检索结果-南通市图书馆

作者：纪李铿汕头大学

学位级别：硕士

【背景】当前,女性乳腺癌已成为全球第一大癌症,位居女性癌症发病率与死亡率之首。约70%的女性乳腺癌患者为雌激素受体(estrogen receptorα,ER)阳性()表达,首选内分泌治疗,他莫昔芬(tamoxifen,Tam)作为经典一线药物,通过竞争结合ER来... 详细信息

【背景】当前,女性乳腺癌已成为全球第一大癌症,位居女性癌症发病率与死亡率之首。约70%的女性乳腺癌患者为雌激素受体(estrogen receptorα,ER)阳性()表达,首选内分泌治疗,他莫昔芬(tamoxifen,Tam)作为经典一线药物,通过竞争结合ER来拮抗雌激素对乳腺癌细胞的促生长作用,发挥抗肿瘤效应。然而,Tam耐药是影响该类患者预后的主要挑战。p110α是PIK3CA所编码的PI3K的一种催化亚基,对PI3K/AKT通路的活性至关重要。PIK3CA高频突变是Tam耐药的已知诱因,p110α的表达水平也是影响Tam敏感性的因素。另一方面,Tam耐药的一个重要特征在于管腔型生物标志物的减少。本研究中,我们发现n6-腺嘌呤特异性DnA甲基转移酶1(n6 adenine-specific DnA methyltransferase 1,n6amt1)是管腔型乳腺癌(ER)的一种潜在生物标志物,并且其下调通过调控p110α的表达参与了Tam耐药的发生。【目的】(1)明确管腔型乳腺癌生物标志物n6amt1分子表达下调的机制;(2)明确n6amt1与Tam耐药的关系;(3)阐明n6amt1与p110α的调控关系及其对Tam耐药的影响。【方法】(1)通过乳腺癌细胞系的蛋白质免疫印迹(Western blot,WB),Breast Cancer Gene-Expression Miner(bc-Gen Ex Miner)数据库分析以及临床标本的免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)检测,确定n6amt1在各乳腺癌分型中的表达水平分布。(2)分别构建n6amt1稳定敲减和过表达的细胞系(MCF-7-sh n6amt1和MCF-7-n6amt1),用CCK-8法及移植瘤技术分别检测n6amt1敲减及过表达细胞对Tam的体外、体内敏感性。(3)通过PROMO与Ch IPBase数据库联合分析确定n6amt1潜在的转录因子,再通过染色质免疫共沉淀(Ch IP)-qPCR与荧光素酶报告基因技术(构建n6amt1启动子区的报告质粒p GL-n6-WT;构建突变了启动子区两个潜在的转录因子结合位点的报告质粒p GL-n6-Mut1和p GL-n6-Mut2)进一步验证该转录因子对n6amt1的转录调控。(4)通过6m A-IP-seq技术与RT-qPCR技术确定n6amt1对p110α的调节与6m A修饰水平及转录水平的关系。(5)运用WB检测n6amt1敲减前后,细胞在蛋白翻译抑制剂处理不同时间的条件下p110α的稳定性,检查bc-Gen Ex Miner数据库中n6amt1与nEDD4L的相关性,运用RT-qPCR技术与WB检测n6amt1敲减前后细胞,亲本与耐药细胞nEDD4L,PIK3CA(p110α),p-AKT(S473)等的表达水平。(6)分别在敲减n6amt1的细胞中过表达nEDD4L(MCF-7-sh n6amt1/nEDD4L),在过表达n6amt1的细胞中瞬时敲减nEDD4L(MCF-7-n6amt1/si nEDD4L),运用RT-qPCR与WB检测其nEDD4L,PIK3CA(p110α),p-AKT(S473)等的表达水平,CCK-8法检测上述细胞对Tam的敏感性。(7)对敲减n6amt1前后的细胞进行过表达或瞬时敲减nEDD4L,在MG-132处理后,WB检测p110α的表达水平。(8)运用IHC技术检测FOXA1,n6amt1,nEDD4L,p110α在153例经Tam治疗的ER乳腺癌患者手术标本中的表达水平,用皮尔森相关性分析揭示各调控因子之间的相关性,再用Kaplan Meier生存分析揭示这些调控因子表达水平对患者生存期的影响。【结果】(1)WB结果显示n6amt1在管腔型乳腺癌细胞系(MDA-MB-453,MCF-7及T47D)的表达水平显著上调,bc-Gen Ex Miner分析结果显示n6amt1在管腔型乳腺癌组织的表达水平显著上调(n=566,pn6amt1与ER的表达呈正相关(r=0.39,n=4421,pn6amt1在管腔型乳腺癌手术标本的表达水平显著上调(n=31,pn6amt1细胞对Tam敏感性呈显著下调(pn6amt1细胞对Tam敏感性呈显著上调(pn6amt1敲减细胞的移植瘤对Tam敏感性显著下调(pn6amt1敲减细胞的移植瘤与对照细胞的移植瘤相比,瘤重明显增加(pn

关键词： ER+乳腺癌 n6amt1 PI3K/AKT 他莫昔芬耐药

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Structural insight into human n6amt1-Trm112 complex functioning as a protein methyltransferase

Structural insight into human N6amt1-Trm112 complex function...

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中国生物化学与分子生物学会2019年全国学术会议暨学会...

作者： Wenjing Li Yu Shi Tianlong Zhang Jie Ye Jianping Ding State Key Laboratory of Molecular Biology CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology University of Chinese Academy of Sciences Chinese Academy of Sciences School of Life Science and Technology ShanghaiTech University

DnA methylation is an important epigenetic modification in many organisms and can occur on cytosine or adenine. n6-methyladenine(6 mA) exists widespreadly in bacterial genomes, which plays a vital role in the bacterial restrictionmodification system. Recently, 6 mA has also been reported to exist in the genomes of a variety of eukaryotes from unicellular organisms to metazoans. There were controversial reports on whether human n6amt1, which was originally reported as a glutamine MTase for eRF1, is a putative 6 mA DnA MTase. We report here the crystal structure of human n6amt1-Trm112 in complex with cofactor SAM. Structural analysis shows that Trm112 binds to a hydrophobic surface of n6amt1 to stabilize its structure but does not directly contribute to substrate binding and catalysis. The active site and potential substrate-binding site of n6amt1 are dominantly negatively charged and thus are unsuitable for DnA binding. The biochemical data confirm that the complex cannot bind DnA and has no MTase activity for DnA, but exhibits activity for the methylation of Gln185 of e RF1. Our structural and biochemical data together demonstrate that n6amt1 is a bona fide protein MTase rather than a DnA MTase.

关键词： n6amt1 Trm112 6mA modification DnA methyltransferase protein methyltransferase substrate specificity

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DnA甲基转移酶n6amt1基因敲降和过表达及其功能初探

DNA甲基转移酶N6AMT1基因敲降和过表达及其功能初探

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作者：杨钰扬州大学

学位级别：硕士

DnA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在基因表达、细胞功能维持、胚胎发育以及肿瘤发生等方面发挥着重要作用。n6-甲基腺嘌呤(6mA)是DnA甲基化修饰方式之一,由甲基转移酶n6amt1和去甲基化酶ALKBH1调控。研究发现,肿瘤组织中6mA及其... 详细信息

DnA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在基因表达、细胞功能维持、胚胎发育以及肿瘤发生等方面发挥着重要作用。n6-甲基腺嘌呤(6mA)是DnA甲基化修饰方式之一,由甲基转移酶n6amt1和去甲基化酶ALKBH1调控。研究发现,肿瘤组织中6mA及其甲基转移酶n6amt1的水平呈现下调,而去甲基化酶ALKBH1的水平呈现上调。到目前为止,有关n6amt1基因研究的报道甚少,对其具体生物学功能的研究十分匮乏。为进一步探究n6amt1基因的功能,本研究首先鉴定了几个细胞系n6amt1基因的表达水平,随后选择表达量较高的HEK293细胞系和表达量较低的Hela细胞系进行研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了 n6amt1基因敲降的HEK293细胞系,同时构建了过表达n6amt1基因的Hela细胞系。分析比较了 n6amt1基因表达变化对细胞相关表型的影响,进而初步探讨了 n6amt1基因的生物学功能。研究结果如下:1、不同细胞系的n6amt1基因的表达水平测定。研究旨在检测不同类型细胞系中n6amt1基因的表达水平,探究不同类型细胞n6amt1基因的表达差异,主要是肿瘤细胞的表达差异。已有的细胞系分为两大类,一类是人的正常组织细胞系HEK293和L02,一类是肿瘤组织细胞系SMMC-7721、MCF7HepG2、BGC823、MDA-MB-231、MCF7、AGS、HCT116、KYSE-150 和 Hela。RT-qPCR 鉴定结果显示:正常肾上皮组织细胞系HEK293中n6amt1基因的表达水显著高于癌细胞的表达水平;正常肝细胞系L02的n6amt1基因的表达水平显著高于肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721。在上述测定的细胞系中,HEK293细胞的n6amt1基因的表达水平最高,而Hela细胞的表达水平相对较低,因此选择HEK293细胞进行n6amt1基因敲降,选用Hela细胞进行过表达研究。2、构建n6amt1基因敲降的HEK293细胞系以及观察基因敲降对细胞表型的影响。在n6amt1基因第一个外显子上设计sgRnA,构建n6amt1-sgRnA载体,筛选出基因编辑效率最高的sgRnA表达载体。之后,开始构建同源重组载体,在编辑区上下游各选择40bp序列作为同源臂,将其连接在筛选标签基因和转录终止序列BGH ploy(A)的两端。本实验采用了两种组合的筛选基因,一种是含有PuroR和neoR的双抗性基因组合;另一种是含有PuroR和eGFP的抗性基因和荧光基因的组合。前者利用嘌呤霉素(Puromycin)和新霉素(neomycin)筛选转染细胞,后者用嘿呤霉素(Puromycin)并结合荧光表达情况筛选细胞。在CRISPR/Cas9系统介导的同源重组下,将Donor序列插入n6amt1基因的第一个外显子中,利用插入标签基因的表达对HEK293细胞进行筛选。最后从DnA、RnA以及蛋白水平鉴定n6amt1基因的敲降情况。结果表明:n6amt1基因被成功编辑,n6amt1基因RnA和蛋白水平均有显著降低,最终确认获得了 n6amt1敲降的HEK293细胞系(命名为:HEK293-n6amt1-Knowdown,HEK293-nK)。接着研究 n6amt1 基因敲降对HEK293细胞表型的影响。分别在细胞周期、细胞增殖、细胞迁移以及细胞克隆形成这四个方面对HEK293-nK细胞进行检测。结果表明,n6amt1基因敲降显著增强了HEK293细胞的增殖、迁移以及克隆形成能力。3、n6amt1基因过表达对Hela细胞表型的影响。首先构建n6amt1基因过表达载体pcDnA3.1-n6amt1,再将过表达载体瞬时转染至Hela细胞中。RT-qPCR鉴定n6amt1基因过表达后,对Hela细胞进行增殖实验和迁移实验。结果表明,Hela细胞过表达n6amt1后,细胞的增殖和迁移均受到抑制。实验再次证明n6amt1基因的确影响细胞的增殖和迁移能力。由此推测n6amt1基因对肿瘤的发生和转移有一定的影响作用。

关键词： DnA 6mA甲基化 n6amt1 CRISPR/Cas9 肿瘤

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A genome-wide association study identifies novel genetic loci that modify pharmacokinetic-pharmacodynamic responses to clopidogrel

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中国药理学与毒理学杂志 2016年第10期30卷 1047-1048页

作者： ZHOnG Wan-ping WU Hong CHEn Ji-yan Li Xin-xin LIn Hao-ming ZHAnG Bin ZHAnG Zhi-wei MA Dun-liang SUn Shuo LI Han-ping MAI Li-ping HE Gou-dong WAnG Xi-pei LEI He-ping TAnG Lan LIU Shu-wen ZHOnG Shi-long Guangdong Provincial Key Laboratory of Coronary Heart Disease Prevention Guangdong Cardiovascular Institute Medical Research Center of Guangdong General Hospital Guangdong Academy of Medical Sciences Sun Yatsen Memorial Hospital Sun Yat-sen University Department of Pharmaceutics School of Pharmaceutical SciencesSouthern Medical University

OBJECTIVE Genetic variants in the pharmacokinetic(PK)mechanism are the main underlying factors that modify the antiplatelet efficacy of ***,joint analysis of genetic variants that modify pharmacodynamic(PD)and PK responses to clopidogrel should be effective for identifying the genetic variants affecting the antiplatelet response to the *** A genome-wide association study was conducted to identify new genetic loci that modify PD responses to clopidogrel and its active metabolite H4 in 115 Chinese patients with coronary heart disease(CHD).RESULTS We identified novel variants in two transporter genes(rs12456693 in SLC14A2 and rs2487032 in ABCA1)and in n6amt1(rs2254638)associated with clopidogrel-treated P2Y12reaction unit(PRU)and plasma H4 *** associations between these single nucleotide polymorphisms(SnPs)and PK parameters of clopidogrel and H4 were observed in 31 additional CHD patients(Pnew variants,together with CYP2C19*2 and clinical factors,dramatically improved the predictability of PRU variability to 37.7%compared with the published value of approximately 20%.The function of these SnPs on the activation of clopidogrel was validated in 32 liver S9 fractions,and the n6amt1 rs2254638 T variant was found to be associated with decreased formation of H4(P=0.0386).Meanwhile,n6amt1 rs2254638 was further identified to exert a marginal risk effect for MACE in an independent CHD patient cohort(OR:1.428,95%CI:0.978-2.086,P=0.0653,FDR=0.4726).In conclusion,we systematically identified new genetic variants as risk factors for the reduced efficacy of *** Our study findings enhanced the understanding of the absorption and metabolic mechanisms that influence PD responses to clopidogrel treatment.

关键词： clopidogrel pharmacokinetics pharmacodynamics genome-wide association study n6amt1

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Arsenic metabolism and arsenic-induced epigenetic modifications:the role and implication for arsenic-induced carcinogenesis

Arsenic metabolism and arsenic-induced epigenetic modificati...

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中国毒理学会第六届全国毒理学大会

作者： Y GE Z GOnG D GAILE JR OLSOn REn Xue-feng Departments of Social & Preventive Medicine and Pharmacology & Toxicology The State University of New York

Consumption of drinking water contaminated with arsenic,a natural and carcinogenic metalloid,constitutes a global public health *** lack of knowledge regarding the carcinogenic mechanism of action of arsenic together with the wide spread contamination of drinking water with arsenic supports the designation of arsenic as one of the top-priority hazards throughout the *** of inorganic arsenic to methylated metabolites,in particular monomethylarsonous acid(MMAs),is thought to be a critical step in arsenic-induced carcinogenesis because the higher cytotoxicity and geno-toxicity of MMAthan inorganic and pentavalent methylated ***(+3 oxidation state) meth-yltransferase (AS3MT) has been long considered the major and only enzyme that is capable of biomethylating arsenic in *** recently identified n-6 adenine-specific DnA methyltransferase (n6amt1) as a novel arsenic methyltransferase that is able to convert MMAto the less toxic dimethylarsonic acid(DMA),suggesting that n6amt1 may play a significant role in determining susceptibility to arsenic toxicity and *** evidence has suggested that the carcinogenic activity of arsenic may lie in its ability to induce massive aberrant gene expression and deregulate cell growth,proliferation and differentiation through disrupting epigenetic *** recently showed that arsenic/ MMA? exposure to human cells led to a decreased level of histone acetylation globally,which was associated with an increased sensitivity to arsenic *** further demonstrate that prolonged low-level MMAexposure in human cells causes a systematic increase in the expression and activity of histone deacetylases(HDAC) with an associated reduction in histone *** of the HDAC inhibitor,suberoylanilide hydroxamic acid(SAHA),inhibits these MMA-mediated effects,leading to increase histone acetylation and prevention of MMA-induced malignant ***,we found that a

关键词： arsenic carcinogenesis arsenic metabolism n6amt1 histone acetylation,microRnA

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氯吡格雷抗血小板效应及药动学的全基因组关联性研究

氯吡格雷抗血小板效应及药动学的全基因组关联性研究

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作者：钟婉平南方医科大学

学位级别：硕士

氯吡格雷是冠心病治疗的一线抗血小板药物,能有效降低经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后冠心病患者的死亡率和再缺血事件的发生。但其疗效存在较大个体差异,而目前大部分个体差异仍然无法解释。氯吡格雷需在体内代谢转化为活性代谢物H4才能... 详细信息

氯吡格雷是冠心病治疗的一线抗血小板药物,能有效降低经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后冠心病患者的死亡率和再缺血事件的发生。但其疗效存在较大个体差异,而目前大部分个体差异仍然无法解释。氯吡格雷需在体内代谢转化为活性代谢物H4才能发挥抗血小板聚集作用,所以涉及其代谢活化的基因多态性可能对不同个体间疗效的差异有重要影响。因此,本研究拟结合抗血小板效应和药动学过程进行全基因组关联性分析(GWAS),系统发现影响中国冠心病患者氯吡格雷疗效的新功能性基因变异,并评价其对主要不良心血管事件(MACE)发生的预测作用。首先,在115名患者中检测服药后血小板集聚率(PRU),进行GWAS分析。同时考察H4血药浓度及特别关注药动学通路的基因,筛选出18个可能影响氯吡格雷抗血小板效应和药动学的候选SnP位点。进一步研究候选SnP位点与氯吡格雷药动学的相关性。入选31名患者作为研究对象,给予氯吡格雷后进行药动学考察及候选位点分型检测,分析候选位点基因型与氯吡格雷和H4药动学参数(Cmax、Tmax、AUC0-4h)的关联性。除了CYP2C19*2外,n6amt1 rs2254638、SLC14A2 rs12456693和ABC 1 rs2487032也与氯吡格雷的体内药动学过程显著相关。接着考察候选位点是否对氯吡格雷的活化代谢有潜在影响。收集32名患者正常肝组织,制备肝S9组分。建立氯吡格雷在人肝S9的体外孵育体系,分析在各个体S9中代谢物的生成量。检测候选位点基因分型,分析不同基因型对氯吡格雷代谢的影响。发现CYP2C19*2及n6amt1rs2254638与H4的生成显著相关。结合上述结果发现,n6amt1 rs2254638和ABCA1 rs2487032是PRU的独立影响因素,可极大提高对PRU变异的解释程度至37.7%,而目前文献报道只有约20%;n6amt1 rs2254638和SLC14A2rs12456693是H4血药浓度的独立预测因子。最后,评价候选位点对接受氯吡格雷治疗的冠心病患者MACE事件发生的预测作用,探寻基因多态性是否可作为与终点事件相关的遗传标记。入选患者为前瞻性研究队列,并进行定期随访。将PCI术后1.5年内发生MACE事件的91名患者,作为病例组;另外随机抽取208名患者,作为对照组。检测候选位点分型,运用Logistic回归模型分析,发现n6amt1 rs2254638、SLC14A2 rs12456693和ATP10Ars12913988可增加MACE事件发生的风险。推测位于n6amt1和SLC14A2的位点是通过影响氯毗格雷及H4在体内的药动学过程从而影响其抗血小板效应。综上所述,本研究系统发现了新的影响氯吡格雷疗效的基因变异,极大提高对其反应性差异的解释程度,以及影响其疗效的吸收、代谢机制的理解;有助于氯吡格雷治疗的个体化用药。

关键词：氯吡格雷药动学抗血小板效应全基因组关联性研究 n6amt1

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