亚型乳腺癌细胞中,FOXF2通过转录激活下游靶基因促进EMT和转移;但是,FOXF2在BLBC和Luminal亚型乳腺癌中均促进细胞增殖。鉴于FOXF2在乳腺癌中表现为亚型特异性的转录调控作用,而转录因子的转录调控功能多依赖于对不同辅转录调控因子的招募以及复杂的转录复合物的形成,辅转录调控因子对转录因子的转录调控功能起着分子开关的决定性作用。转录抑制作用依赖于辅转录抑制复合物的形成,ncor1常作为转录抑制复合物中的核心组分与转录因子相互作用,进一步招募HDAC3和HDAC1对靶基因启动子区组蛋白进行去乙酰化修饰以抑制或沉默基因表达。转录激活作用依赖于辅转录激活复合物的形成,SRC家族蛋白常作为基础的辅转录激活因子,与转录因子相互作用后进一步招募其他具有修饰酶活性的二级辅转录因子如CBP/p300以激活靶基因的表达。因此,我们推测在不同亚型的乳腺癌细胞中FOXF2招募不同的辅转录调控因子以形成不同的转录激活复合物和转录抑制复合物,进而转录激活或转录抑制不同的靶基因,而对于不同辅转录调控因子的招募介导了FOXF2在乳腺癌中亚型特异性的转录调控机制。目的本研究旨在阐明FOXF2在不同亚型乳腺癌中转录调节功能的抑制或激活机制,为揭示转录因子调控乳腺癌发生发展进程的多效性和复杂性提供理论依据。方法1.在BLBC细胞MDA-MB-231和Luminal亚型乳腺癌细胞MCF-7中分别过表达FOXF2或直接采用MDA-MB-231细胞,通过裂解细胞制备细胞总蛋白,采用免疫共沉淀(co-immunoprecitation,co-IP)方法检测在MDA-MB-231和MCF-7中FOXF2与ncor1、HDAC3和HDAC1是否存在相互作用;MDA-MB-231中FOXF2与NCOA1是否存在相互作用;在MCF-7中FOXF2与p300是否存在相互作用。2.采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecitation,Ch IP)和二重染色质免疫共沉淀(Re-Ch IP)检测在BLBC细胞MDA-MB-231中FOXF2是否招募ncor1和HDAC3形成转录抑制复合物,共同结合于下游靶基因的启动子区;检测FOXF2是否招募p300形成转录激活复合物,共同结合下游靶基因启动子区。另外,采用TNFα激活MCF-7中的NF-κB信号通路,检测NCOA1对FOXF2启动子区的结合;采用ChIP-qPCR检测沉默或过表达FOXF2的MDA-MB-231中ncor1和HDAC3对FOXF2下游靶基因启动子区的结合能力的改变,以及下游靶基因启动子区组蛋白修饰状态的变化。3.在BLBC细胞MDA-MB-231和BT549中分别沉默ncor1表达、过表达FOXF2、过表达FOXF2同时沉默ncor1,采用双荧光素酶报告系统检测FOXF2下游靶基因启动子区的转录活性,以确定ncor1对FOXF2转录抑制下游靶基因启动子区转录活性的介导作用;采用RT-qPCR和Western blot方法检测FOXF2下游靶基因的mRNA和蛋白表达,以确定ncor1对FOXF2转录抑制下游靶基因表达的介导作用。结果***-IP实验证实,在BLBC细胞MDA-MB-231中FOXF2与ncor1和HDAC3相互结合形成转录抑制复合物,但与FOXF2与HDAC1无结合;FOXF2与NCOA1无结合,不能形成转录激活复合物。在Luminal亚型乳腺癌细胞MCF-7中,FOXF2与ncor1、HDAC3、HDAC1均不存在直接相互结合,不能形成转录抑制复合物;但FOXF2与p300结合,可形成转录激活复合物。***和Re-ChIP实验证实,在BLBC细胞MDA-MB-231中FOXF2招募ncor1和HDAC3形成转录抑制复合物,共同结合于下游靶基因的启动子区;在Luminal亚型乳腺癌细胞MCF-7中激活NF-κB信号通路后,NCOA1可结合于FOXF2启动子区。Ch IP-qPCR实验证实,在沉默FOXF2表达的MDA-MB-231中ncor1和HDAC3对FOXF2下游靶基因启动子区的结合能力减弱,从而FOXF2下游靶基因启动子区染色质的组蛋白乙酰化修饰增加;在过表达FOXF2的MDA-MB-231中ncor1和HDAC3对FOXF2下游靶基因的启动子区结合能力增强,从而FOXF2下游靶基因启动

关键词：基底样乳腺癌 FOXF2 ncor1 HDAC3 FOXQ1

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