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基于线粒体cox1、nad1和rrn L基因探讨马圆线科线虫间的亲缘关系

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黑龙江八一农垦大学学报 2024年第1期36卷 34-40页

作者：张中怀高远兰卓邱阳元邱鸿宇安琪高俊峰王春仁黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319 台州学院生命科学技术学院

为探讨马圆线科线虫(圆线亚科和盅口亚科)间的亲缘关系,对长伞杯冠线虫(Cylicostephanus longibursatum)、冠状冠环线虫(Coronocyclus coronatus)、细口杯环线虫(Cylicocyclus leptostomus)、拉氏杯口线虫(Poteriostomum ratzii)、麦氏副杯口线虫(Parapoteriostomum mettami)和无齿圆形线虫(Strongylus edentatus)6种线虫的线粒体cox1、nad1和rrnL基因进行扩增,与同科相关线虫进行比较分析。然后以线粒体cox1、nad1和rrnL串联序列为标记基因,采用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建进化树来探讨圆线科线虫间的亲缘关系。结果显示,研究中6种线虫的cox1序列长度均为1578 bp,nad1的序列长度除无齿圆形线虫为879 bp外,其余均为873 bp,rrnL序列长度均不同,大小为959~980 bp。6种线虫的cox1、nad1和rrnL的AT含量分别为67.55%~69.71%、71.36%~73.83%和80.88%~82.59%。圆线科线虫间cox1、nad1和rrnL基因的相似性分别为83.4%~97.9%、79.0%~98.4%和78.8%~98.9%。值得注意的是,圆线亚科的三齿属线虫与盅口亚科的相似性总体要高于同亚科的圆线属。进化分析显示,三齿属并没有与同亚科的圆线属形成独立分支,而是与盅口亚科线虫聚集在一起。在盅口亚科分支中,并非每一属单独形成一独立分支,冠环属和杯冠属最为明显,为复系。基于马圆线虫线粒体cox1、nad1和rrnL的序列和进化分析表明,三齿属线虫与盅口亚科的关系较圆线亚科更近,支持三齿属应隶属于盅口亚科这一假说。

关键词：马圆线虫线粒体 cox1 nad1 rrnL 进化分析

线粒体DNA nad1序列在青海云杉青藏高原台面和周边地区种群中的变异

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生态学报 2005年第12期25卷 3307-3313页

作者：杨瑞孟丽华张茜刘建全中国科学院西北高原生物研究所青藏高原生物进化与适应开放实验室

青藏高原是气候变迁的敏感区。但第四纪以来全球气候的反复变化对该地区植物分布格局的影响至今未进行过仔细研究。线粒体DNA在松科植物中是母系遗传,其变异被广泛用于研究该科植物历史上由于气候变迁造成的瓶颈作用以及冰期后扩张中形... 详细信息

青藏高原是气候变迁的敏感区。但第四纪以来全球气候的反复变化对该地区植物分布格局的影响至今未进行过仔细研究。线粒体DNA在松科植物中是母系遗传,其变异被广泛用于研究该科植物历史上由于气候变迁造成的瓶颈作用以及冰期后扩张中形成的奠基者效应。对青海云杉位于青藏高原核心、其边缘甘肃和宁夏地区共12个种群155个个体的线粒体nad 1片段的全序列进行测序,研究该序列在各种群中的变异状况。通过测序发现该片段在青海云杉中十分保守,在所有个体中仅发现由于重复序列造成的5种单倍型(H ap A,H ap B,H ap C,H ap D和H ap E)。高原核心的所有种群均只有H ap A,而所有的4种单倍型都在高原边缘的甘肃地区存在,但这一地区仍然是H ap A占优势;但是在远离高原的宁夏地区则存在5种单倍性;多样性的变异趋势是宁夏地区高于高原边缘的甘肃地区,而甘肃地区又显著高于高原核心地区。这一结果表明,在过去气候变迁过程中,不同地区的青海云杉种群经历了不同的气候影响,这种影响造成的奠基者效应或者瓶颈作用是造成目前这种遗传多样性分布格局的主要原因。现有的单倍型分布格局,特别是高原上所有间断分布种群拥有相同的单倍型表明,森林回迁中的奠基者效应应是更为重要的因素。

关键词：青海云杉线粒体DNA nad1 序列变异瓶颈作用奠基者效应

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花烟草nad1基因的原核表达及纯化

分子植物育种 2020年第11期18卷 3502-3508页

作者：罗显麟赵德刚赵懿琛贵州大学药学院山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵阳550025 贵州大学茶学院山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵阳550025 贵州省农业科学院农业部DUS中心贵阳分中心贵阳550006

花烟草的花中特异地存在一种植物防御素Nicotiala alata defensin 1(nad1),对多种致病性真菌具有防御活性,在天然免疫系统中起着重要作用。该蛋白还对哺乳动物肿瘤细胞具有杀伤作用。本研究构建了原核表达载体p ET28a-nad1,将其转化到Ro... 详细信息

花烟草的花中特异地存在一种植物防御素Nicotiala alata defensin 1(nad1),对多种致病性真菌具有防御活性,在天然免疫系统中起着重要作用。该蛋白还对哺乳动物肿瘤细胞具有杀伤作用。本研究构建了原核表达载体p ET28a-nad1,将其转化到Rosetta菌株中进行诱导表达并优化了诱导表达条件,发现在25℃下,0.5 mmol/L IPTG诱导表达过夜后,目的蛋白积累量达到最高,并主要以可溶性蛋白形式存在。利用Ni柱对nad1重组蛋白进行亲和层析纯化,产物经Western Blot鉴定发现在16.8 kD处有特异性条带,与预期的nad1重组蛋白大小一致。本研究结果为进一步研究nad1蛋白的作用机制提供实验依据。

关键词： nad1 防御素原核表达亲和纯化

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豆科植物nad1基因转录调控机制研究

豆科植物NAD1基因转录调控机制研究

作者：任亚萍华中农业大学

学位级别：硕士

豆科植物与根瘤菌的共生固氮作用是植物获取氮素经济、有效、无环境污染的最佳途径。根瘤是豆科植物与根瘤菌共生互作在根部发育形成的植物器官,是根瘤菌固氮的场所。每个成熟根瘤中都含有成百上千的根瘤菌。在豆科植物形成有效固氮根... 详细信息

豆科植物与根瘤菌的共生固氮作用是植物获取氮素经济、有效、无环境污染的最佳途径。根瘤是豆科植物与根瘤菌共生互作在根部发育形成的植物器官,是根瘤菌固氮的场所。每个成熟根瘤中都含有成百上千的根瘤菌。在豆科植物形成有效固氮根瘤的过程中,根瘤菌侵染和定殖是如何逃逸寄主植物免疫防御反应的问题是近年来共生固氮研究的热点。本实验室前期通过反向遗传学鉴定得到一个在豆科植物根瘤中特异表达、与共生过程中的免疫反应相关的结瘤防御激活基因nad1,该基因功能缺失后在苜蓿(Medicago truncatula)根瘤中表现为根瘤防御反应过度激活,根瘤坏死和固氮活性丧失等共生缺陷表型。而百脉根(Lotus japonicas)nad1突变体并未表现出与苜蓿突变体同样的表型(Wang et al.2016)。实验室前期工作确定了Lj nad1基因启动子具有三个核心调控区域NS-box1、NS-box2、NS-box3(Nodulation signaling responsive units,NS-box1/2/3),并以Lj nad1pro(-382～-276)核心片段筛选百脉根c DNA文库,得到了与之结合的AT-hook类转录因子Lj AHL20、Lj AHL23。AT-hook类转录因子主要结合AT-rich的DNA区域,参与基因的表达调控。本研究主要从AT-hook类转录因子入手,以豆科模式植物——百脉根和苜蓿为研究对象,通过q RT-PCR、酵母单杂、EMSA、烟草体系转录激活及毛根转化技术,对nad1基因的表达调控做进一步探究,具体研究结果如下:1.对百脉根、苜蓿AHLs蛋白序列进行生物信息学分析。结果表明,AHLs家族蛋白在百脉根和苜蓿中均存在Clade A和Clade B两大分枝,其中Lj AHL20/23蛋白位于Clade A分枝,与拟南芥中参与植物免疫的At AHL20、At AHL27蛋白位于同一进化分枝,暗示着Lj AHL20/23蛋白可能参与百脉根共生免疫调控过程。***-PCR对百脉根中LjAHLs基因表达分析,结果表明Lj AHL20/23在接种3d后均呈上调趋势,与nad1基因在接种后诱导表达上调呈线性关系,而其它Lj AHLs基因并未表现出明显上调或下调趋势,说明Lj AHL20/23可能特异性参与nad1基因的表达调控。3.酵母单杂、EMSA、烟草转录激活等实验结果证实,百脉根Lj AHL20/23与Lj nad1基因启动子核心区域NS-box1特异性结合,且Lj AHL20对Lj nad1基因的表达具有激活作用。4.苜蓿毛根转化超表达LjAHL20/23-SRDX植株接种根瘤菌,观察根瘤表型,结果显示,融合了转录抑制蛋白结构域的Lj AHL20/23超表达植株根瘤侵染区中侵染细胞出现异常,出现类似于苜蓿nad1突变体早期根瘤中共生缺陷的表型。说明Lj AHL20/23-SRDX可能抑制了nad1基因的表达;采用含有固氮酶基因nif H启动子融合GUS报告基因的苜蓿根瘤菌*** 1021接种转基因植株显示:固氮酶基因nif H表达被抑制,暗示AHL20/23可能参与共生根瘤固氮过程。

关键词： AT-hook转录因子 nad1 共生免疫酵母单杂转录激活 EMSA

基于线粒体nad1和COX1基因的大熊猫西氏贝蛔虫种群遗传结构研究

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基于线粒体NAD1和COX1基因的大熊猫西氏贝蛔虫种群遗传结构研究

作者：孙韵四川农业大学

学位级别：硕士

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是世界公认的最为濒危物种之一。在历史进化过程中受气候变化、人类活动及其自身的生理局限等因素影响,大熊猫经两次显著地种群扩张和收缩后逐渐分化为了秦岭、岷山和邛崃·相岭·凉山三个遗传种群。宿... 详细信息

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是世界公认的最为濒危物种之一。在历史进化过程中受气候变化、人类活动及其自身的生理局限等因素影响,大熊猫经两次显著地种群扩张和收缩后逐渐分化为了秦岭、岷山和邛崃·相岭·凉山三个遗传种群。宿主种群的扩张、收缩和迁移决定了寄生虫种群结构和遗传分化。西氏贝蛔虫(Baylisascaris schroederi)是大熊猫体内最常见且危害最为严重的寄生虫。在随大熊猫协同进化的过程中,西氏贝蛔虫种群的遗传结构是否发生分化目前尚未得知。为了给西氏贝蛔虫的流行病学、进化生物学和抗药机制提供一些基础资料,本研究分别使用线粒体nad1和COXl基因作为分子标记,对来自秦岭、岷山和邛崃地理种群的西氏贝蛔虫进行了种群遗传结构研究。本论文主要的研究工作如下：1.基于线粒体nad1基因对西氏贝蛔虫的种群遗传结构研究为了探究中国不同山系大熊猫西氏贝蛔虫种群遗传结构,本实验利用PCR技术扩增了三个地理种群的共计47个样本(岷山13个,邛崃26个,秦岭8个)的线粒体nad1(873bp)基因全序列,并进行了种群遗传结构分析。三个地理种群的47个样本共分出了15个单倍型;三个种群总体单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(pi)分别为0.8529±0.035和0.003378±0.001999,表现出高单倍性多样性和低核苷酸多样性的特点;Tajima’s D和Fu’s Fs中性检验显示均为显著负值,种群动态分布图呈现单峰型,显示种群出现过扩张：分子方差分析(AMOVA)显示种群内变异大于种群间;单倍型NJ无根系统进化树和单倍型网络图未发现地理类聚;种群间的分化系数(Fst)和基因流(Nm)显示个地理种群未形成显著的遗传分化。结果表明：西氏贝蛔虫的三个地理种群的遗传变异性较低,种群内变异是种群变异的主要来源;种群在进化过程中出现过种群扩张;种群未形成地理聚类,种群遗传分化不明显,三个地理种群的西氏贝蛔虫属于同一个种群。2.基于线粒体COX1基因对西氏贝蛔虫的种群遗传结构研究为了探究中国不同山系大熊猫西氏贝蛔虫种群遗传结构,为西氏贝蛔虫病的流行病学提供基础资料。本实验利用PCR技术扩增了三个地理种群的共计56个样本(岷山13个,邛崃33个,秦岭4个)的线粒体COX1基因(1578bp)全序列,并进行了种群遗传结构分析。三个地理种群的56个样本共分出了24个单倍型;三个种群总体单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(pi)分别为0.9364±0.0168和0.002547±0.001433;Tajima’s D和Fu’s Fs中性检验显示均为显著负值,种群动态分布图呈现单峰型,显示种群出现过扩张;分子方差分析(AMOVA)种群间方差(Va)占总变异的8.47%,种群内的方差(Vb)占91.53%,表明变异主要发生在群体内;岷山和邛崃种群间的基因流(Nm=21.92)高于岷山与秦岭种群间基因流为(Nm=3.84)和邛崃与秦岭种群间基因流(Nm=4.19);单倍型NJ无根系统进化树和单倍型网络图未发现地理类聚。结果表明：西氏贝蛔虫的三个地理种群的遗传变异性较低,种群内变异是种群变异的主要来源;种群在进化过程中出现过种群扩张;种群未形成地理聚类,种群遗传分化不明显,三个地理种群的西氏贝蛔虫属于同一个种群。

关键词：大熊猫西氏贝蛔虫线粒体 COX1 nad1 种群遗传结构

豆科植物根瘤nad1基因启动子核心区的鉴定及功能分析

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豆科植物根瘤NAD1基因启动子核心区的鉴定及功能分析

作者：陈琳华中农业大学

学位级别：硕士

豆科植物能够与根瘤菌共生形成根瘤进行固氮,近年来有关共生网络相关基因的研究在不断的完善中,但对于共生网络建立过程中免疫是如何被调控的却知之甚少。通过对根瘤菌入侵豆科植物时转录组数据分析,发现防御相关基因表达瞬时上调后下调... 详细信息

豆科植物能够与根瘤菌共生形成根瘤进行固氮,近年来有关共生网络相关基因的研究在不断的完善中,但对于共生网络建立过程中免疫是如何被调控的却知之甚少。通过对根瘤菌入侵豆科植物时转录组数据分析,发现防御相关基因表达瞬时上调后下调;以及DNF2、RSD、Sym CRK、NCR、DNF1等在根瘤菌释放进入植物细胞中时参与免疫调控相关基因的发现,在共生过程中免疫的调控研究逐渐被提上日程。而本实验室前期研究也得到一个与免疫相关的基因nad1,研究表明nad1基因在豆科植物百脉根和苜蓿根瘤中特异性表达且表达量高,苜蓿nad1的突变体表现出根瘤坏死、酚类化合物积累等明显的防御表型,而百脉根nad1的突变体则无明显表型。为研究nad1在两种豆科模式植物中发挥的具体功能,本研究主要以nad1表达调控为研究核心,以百脉根、苜蓿为研究对象,采用毛根转化技术研究nad1启动子的核心调控区域,采用酵母单杂交技术筛选与百脉根nad1核心调控区域互作的转录因子,并联合Gibson克隆技术和SMART c DNA文库构建技术,构建了苜蓿根瘤的特异性AD-c DNA文库,便于之后对苜蓿nad1启动子互作转录因子的研究。主要研究结果如下:1.百脉根nad1表达调控模式及Box1核心调控区域分析本实验室前期的研究结果表明百脉根nad1启动子表达调控的区域为(-400～-200)(起始密码子为+1)。将不同豆科植物的(-400～-200)区域序列进行比对得到3个保守性高的区段,将这3个区段分别命名为Box1(-391～-363)、Box2(-331～-308)、Box3(-296～-269)。毛根转化结果表明百脉根nad1启动子Box1和Box3同时存在才能启动nad1的表达;Box2在百脉根中启动nad1基因的表达不发挥核心作用;Box1的核心调控区域为(-381～-370);2.调控百脉根nad1表达的转录因子研究以p Lj nad1pro(-382～-276)-Ab Ai/Y1HGold为诱饵菌株筛选百脉根c DNA文库,结果分离到77个阳性克隆,对阳性克隆的外源片段测序和分析得到39个与Lj nad1pro(-382～-276)互作的蛋白。挑选其中的6个:Sphingomyelin synthase-like domain,F-box/Leucine rich repeat protein,AHL23,AHL20,PLATZ,MULE transposase作为备选蛋白进行分析,结果表明AHL20、MULE transposase锌指蛋白部分能够与诱饵片段发生互作;PLATZ与诱饵片段没有互作;Sphingomyelin synthase-like domain,F-box/Leucine rich repeat protein缺少充分的信息,不能确定是否与诱饵片段互作;3.苜蓿nad1表达调控模式及调控区域分析本实验室前期的研究结果表明百脉根与苜蓿在nad1基因的表达调控上具有相同的调控区域,但具体区域未知。将苜蓿与百脉根nad1启动子序列比对发现在苜蓿nad1启动子序列的(-512～-374)区段与百脉根(-400～-200)区段相似性较高,而毛根转化结果表明苜蓿nad1启动子中存在至少3个核心区,分别位于(-912～-483)、(-466～-424)、(-402～-374)区域;单独的(-402～-374)即可启动苜蓿nad1基因的表达,而(-466～-424)、(-402～-374)两个区域同时存在时能够提高nad1基因的表达量;4.苜蓿根瘤AD-c DNA文库构建以蒺藜苜蓿(A17)的成熟根瘤为材料构建的AD-c DNA,其转化效率达到7.74×10～5cfu/3μg p GADT7-Rec-New。随机菌落PCR检测结果表明,插入DNA片段的大小在0.5kb～2.0 kb之间,其中插入片段大于0.75kb占45.6%,文库的重组效率达到91.7%,构建AD-c DNA文库以质粒形式保藏备用。

关键词： nad1 毛根转化酵母单杂交互补实验 Gibson克隆技术

Construction and Genetic Transformation of Over-Expression Vector of nad1 Gene in Rice

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Agricultural Science & Technology 2011年第7期12卷 963-965页

作者：李炜谭艳平王春台刘学群中南民族大学生命科学院/生物技术国家民委重点实验室武汉430074

[Objective] The aim was to clone the mitochondrial-related gene nad1 and produce transgenic rice plants with nad1.[Method] The total RNA was extracted from rice seedlings and reverse transcripted into *** the target gene nad1 was amplified by using the cDNA as *** nad1 and Rf1b,a sequence of signal peptide of mitochondria,were linked to binary expression vector *** recombinant plasmid was transformed into the callus by Agrobacterium-mediated approach.[Result] The target gene nad1 was 978 *** binary expression vector carrying nad1 and signal peptide of mitochondria was constructed *** addition,a lot of transgenic plants were obtained.[Conclusion] The study will provide basis to investigate the effect of over-expression of nad1 on rice plant growth.

关键词： Rice nad1 Genetic transformation

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牛裂体吸虫线粒体DNA序列和基因排序分析

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2010年第4期28卷 252-256页

作者：肖景莹蔡连顺長瀧充德弘慎治 Jarilla Blanca R. 嶋田雅暁 David Blair 吾妻健日本高知大学医学部高知783-8505 佳木斯大学基础医学院佳木斯154007 日本长崎大学热带医学研究所长崎852-8523 澳大利亚詹姆斯库克大学热带生物学院汤斯维尔QLD 4811

目的为探讨牛裂体吸虫(Schistosoma bovis)在裂体属内的系统发生位置,测定牛裂体吸虫线粒体基因部分序列,并分析该编码区域的基因序列和基因排序。方法以GNT-K法抽提牛裂体吸虫成虫基因组DNA,用兼并和特异引物扩增目的基因。扩增产物经... 详细信息

目的为探讨牛裂体吸虫(Schistosoma bovis)在裂体属内的系统发生位置,测定牛裂体吸虫线粒体基因部分序列,并分析该编码区域的基因序列和基因排序。方法以GNT-K法抽提牛裂体吸虫成虫基因组DNA,用兼并和特异引物扩增目的基因。扩增产物经纯化后克隆于pGEM1T质粒载体,并转化大肠埃希菌。抽提和纯化阳性质粒DNA,并测序。以纯化后的阳性质粒DNA为模板,根据已获得的序列设计内部特异引物,采用引物步移法获得全长目的片段。在GenBank中查找曼氏血吸虫等相关血吸虫线粒体基因序列,作基因排序及比较分析后,以邻接法绘制系统发生树。结果测定了牛裂体吸虫线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅳ～Ⅰ基因序列(nicotinamide adeninedinucleotide dehydrogenase subunit4-1gene,nad4-nad1),其长度为2214bp。分析该编码区基因排序为nad4-trnQ(Gln)-trnK(Lys)-nad3-trnD(Asp)-nad1。牛裂体吸虫在该区域的线粒体基因排序与非洲支系血吸虫相似,与亚洲支系血吸虫有很大的不同;根据牛裂体吸虫与其他8种吸虫部分nad4,nad3,部分nad1和部分nad4+nad3+nad1基因序列比对结果,分别构建系统发生树。结果表明,牛裂体吸虫与埃及血吸虫位于同一簇,归属于非洲血吸虫支系,这与由基因排序推测的牛裂体吸虫的系统发生位置结果相一致。结论牛裂体吸虫属于非洲支系而非亚洲支系血吸虫。

关键词：牛裂体吸虫 nad4 nad3 nad1 基因排序系统发生关系

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云南省大理州片形吸虫的分子鉴定

中国病原生物学杂志 2019年第5期14卷 525-529页

作者：唐梦婷周岩刘榆华程娜张剑平许学年中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所国家热带病研究中心世界卫生组织热带病合作中心科技部国家级热带病国际联合研究中心卫生部寄生虫病病原与媒介生物学重点实验室上海200025 大理州血吸虫病防治研究所

目的基于核糖体第一内转录间隔区(ITS1)、线粒体细胞色素c氧化酶亚基(COX1)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1(nad1)序列初步鉴定云南省大理州地区片形吸虫的种类。方法于大理州下关农贸市场采集4头感染片形吸虫牛的肝脏,分离片形吸虫... 详细信息

目的基于核糖体第一内转录间隔区(ITS1)、线粒体细胞色素c氧化酶亚基(COX1)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1(nad1)序列初步鉴定云南省大理州地区片形吸虫的种类。方法于大理州下关农贸市场采集4头感染片形吸虫牛的肝脏,分离片形吸虫成虫,并孵育以获得其虫卵。分别提取片形吸虫成虫及虫卵的基因组DNA,PCR扩增核糖体ITS1,线粒体COX1和nad1序列并测序,所得序列经BLAST在线工具进行比对,鉴定虫种;采用BioEdit软件进行多序列比对,分析片形吸虫亲代及子一代的遗传变异情况。结果共获得64条片形吸虫成虫,核糖体DNA的ITS1序列扩增产物长422 bp,出现5个变异位点。64条片形吸虫成虫中有5条(7.81%)与GenBank中肝片形吸虫的ITS1序列(登录号:AM709612)相似度为100%,其余59条(92.19%)均同时携带肝片形吸虫和巨片形吸虫的序列特征,为Fg/Fh杂合型片形吸虫;测序图谱中5个变异位点均出现双峰,个体间双峰比值存在明显差异,从Fg∶Fh≥10∶1到Fg∶Fh≤1∶10不等。线粒体DNA的nad1和COX1序列扩增产物长度分别为535 bp和438 bp,变异位点分别为47个和41个。其中1条成虫(1.56%)与GenBank中肝片形吸虫的nad1序列(登录号:GQ175363)、COX1序列(登录号:GQ398051)相似度为100%,另63条(98.44%)与巨片形吸虫的nad1序列(登录号:AB207168)、COX1序列(登录号:AB207177)相似度为99.81~100%。虫卵线粒体COX1、nad1序列与母本完全一致;ITS1序列分型与母体完全一致,但其杂合程度存在分化现象。结论云南省大理地区片形吸虫种群以"杂合型"片形吸虫为主,同时存在极少量纯种肝片形吸虫。

关键词：片形吸虫虫种鉴定 ITS1 nad1 COX1 杂合大理