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作者：孙文昕陕西科技大学

学位级别：硕士

微藻生长速度快、适应能力强、光合效率高,已经被广泛应用于废水处理领域。在藻际环境中常常伴随着大量的细菌,这些细菌与微藻长期共存且密不可分,藻际细菌可以通过群体感应（quorum sensing,QS）的方式对微藻培养体系产生重要影响。目... 详细信息

微藻生长速度快、适应能力强、光合效率高,已经被广泛应用于废水处理领域。在藻际环境中常常伴随着大量的细菌,这些细菌与微藻长期共存且密不可分,藻际细菌可以通过群体感应（quorum sensing,QS）的方式对微藻培养体系产生重要影响。目前,对于微藻培养体系中QS对微藻生长代谢的影响尚缺乏系统的认识。本研究对小球藻自养培养体系中的藻际细菌进行分离,筛选出既有促藻作用又能分泌n-酰基高丝氨酸内酯（n-acyl homoserine lactones,AHLs）信号分子的细菌,并从生物量积累、胞内生物大分子、抗氧化系统和转录组学等不同层次研究了小球藻对细菌AHLs分泌的响应,同时对微藻生长与细菌AHLs分泌之间的影响关系进行了分析。结果表明:从小球藻自养培养体系中分离出8株微藻共栖细菌,其中农杆菌（A-1）、卟啉杆菌（A-4）、短波单胞菌（A-5）和农杆菌（A-7）属于变形菌门（Proteobacteria）;葡萄球菌（A-2）、魏氏芽孢杆菌（A-3）、解硫胺素芽孢杆菌（A-6）和蜡样芽孢杆菌（A-8）属于厚壁菌门（Firmicutes）。其中对微藻生长具有促进作用的5株细菌分别为A-1、A-3、A-5、A-7和A-8,分别可使小球藻比生长率达到纯藻培养体系的1.53、1.33、1.59、1.71和1.40倍。利用β-半乳糖苷酶法检测促生菌AHLs信号分子活性发现,Agrobacterium（A-1）,Brevundimonas（A-5）和Agrobacterium（A-7）可以分泌AHLs,且信号分子活性达到26～35 Miller units。藻际细菌AHLs分泌对小球藻生长的影响结果表明,Agrobacterium（A-1）,Brevundimonas（A-5）和 Agrobacterium（A-7）三株细菌的 AHLs粗提物和上清液对小球藻比生长率具有相近的促进水平,分别可达到纯藻体系的1.31～1.50倍和1.43～1.60倍;而细菌菌液对小球藻生长的促进作用更强,小球藻比生长率可提高到1.47～1.72倍。与此同时,加入群体感应信号分子抑制剂（邻氨基苯甲酸甲酯）后,藻际细菌对微藻生长的促进作用显著降低。因此,共栖细菌AHLs分泌对微藻生长具有促进作用。藻际细菌AHLs对微藻胞内生物大分子和抗氧化系统的影响结果表明,Agrobacterium（A-1）,Brevundimonas（A-5）和（A-7）三株细菌的AHLs使微藻胞内多糖增加了 28%～56%,蛋白质增加了 24%～33%。Agrobacterium（A-1）,Brevundimonas（A-5）和 Agrobacterium（A-7）三株细菌的AHLs有助于微藻抗氧化系统响应的迅速激活,可使SOD活性和MDA含量分别在8h、8h和24h迅速达到峰值和最低值,SOD活性提高了 1.71～2.03倍,MDA含量降低了 50%～61%。微藻生长与细菌AHLs分泌之间的影响关系结果表明,指数期和平台期的藻培养滤液分别在2h和1.5 h对Agrobacterium（A-1）AHLs信号分子活性具有极显著的抑制作用。添加10 mL指数初期的Agrobacterium（A-1）对小球藻生长具有最显著的促进作用,可达到纯藻培养体系的2.04倍。转录组学分析结果显示,与纯藻培养体系相比,添加Agrobacterium（A-1）AHLs的微藻培养体系共有3066个差异基因,其中上调Unigene 1614个,下调Unigene 1452个;添加Agrobacterium（A-1）上清液的微藻培养体系共有3275个差异基因,上调Unigene 1551个,下调Unigene 1724个;添加C6-HSL的微藻培养体系共有807个差异基因,上调Unigene 480个,下调Unigene 327个。三个比较体系共有的差异基因为340个。GO富集分析结果表明,三个比较体系中部分差异基因均被显著富集在氧化还原过程、有机氮化合物生物合成过程和氧化还原酶活性。KEGG富集分析结果表明,与纯藻培养体系相比,差异表达基因主要富集在添加Agrobacterium（A-1）AHLs体系中的次生代谢产物的生物合成、碳代谢和核糖体等通路,添加Agrobacterium（A-1）上清液体系中的碳代谢通路和添加C6-HSL体系中的碳代谢、DnA复制及过氧物酶体等通路。本文阐明了藻际细菌通过群体感应对微藻生长代谢的影响,将为揭示基于信号分子作用的藻菌互作机制和建立高效藻菌共生体系提供了参考,为进一步探索藻菌共生体系废水处理技术提供重要依据。

关键词：小球藻群体感应 n-酰基高丝氨酸内酯共生系统转录组学

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不同培养条件下大菱鲆温和气单胞菌群体感应AHLs产生规律及影响因素

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中国食品学报 2018年第11期18卷 191-197页

作者：李婷婷崔方超马艳励建荣大连民族大学生命科学学院辽宁大连116600 渤海大学食品科学与工程学院辽宁省食品安全重点实验室辽宁锦州121013

以腐败大菱鲆中分离的温和气单胞菌(AS7)为研究对象,利用(GC-MS)定量研究环境条件(naCl浓度、温度、碳源、p H)以及培养时间对菌株AS7信号分子分泌的影响,结果显示,不同条件下产生的AHLs种类和含量明显不同,在32 h时AHLs分泌总量达到峰... 详细信息

以腐败大菱鲆中分离的温和气单胞菌(AS7)为研究对象,利用(GC-MS)定量研究环境条件(naCl浓度、温度、碳源、p H)以及培养时间对菌株AS7信号分子分泌的影响,结果显示,不同条件下产生的AHLs种类和含量明显不同,在32 h时AHLs分泌总量达到峰值514.4μg/L,其中,C4-HSL和C6-HSL为主要的信号分子;当pH=8时,AHLs分泌总量最大,即582.6μg/L,其主要的信号分子为C8-HSL和C10-HSL;当naCl质量分数0.7%时,AHLs分泌总量达到最大值595.3μg/L,C8-HSL和C10-HSL为主要信号分子;菌株AS7利用碳源分泌AHLs的能力大小排序:蔗糖>麦芽糖>葡萄糖>乳糖>果糖>木糖。当木糖为碳源时,信号分子分泌量达到最低值221.1μg/L;当蔗糖、葡萄糖和麦芽糖为碳源时,信号分子分泌量达到峰值,分别为671.4,623.3μg/L和598.7μg/L;C8-HSL和C10-HSL为优势信号分子;在25℃和28℃,AHLs的分泌量达到峰值,分别为582.6μg/L和585.2μg/L。研究表明,温和气单胞菌AHLs的分泌是受菌体密度和环境因素的双重调控。

关键词：温和气单胞菌 n-酰基高丝氨酸内酯 GC-MS 培养条件

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外源自诱导物对厌氧氨氧化的影响

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中国环境科学 2018年第5期38卷 1727-1733页

作者：张向晖彭永臻贾方旭韩金浩马斌何洋北京工业大学国家工程实验室北京市污水脱氮除磷处理与过程控制工程技术研究中心北京100124

厌氧氨氧化作为污水生物脱氮新工艺,存在着菌群倍增时间长,一旦随水流失,脱氮性能会急剧下降的问题.n-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)作为一类典型的诱发群体感应效应的自诱导物,可能会激活部分基因的表达.有研究表明两种常见的AHLs:C6-HSL和C8... 详细信息

厌氧氨氧化作为污水生物脱氮新工艺,存在着菌群倍增时间长,一旦随水流失,脱氮性能会急剧下降的问题.n-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)作为一类典型的诱发群体感应效应的自诱导物,可能会激活部分基因的表达.有研究表明两种常见的AHLs:C6-HSL和C8-HSL对厌氧氨氧化菌群的成膜机制有促进作用.本试验通过外添加C6-HSL和C8-HSL两种自诱导物,深入探究其对厌氧氨氧化菌群的影响.结果表明浓度为0.5g/L的AHLs会抑制厌氧氨氧化菌群的生长,但能提高其脱氮性能,并显著促进联氨合成酶(hydrazine synthase subunit A,hzs A)基因的表达,但两种AHLs的促进作用有所差别,相同浓度的C8-HSL较C6-HSL对hzs A基因表达的促进作用更为明显.

关键词：厌氧氨氧化群体感应 n-酰基高丝氨酸内酯联氨合成酶

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环境条件对蜂房哈夫尼亚菌群体感应信号分子活性及其形成生物被膜能力的影响

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中国食品学报 2018年第4期18卷 8-15页

作者：李婷婷马艳崔方超杨兵励建荣大连民族大学生命科学学院辽宁大连116600 渤海大学食品科学与工程学院生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州121013

以腐败大菱鲆中分离的蜂房哈夫尼亚菌(Hafniaalvei,Ha-01)为研究对象,采用报告平板打孔法和96微孔板法分别探究环境因素(碳源、naCl浓度、pH及培养温度)对Ha-01的n-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)生成量及生物被膜形成的影响。通过添加外源信... 详细信息

以腐败大菱鲆中分离的蜂房哈夫尼亚菌(Hafniaalvei,Ha-01)为研究对象,采用报告平板打孔法和96微孔板法分别探究环境因素(碳源、naCl浓度、pH及培养温度)对Ha-01的n-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)生成量及生物被膜形成的影响。通过添加外源信号分子标准品研究Ha-01群体感应系统与其生物被膜形成之间的关系。结果表明,碳源对Ha-01分泌AHLs的影响能力由高到低为木糖>葡糖糖>果糖>麦芽糖>乳糖>蔗糖,以木糖为碳源时生物被膜产生量较高;低naCl质量浓度能够促进Ha-01的生长,增强其AHLs分泌能力,当naCl质量浓度为2g/(100mL)时,其生物被膜产生量最高;Ha-01在碱性环境中的AHLs活性较低,pH6.0时AHLs活性较大,pH7时生物被膜产生量较大;Ha-01在低温或高温的胁迫环境下,其AHLs产生量较大,而较低或较高温度均能抑制其生物被膜产生,25℃时其生物被膜产生量最大。当添加外源信号分子标准品时,其生物被膜的产生量均显著增加。蜂房哈夫尼亚菌的AHLs分泌及生物被膜形成均受环境条件的影响,且群体感应现象能够调控其生物被膜的产生。

关键词：蜂房哈夫尼亚菌环境因素 n-酰基高丝氨酸内酯生物被膜

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基于AHLs介导的革兰氏阴性菌群体感应调控及淬灭机制研究进展

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中国食品学报 2020年第8期20卷 308-320页

作者：崔天琦白凤翎励建荣渤海大学食品科学与工程学院生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州121013

革兰氏阴性细菌群体感应(QS)系统主要由n-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)类信号分子介导。信号分子随着细菌密度的增加而逐渐积累,当信号分子浓度达到阈值时,同源受体结合信号分子并触发信号转导,导致细菌生物膜形成、生物发光、质粒接合转移... 详细信息

革兰氏阴性细菌群体感应(QS)系统主要由n-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)类信号分子介导。信号分子随着细菌密度的增加而逐渐积累,当信号分子浓度达到阈值时,同源受体结合信号分子并触发信号转导,导致细菌生物膜形成、生物发光、质粒接合转移和毒力因子等群体感应表型表达。目前革兰氏阴性菌群体感应淬灭作用的研究主要针对QS系统中合成酶(I)、AHLs信号和受体(R)三组分之一进行外部干预,进而实现抑制细菌表型的基因表达。本文首先介绍AHLs的结构、合成方式、QS系统及调控机制,然后,重点综述AHLs介导的群体感应淬灭作用(QQ)和AHLs内酯酶、酰基转移酶和氧化还原酶3类群体感应淬灭酶的来源、种类、信号分子类型及降解机理。本文为控制由AHLs介导的革兰氏阴性菌群体感应机制研究提供参考,也为实现通过群体感应淬灭作用控制革兰氏阴性菌导致的疾病提出一个新的思路。

关键词：革兰氏阴性菌群体感应 n-酰基高丝氨酸内酯调控及淬灭机制

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高效液相色谱-串联质谱法同时测定细菌群体感应效应的11种AHLs类信号分子

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分析化学 2010年第10期38卷 1428-1432页

作者：马晨晨李柏林欧杰王婧赵俊虹上海海洋大学食品学院上海市食品研究所

建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法同时测定细菌群体感应分泌的11种AHLs类信号分子的分析方法。细菌所分泌AHLs类信号分子经乙酸乙酯萃取后简单处理,可直接进样分析。采用Sunfire C18色谱柱(50mm×2.1mm,3.5μm),甲醇与水(含2m... 详细信息

建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法同时测定细菌群体感应分泌的11种AHLs类信号分子的分析方法。细菌所分泌AHLs类信号分子经乙酸乙酯萃取后简单处理,可直接进样分析。采用Sunfire C18色谱柱(50mm×2.1mm,3.5μm),甲醇与水(含2mmoI/L乙酸铵,0.1%甲酸)梯度进样,采用电喷雾离子源正离子模式,多反应监测(MRM)模式,外标法进行质谱定量分析。分析时间为12min。本方法在1～250μg/L范围内呈良好的线性关系(r>0.996);检出限为0.1～1.0μg/kg;定量限为0.3～3.0μg/kg;平均添加回收率为54.4%～128.6%;相对标准偏差为3.5%～13.9%。本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高等优点,适用于多种AHLs类信号分子化合物的同时定性与定量分析,为微生物群体感应的进一步研究提供了有效的且便利的分析方法。

关键词：高效液相色谱-串联质谱细菌群体感应效应类信号分子 n-酰基高丝氨酸内酯

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一株嗜水气单胞菌的分离鉴定和不同条件对其群体感应AHLs活性的影响

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现代食品科技 2016年第2期32卷 12-18页

作者：李婷婷杨兵励建荣大连民族大学生命科学学院辽宁大连116600 渤海大学食品科学与工程学院辽宁省食品安全重点实验室生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州121013

本研究从腐败的大菱鲆中分离得到一株具有群体感应（Quorum Sensing,QS）的细菌,通过生理生化试验、16S r RnA鉴定其为嗜水气单胞菌（Ah-11）,采用报告平板打孔法探究其生长阶段n-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）活性变化以及环境因素对其分泌... 详细信息

本研究从腐败的大菱鲆中分离得到一株具有群体感应（Quorum Sensing,QS）的细菌,通过生理生化试验、16S r RnA鉴定其为嗜水气单胞菌（Ah-11）,采用报告平板打孔法探究其生长阶段n-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）活性变化以及环境因素对其分泌的AHLs活性的影响。结果显示,菌株Ah-11能够诱导报告菌株紫色杆菌CV026和根癌农杆菌A136产生颜色反应;菌株Ah-11在生长阶段的AHLs活性随着培养时间的增加呈现先升高后降低趋势;不同碳源的液体培养基对Ah-11分泌AHLs的影响能力由高到低为麦芽糖〉葡萄糖〉蔗糖〉果糖〉乳糖〉木糖;Ah-11在弱酸或者强碱条件下AHLs活性较低,p H=8.0时AHLs活性最大;较高浓度的氯化钠不仅会抑制Ah-11的生长,同时也抑制其AHLs的分泌,0.5~1.0 g/100 g的氯化钠质量浓度可以增强Ah-11的AHLs活性;菌株Ah-11分泌AHLs的最适温度为28℃,高温和低温都会影响其AHLs的分泌。研究证实细菌的群体密度和外界环境因素能够调控嗜水气单胞菌AHLs的分泌。

关键词：嗜水气单胞菌分离鉴定群体感应 n-酰基高丝氨酸内酯

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环境因素对即食海参蜂房哈夫尼菌群体感应的影响

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现代食品科技 2017年第1期33卷 87-92,105页

作者：孔西曼张公亮王佳莹朱耀磊吴虹燕侯红漫辽宁省水产品加工质量安全与控制重点实验室国家海洋食品工程技术研究中心大连工业大学食品学院辽宁大连116034

本文探究了即食海参腐败菌蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei H4)生长阶段n-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的分泌规律及环境因素对AHLs分泌的影响。以紫色杆菌CV026为报告菌,采用报告菌平板法检测H4分泌AHLs含量;以根癌农杆菌KYC55为报告菌,采用β-... 详细信息

本文探究了即食海参腐败菌蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei H4)生长阶段n-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的分泌规律及环境因素对AHLs分泌的影响。以紫色杆菌CV026为报告菌,采用报告菌平板法检测H4分泌AHLs含量;以根癌农杆菌KYC55为报告菌,采用β-半乳糖苷酶法检测AHLs的活性。研究表明菌株H4分泌的AHLs含量及其活性具有密度依赖性,在细菌对数生长后期(OD600≈1.6)AHLs的分泌量达到最高,此时培养液的pH为5.71。环境因素对AHLs分泌影响的结果显示,在一定浓度范围内,添加na Cl对H4分泌AHLs有促进作用;弱酸和弱碱都能使AHLs的分泌能力降低,pH为7.0时AHLs分泌量最大;H4分泌AHLs的最适温度为30℃,低温下AHLs分泌能力较弱。经不同碳源或氮源培养时,H4分泌AHLs的能力有明显差异,以果糖为碳源时,AHLs的活性最高,以硫酸铵为氮源时,AHLs的活性最高。综上所述,蜂房哈夫尼菌的群体感应系统具有密度依赖性,并且受环境因素影响,呈现规律性变化。

关键词：蜂房哈夫尼菌群体感应 n-酰基高丝氨酸内酯环境因素

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冷却猪肉中产蛋白酶腐败菌的分离鉴定

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食品工业科技 2014年第7期35卷 134-139,143页

作者：赵丽珺谢晶冯淑娇乔丽君上海海洋大学食品学院上海201306

腐败菌的蛋白水解活性在冷却猪肉腐败过程中发挥重要作用,而蛋白酶的表达可能与群体感应(quorum sensing,QS)有关。用脱脂乳平板法从冷却猪肉中分离出54株产蛋白酶腐败菌,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)PELR4检测,有44株产生n... 详细信息

腐败菌的蛋白水解活性在冷却猪肉腐败过程中发挥重要作用,而蛋白酶的表达可能与群体感应(quorum sensing,QS)有关。用脱脂乳平板法从冷却猪肉中分离出54株产蛋白酶腐败菌,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)PELR4检测,有44株产生n-酰基高丝氨酸内酯(n-acyl homoserine lactones,n-AHLs),且均为革兰氏阴性杆菌。选取5株氧化酶阳性和5株氧化酶阴性菌经16S rDnA鉴定,这些腐败菌有假单胞菌(Pseudomonas spp.)和沙雷氏菌(Serratia spp.)。其中两株假单胞菌PP103和PP110经过生理生化鉴定,16S rDnA和carA基因特异片断系统发育分析确定为隆德假单胞菌(Pseudomonas lundensis),为进一步探讨AHLs对腐败菌蛋白酶表达的影响提供了研究基础。

关键词：冷却猪肉蛋白酶 n-酰基高丝氨酸内酯隆德假单胞菌沙雷氏菌 carA

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aiiA基因原核表达载体的构建与表达

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2014年第10期42卷 141-146页

作者：欧阳乐军梁卓玲黄真池沙月娥曾富华湛江师范学院生命科学与技术学院广东湛江524048

【目的】构建aiiA基因的原核表达载体,并进行诱导表达,检测aiiA蛋白的抗病性,为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】从pMDTM19-T Vector+aiiA质粒中酶切获得aiiA基因,将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表... 详细信息

【目的】构建aiiA基因的原核表达载体,并进行诱导表达,检测aiiA蛋白的抗病性,为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】从pMDTM19-T Vector+aiiA质粒中酶切获得aiiA基因,将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA,经双酶切及测序鉴定后,进行诱导表达,并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明,重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA构建成功。表达条件优化结果表明,在25℃下用0.2mmol/L IPTG诱导9h,aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明,其能够降解细菌的AHLs信号分子,猝灭细菌的群体感应,明显减弱病菌的致病力。转aiiA基因尾巨桉抗性检测结果表明,转基因植株抗性明显增强,表现为发病时间延迟,病情指数降低,评价为中等抗病水平。【结论】成功构建了aiiA基因原核表达载体,其诱导表达产物能猝灭细菌的群体感应,明显减弱病菌的致病力。

关键词：群体感应 aiiA基因 n-酰基高丝氨酸内酯 n-酰基高丝氨酸内酯酶

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