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nanog基因在侧群表型干细胞样肝癌细胞中的表达及意义

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中山大学学报（医学科学版） 2014年第1期35卷 12-17页

作者：周嘉嘉陈汝福邓小耿周雨周泉波张杰伍耀豪曾乐祥邱荣林中山大学孙逸仙纪念医院外科广东广州510120

【目的】基于侧群(SP)细胞分选方法,从肝癌细胞Huh7和Hep3B中分选SP表型干细胞样肝癌细胞,观察干细胞标记物nanog基因在该SP表型肝癌细胞中的表达。【方法】采用流式细胞术检测和分选肝癌细胞Huh7和Hep3B中的SP细胞和非侧群(NSP)细胞,... 详细信息

【目的】基于侧群(SP)细胞分选方法,从肝癌细胞Huh7和Hep3B中分选SP表型干细胞样肝癌细胞,观察干细胞标记物nanog基因在该SP表型肝癌细胞中的表达。【方法】采用流式细胞术检测和分选肝癌细胞Huh7和Hep3B中的SP细胞和非侧群(NSP)细胞,细胞生长曲线法检测SP和NSP细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测SP和NSP细胞的侵袭能力,MTT法检测SP和NSP细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素(DOX)的药物敏感性;Real-time PCR和WB检测SP与NSP细胞中nanog基因的表达。【结果】肝癌细胞Huh7和Hep3B中分选的SP细胞比例分别为(5.3±0.8)%和(13.49±1.0)%。生长曲线表明Huh7和Hep3B的SP细胞的增殖速度快于NSP细胞(Pnanog mRNA平均表达水平分别是NSP细胞的4.17和5.51倍(Pnanog蛋白平均表达水平分别是NSP细胞的3.78和5.01倍(Pnanog基因在SP表型干细胞样肝癌细胞中高表达。

关键词：肝癌侧群细胞肿瘤干细胞 nanog基因

nanog基因在Hela细胞中的表达及其siRNA对小鼠ES细胞生长和分化的影响

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Nanog基因在Hela细胞中的表达及其siRNA对小鼠ES细胞生长和分化的...

作者：窦琳西北农林科技大学

学位级别：硕士

胚胎干细胞来自哺乳动物囊胚内细胞团,具有自我更新﹑无限增殖的能力,并具有分化成各种类型细胞的特性。胚胎干细胞多能性分子机制的研究是近年来的一个研究热点。nanog基因作为维持ES细胞和早期胚胎细胞多能性的重要因子,研究nanog基因... 详细信息

胚胎干细胞来自哺乳动物囊胚内细胞团,具有自我更新﹑无限增殖的能力,并具有分化成各种类型细胞的特性。胚胎干细胞多能性分子机制的研究是近年来的一个研究热点。nanog基因作为维持ES细胞和早期胚胎细胞多能性的重要因子,研究nanog基因在ES细胞和早期胚胎细胞中的表达机制以及与LIF/STAT3和Oct3/4之间对干细胞多能性的关系,将有助于理解ES细胞多能性维持的分子机制。同源异型蛋白nanog能够独立于LIF/STAT3途径而维持胚胎干细胞的自我更新能力。nanog, Oct4和Sox2是维持胚胎干细胞和内细胞团多能性的主要调控因子。nanog基因只在胚胎干细胞或畸胎瘤细胞中表达,在成体细胞中不表达。在小鼠胚胎干细胞中,运用RNA干扰的方法抑制nanog基因的表达会导致胚胎干细胞向胚外内胚层分化,同时促使胚外内胚层基因gata4, gata6和lamininB1的表达。对nanog基因的研究有助于揭示胚胎干细胞全能性和自我更新能力的重要途径和调控通路,对诱导胚胎干细胞定向分化具有重要意义。本试验克隆了小鼠nanog基因,构建了nanog基因的真核表达载体,在Hela细胞中成功表达了nanog基因,并检测了nanog基因对Hela细胞生长特性的影响。根据nanog基因序列设计了三对针对nanog基因的siRNA干扰片段和一对无意义siRNA片段作为阴性对照。将干扰片段转染小鼠ES细胞和P19细胞,观察干扰nanog基因表达后其对干细胞生长和分化的影响。本试验具体内容如下所述: 1.根据GeneBank中登录的序列设计引物,克隆小鼠nanog基因全长915bp,对克隆片段进行测序分析,结果与GeneBank中发表的小鼠ES细胞nanog基因序列(XM32755,gi:20831594)同源性为99.7%。将扩增的基因片段插入到pEGFP-C1载体上,构建了nanog基因真核表达载体pG-nanog。向Hela细胞中转染重组载体,RT-PCR证明在Hela细胞中成功表达nanog基因。利用G418筛选稳定转染株细胞,通过测定细胞生长曲线,PCNA染色,细胞生长周期检测等试验,证明nanog基因能够促进Hela细胞的增殖,促使Hela细胞进入S期。 2.根据nanog基因序列设计合成了三对siRNA干扰片段N301、N749、N845,和一对无意义siRNA片段作为对照。利用Lipofectamine 2000将这些siRNA转染ES-129细胞(来自129小鼠),转染后培养24h,收集细胞用TriZol提取细胞总RNA,经半定量RT-PCR分析,筛选得到干扰效果最好的一对siRNA N301。用N301 siRNA转染ES-129细胞,培养至24h、48h,ES细胞集落开始松散,但仍有少数细胞维持多能性,AP染色呈弱阳性。用N301转染P19细胞,培养24h至48h,其诱导形成类胚体能力下降,所形成的类胚体活力低,贴壁能力差。

关键词：胚胎干细胞 nanog基因表达载体 RNA干扰小干扰RNA片段

长链非编码RNA-H19特异性吸附微RNA-760调控nanog基因表达促进非小细胞肺癌细胞增殖和迁移

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第二军医大学学报 2019年第8期40卷 854-859页

作者：李莎朱怡卿石荟戈霞晖许靖商艳王芳白冲海军军医大学(第二军医大学)长海医院呼吸与危重症医学科上海200433 海军军医大学(第二军医大学)基础医学院医学遗传学教研室上海200433 上海中医药大学附属第七人民医院呼吸科上海200137

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)-H19对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移的影响及分子机制。方法收集2015年10月至2016年5月海军军医大学(第二军医大学)长海医院确诊的20例NSCLC患者手术切除的NSCLC组织及相应的癌旁正常组织。通过实... 详细信息

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)-H19对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移的影响及分子机制。方法收集2015年10月至2016年5月海军军医大学(第二军医大学)长海医院确诊的20例NSCLC患者手术切除的NSCLC组织及相应的癌旁正常组织。通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测NSCLC组织及癌旁正常组织,人NSCLC细胞系A549、NCI-H1299和人正常肺上皮细胞系BEAS-2B中lncRNA-H19的表达。在A549细胞中过表达lncRNA-H19后,采用CCK-8法和Transwell实验分别检测细胞的增殖和迁移能力。利用生物信息学分析预测lncRNA-H19与微RNA(miRNA)-760的结合位点,通过双荧光素酶报告基因实验分析lncRNA-H19对miRNA-760的吸附作用,采用qPCR和蛋白质印迹法分别检测lncRNA-H19过表达对miRNA-760及下游靶基因nanog表达的影响。通过对A549细胞转染miRNA-760模拟剂过表达miRNA-760后,检测过表达miRNA-760对lncRNA-H19促进NSCLC细胞增殖和迁移作用的影响。结果LncRNA-H19在NSCLC组织和A549、NCI-H1299细胞中均呈高表达,分别与其在癌旁正常组织和BEAS-2B细胞中的表达水平相比差异均有统计学意义(P均基因检测结果显示lncRNA-H19与miRNA-760之间存在特异性结合。与对照组相比,过表达lncRNA-H19可抑制A549细胞中miRNA-760的表达(P均基因nanog在mRNA和蛋白水平的表达(P均nanog基因表达,从而促进NSCLC细胞增殖和迁移。

关键词：非小细胞肺癌长链非编码RNA-H19 微RNA-760 nanog基因

nanog基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备

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Nanog基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备

作者：李军西北农林科技大学

学位级别：硕士

胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ES细胞）起源于早期胚胎细胞,培养扩增时,可维持未分化状态并具有自我更新能力的原始细胞。理解ES细胞多能性和自我更新的转录调控系统是理解人类发育过程及实现这些细胞治疗潜能的基础。其中同源域... 详细信息

胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ES细胞）起源于早期胚胎细胞,培养扩增时,可维持未分化状态并具有自我更新能力的原始细胞。理解ES细胞多能性和自我更新的转录调控系统是理解人类发育过程及实现这些细胞治疗潜能的基础。其中同源域转录因子在进化上保守且在很多生物的细胞分化中起关键性作用。nanog是2003年才发现的一个同源域转录因子,它的表达在维持ES细胞上的多能性及自我更新中有重要作用。目前,国内外关于nanog原核表达及抗体制备的研究报道几乎没有。本实验室研究人员已经通过RT-PCR技术从小鼠ES-D3中克隆获得了完整的nanog开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）。本课题是通过PCR亚克隆小鼠nanog基因,构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）表达nanog融合蛋白并纯化,为该基因体外功能的进一步验证提供依据。同时将获得的融合蛋白作抗原制备多克隆抗体,为目的基因产物在ES细胞内的定位以及其作用机理研究奠定基础。研究工作取得以下进展: 1.根据小鼠nanog基因的序列和原核表达载体pET-32a的酶切位点,设计两条分别带有BanH I和HindⅢ酶切位点的引物,以带有小鼠nanog基因的质粒pNA992为模板,利用PCR方法扩增获得一个长度与nanog基因完整片段相当的特异性片段。 2.采用限制性内切酶BamH I和HindⅢ双酶切含酶切位点的目的片段,回收并纯化目的片段nanog,把该片段连接到经BamH I和HindⅢ限制性内切酶酶切的表达载体pET-32a上,转化E.coli菌株TGⅠ,氨苄青霉素筛选抗性菌落,经菌落PCR、双酶切及测序进一步鉴定获得转化子pET-32a-nanog。 3.将重组表达载体pET-32a-nanog转化到高效表达菌株BL21（DE3）,诱导培养后,重组菌特异性表达了大小为57 kDa的融合蛋白,而空载体表达的特异性的蛋白大小为20 KDa,表明nanog蛋白的大小为37 KDa,与前人报道一致。通过不同诱导时间及不同诱导剂浓度的对照实验,确定了最佳诱导条件是37℃,0.01 mM IPTG诱导表达3h。 4.对融合蛋白的表达形式分析后显示,nanog融合蛋白以包涵体形式表达。对包涵体洗涤、变性溶解后,采用His Trap HP亲和层析柱纯化nanog基因所表达的带有6个His-Tag的蛋白并透析复性后浓缩,SDS-PAGE电泳检测纯化的蛋白样品。结果显示其蛋白的纯度达到97%。 5.用纯化的nanog融合蛋白免疫健康的雄性家兔,制备多克隆抗体。间接ELASA法测定多克隆抗体的效价为1: 64000以上。血清1:10000稀释后,Western blot检测表明获得的抗体特异性好,可以特异性的识别重组nanog蛋白。 6.用自制抗体与标准抗体分别对ES细胞进行免疫细胞化学染色,结果显示,自制抗体与标准抗体一样能特异性识别ES细胞中的nanog蛋白,且其最佳稀释浓度为1:2000,而标准抗体为1:500。表明自制抗体可以特异性识别天然的nanog蛋白且效价较高。

关键词：小鼠 nanog基因原核表达蛋白纯化抗体制备

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胚胎干细胞与nanog基因

中国组织工程研究与临床康复 2007年第11期11卷 2136-2139页

作者：郭宏兴张吉翔刘亮明江西省分子医学重点实验室南昌大学第二附属医院消化内科江西省南昌市330006

目的:胚胎干细胞可塑性强,但只能从胚胎中提取,来源受限使研究阻力加大。nanog基因的发现为胚胎干细胞的来源提供了一条崭新的途径,文章综述胚胎干细胞与nanog基因的关系及研究进展。资料来源:应用计算机检索PUBMED2002-01/2006-11期间... 详细信息

目的:胚胎干细胞可塑性强,但只能从胚胎中提取,来源受限使研究阻力加大。nanog基因的发现为胚胎干细胞的来源提供了一条崭新的途径,文章综述胚胎干细胞与nanog基因的关系及研究进展。资料来源:应用计算机检索PUBMED2002-01/2006-11期间的相关文章,检索词为"embryonic stem cells,nanog gene",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库2002-01/2006-11期间的相关文章,检索词为"胚胎干细胞,nanog基因",并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与胚胎干细胞和nanog基因研究相关。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到162篇相关文献,35篇文献符合纳入标准,排除的127篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的35篇文献中,分别涉及胚胎干细胞的转录调节、nanog基因与胚胎干细胞、nanog基因与p53、nanog基因与人类等方面的内容。选择其中的30篇作为支持文献。资料综合:胚胎干细胞来源于着床前胚胎的一类未分化的全能性(多能性)干细胞,在一定条件下可以分化为所有功能细胞。一个独特的转录因子网络可能赋予其自我更新,同时抑制分化。通过细胞融合技术,胚胎干细胞能够使一个已分化的细胞重新编排信息而进入具有多潜能的胚胎阶段。调节这一改变的基因应该就在胚胎干细胞中,而nanog基因可能就是这一候选基因,它具有使未分化的胚胎干细胞产生增殖的能力。nanog mRNA出现在人和老鼠的多功能干细胞中,但在成人干细胞中却没有。结论:nanog基因是胚胎干细胞中的多潜能维持因子。通过细胞融合技术,胚胎干细胞能够使一个已分化的细胞重新编排信息而进入具有多潜能的胚胎阶段。

关键词：干细胞胚胎学 nanog基因综述文献

5-Azadc和TSA对鸡nanog基因启动活性及ESC多能性维持的影响

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畜牧兽医学报 2015年第12期46卷 2176-2184页

作者：张亚妮王颖洁左其生李东张蕾汤贝贝连超毕瑜林张文慧李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室扬州225009

旨在克隆如皋黄鸡nanog基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区;探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-Aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对nanog基因启动活... 详细信息

旨在克隆如皋黄鸡nanog基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区;探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-Aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对nanog基因启动活性及其ESC体外培养条件下多能性维持的影响,为初步阐明nanog基因的表达调控机制提供理论依据。PCR扩增nanog基因不同长度片段的启动子序列,定向克隆至pGL3-basic载体和pEGFP-N1构建重组载体;将重组载体转染DF-1细胞后,48h收集蛋白,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定基本转录调控区;将重组载体转染DF-1细胞后添加5-Azadc或TSA对nanog基因进行诱导表达,并通过双荧光素酶报告基因检测系统,分析其对nanog基因启动子活性的影响。选取生长至第3代的ESC,培养基中添加最适浓度的5-Azadc和TSA,每隔两天观察细胞,分析其对ESC体外多能性维持的影响,并对诱导至第10天的细胞进行间接免疫荧光检测。结果表明,成功构建3个片段的双荧光素酶报告基因表达载体;双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3/1967活性最强;分别添加或者联合添加5-Azadc和TSA均可使nanog基因的转录活性增强;5-Azadc和TSA诱导对ESC体外培养条件下多能性维持的影响结果显示,诱导6d后,对照组细胞大量分化,细胞克隆无法维持,而5-Azadc和TSA诱导组克隆明显,5-Azadc+TSA联合诱导组细胞克隆数量显著多于对照组;诱导至第10天,对照组细胞完全分化,没有细胞克隆,而诱导组存在大量细胞克隆,联合诱导组克隆数量显著多于其他两组;SSEA-1间接免疫荧光结果显示,对照组没有明显的ESC克隆,而5-Azadc组和联合诱导组细胞克隆明显,综上表明,5-Azadc和TSA可有效地通过提高nanog基因的表达而维持鸡ESC在体外培养过程中的多能性。

关键词： nanog基因启动子 5-Azadc TSA 双荧光素酶活性检测系统

奶牛干细胞多能性基因nanog和Lin28克隆分析及其逆转录病毒表达载体的构建与包装

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中国兽医学报 2010年第1期30卷 65-73页

作者：吕长荣陈冬梅辛晓玲窦忠英西北农林科技大学动物医学院陕西省农业分子生物学重点实验室国家干细胞工程技术研究中心陕西分中心陕西杨凌712100

以50-60日龄的Holstein奶牛胎儿原始生殖嵴组织为材料，通过RT—PCR的方法克隆奶牛nanog与Lin28基因开放性阅读框（ORF）全序列。序列全长分别为903bp和618bp。所克隆的奶牛nanog与Lin28基因序列与GenBank中已经发表的参考序列进行比对... 详细信息

以50-60日龄的Holstein奶牛胎儿原始生殖嵴组织为材料，通过RT—PCR的方法克隆奶牛nanog与Lin28基因开放性阅读框（ORF）全序列。序列全长分别为903bp和618bp。所克隆的奶牛nanog与Lin28基因序列与GenBank中已经发表的参考序列进行比对同源性均为100％。将扩增的基因片段经过酶切后亚克隆到反转录病毒载体pMSCVneo的多克隆位点，经过酶切、PCR和测序鉴定正确后，应用lipofectamine2000介导转染PT67包装细胞，经过14dG418连续抗性筛选，挑选抗性集落扩大培养。收集病毒上清经过RT—PCR与透射电镜检测，并用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果表明，病毒上清中含有逆转录病毒颗粒，nanog与Lin28基因在筛选后的包装细胞PT67细胞中均有转录，病毒上清感染滴度值分别达到7．5×10^7 cfu／mL和9．19×10^7’cfu／mL。结果表明，本试验已经成功克隆出奶牛nanog与Lin28基因开放性阅读框全序列，并建立高效、稳定产生包含有pMSCV-nanog与pMSCV-Lin28质粒的感染性病毒颗粒的包装细胞株，为进一步产生奶牛诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）奠定基础。

关键词： nanog基因 Lin28基因 pMSCV逆转录病毒载体诱导性多能干细胞奶牛

转nanog基因抑制帕金森病大鼠脑内小胶质细胞介导的炎性反应

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基础医学与临床 2014年第12期34卷 1665-1670页

作者：陈施艳张志坚刘丽金林红吴秀丽王伟王志强福建医科大学附属第一医院神经内科福建福州350005

目的探讨转nanog基因对6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病大鼠中脑黑质区小胶质细胞的激活及肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。方法将大鼠随机分为对照、6-OHDA+PBS、6-OHDA+PNL与6-OHDA+nanog组。模型组大鼠左侧纹状体内注射6-OHDA,... 详细信息

目的探讨转nanog基因对6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病大鼠中脑黑质区小胶质细胞的激活及肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。方法将大鼠随机分为对照、6-OHDA+PBS、6-OHDA+PNL与6-OHDA+nanog组。模型组大鼠左侧纹状体内注射6-OHDA,再将PBS、慢病毒空载体PNL-IRES.EGFP(PNL)、转nanog基因载体分别注入6-OHDA+PBS、6-OHDA+PNL与6-OHDA+nanog组大鼠左侧纹状体;14 d后,注射阿朴吗啡(APO),观察大鼠的旋转行为;免疫组织化学染色观察黑质多巴胺能神经元数量;免疫荧光观测黑质区小胶质细胞数量及TNF-α表达。结果注射后14 d,6-OHDA+nanog组大鼠APO诱发的旋转效应低于6-OHDA+PNL与6-OHDA+PBS组(Pnanog组存活的多巴胺能神经元数量多于6-OHDA+PNL与6-OHDA+PBS组(Pnanog组小胶质细胞数目和TNF-α表达水平低于6-OHDA+PNL与6-OHDA+PBS组(Pnanog基因可抑制帕金森病大鼠脑内小胶质细胞活化介导的炎性反应,具有神经元保护作用。

关键词：帕金森病 6-羟多巴胺 nanog基因小胶质细胞肿瘤坏死因子α

小鼠nanog基因原核表达载体的构建及表达

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中国农业科学 2007年第2期40卷 373-378页

作者：李军吕长荣窦琳窦忠英西北农林科技大学国家干细胞工程技术研究中心陕西分中心西北农林科技大学国家干细胞工程技术研究中心陕西分中心杨凌712100

【目的】构建小鼠nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得... 详细信息

【目的】构建小鼠nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化TGⅠ大肠杆菌,筛选阳性克隆,其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-nanog已构建成功。提取pGEX-KG-nanog质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得nanog基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为63 kD;以IPTG终浓度为0.8 mmol.L-1,诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。

关键词： nanog基因原核表达 GST融合蛋白小鼠