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中国科学：生命科学 2011年第10期41卷 1008-1015页

作者：曹赛戴红梅孙旭颛孙丹丹和金周司信喜李树龙方宏清陈惠鹏谢达平周长林军事医学科学院生物工程研究所北京100071 湖南农业大学生物安全科学技术学院长沙410128 中国药科大学生命科学与技术学院南京210009

胸腺肽β4(Tβ4)是n-末端乙酰化的43肽,具有多种重要生物学功能.其生物合成存在两大难点,即乙酰化修饰和小分子肽的表达.本研究发现来自古菌Sulfolobus solfataricus的乙酰化酶ssArd1可以催化Tβ4的n-末端乙酰化修饰.利用Red同源重组技... 详细信息

胸腺肽β4(Tβ4)是n-末端乙酰化的43肽,具有多种重要生物学功能.其生物合成存在两大难点,即乙酰化修饰和小分子肽的表达.本研究发现来自古菌Sulfolobus solfataricus的乙酰化酶ssArd1可以催化Tβ4的n-末端乙酰化修饰.利用Red同源重组技术将ssArd1基因表达盒整合至*** BL21(DE3)染色体的lpxM位点上,构建了可以实现Tβ4n-末端乙酰化修饰的新型宿主*** BDA.将Tβ4编码基因融合在改造的微型Spl DnaX Intein的n端,并在Intein的C端添加His标签,构建了表达载体pET-Tβ4-Intein.在*** BDA中表达的融合蛋白,经镍亲和层析纯化后用β-巯基乙醇诱导融合蛋白切割释放小分子多肽,获得了具有n-末端乙酰化的Tβ4.

关键词：胸腺肽β4 乙酰化酶 n-末端乙酰化 Intein

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B型n-末端乙酰转移酶介导拟南芥YUCCAs乙酰化及功能研究

B型N-末端乙酰转移酶介导拟南芥YUCCAs乙酰化及功能研究

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作者：邹亚杰兰州大学

学位级别：硕士

作为一种普遍存在的不可逆蛋白质修饰,n-末端乙酰化修饰(n-terminal acetylation,nTA)影响目标蛋白的稳态、折叠、定位和功能等,并最终影响生物体正常生长发育、胁迫响应。介导nTA的n-末端乙酰转移酶(n-terminal acetyltransferases,na... 详细信息

作为一种普遍存在的不可逆蛋白质修饰,n-末端乙酰化修饰(n-terminal acetylation,nTA)影响目标蛋白的稳态、折叠、定位和功能等,并最终影响生物体正常生长发育、胁迫响应。介导nTA的n-末端乙酰转移酶(n-terminal acetyltransferases,nats)一般由催化亚基和辅助亚基组成。迄今已发现了8种nats,即nat A～nat H。其中,研究较多、了解较深入是nat A、natB和nat C。人们对nTA的研究主要集中在动物和酵母上,植物中研究较少。据报道,近80%的拟南芥蛋白发生nTA,但尚未有nTA参与生长素生物合成调控的报道。本实验室前期筛选到一株拟南芥突变体ckrc3(Cytokinin induced Root Curling 3),该突变体有典型的生长素缺陷表型,此表型起源于natB辅助亚基基因的功能突变。根据natB特征识别序列,对YUC8作为natB的底物对生长素稳态的影响进行研究。具体结果如下:(1)GUS染色表明natB催化亚基nBC-1与辅助亚基CKRC3有相似和广泛的组织定位,包括子叶、顶端分生组织、下胚轴及根等部位。(2)与野生背景下过表达YUC8表现出典型的高生长素表型不同相比,natB突变导致高生长素表型消失,并且体外实验检测到YUC8可以被natB催化亚基nBC-1催化。(3)natB底物识别特异性依赖于底物蛋白第二位氨基酸,故而我们构建了包含野生YUC8及其n-末端相关序列突变基因YUC8(MA))、YUC8(MW))和YUC8(MP))的过表达载体,导入yuc8背景中发现野生型YUC8的过表达引起拟南芥明显的高生长素表型,而上述YUC8突变体的过表达并未导致高生长素表型,说明n-末端第二位氨基酸在YUC8的nTA修饰中的重要性。(4)我们利用体外乙酰化和HPLC-MS验证了具有natB识别序列的YUC1、YUC2、YUC5、YUC6、YUC9能被natB催化亚基nBC-1催化,然而没有natB识别序列的YUC3未检测到nTA,表明其它具有natB识别序列的YUC也可以是natB的底物。综上所述,natB介导YUCCAs的nTA,以及natB介导的nTA对YUC8起稳定作用,从而调控生长素稳态,揭示了全新的生长素调控机制。

关键词： n-末端乙酰化 B型n-末端乙酰转移酶生长素 YUCCAs

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n-α-乙酰转移酶B(natB)调控植物乙烯合成的机制

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植物生理学报 2022年第11期58卷 2209-2217页

作者：刘海卿郭光沁陇东生物资源保护与利用省重点实验室/陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳745000 兰州大学生命科学学院兰州730030

n-α-乙酰转移酶(nAT)催化的n-末端乙酰化(nTA)是发生在真核生物细胞质中的一种普遍的蛋白质修饰,可影响多种生命活动过程。乙烯是重要的植物生长调节因子,其生物合成和调控对维持其在植物体内的正常水平和稳态至关重要,然而对乙烯稳态... 详细信息

n-α-乙酰转移酶(nAT)催化的n-末端乙酰化(nTA)是发生在真核生物细胞质中的一种普遍的蛋白质修饰,可影响多种生命活动过程。乙烯是重要的植物生长调节因子,其生物合成和调控对维持其在植物体内的正常水平和稳态至关重要,然而对乙烯稳态调控的研究多集中在转录水平,尚未有蛋白n-末端乙酰化参与其生物合成调控的报导。本论文对natB复合体催化亚基和辅助亚基缺失拟南芥突变体nbc-1和ckrc3进行了研究。结果发现,natB缺失表现出顶钩缺陷的表型和不正常的乙烯响应。对蛋白质组学结果分析发现ckrc3、nbc-1和ckrc3 nbc-1突变体中乙烯合成关键酶ACO_(2)/3/4蛋白含量明显降低。激素测定结果表明,natB缺失导致乙烯的合成减少而ACC积累。natB缺陷的表型能够被外源施加乙烯所恢复,而不能被乙烯的直接前体ACC恢复。综上,natB介导的nTA通过影响乙烯合成关键酶的蛋白稳定性从而参与调控其合成,揭示了蛋白修饰对激素稳态维持和生长发育调控的重要作用。

关键词： natB n-末端乙酰化乙烯稳态

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基于2020年版《中华人民共和国药典》相关蛋白检测方法并联合质谱分析人干扰素α2b相关蛋白的一级结构

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药物分析杂志 2022年第6期42卷 1096-1100页

作者：朱秋媚刘玉林俞露王江林梁冠桥孙瑞欣刘琳琳刘景会长春生物制品研究所有限责任公司长春130012

目的:用人干扰素α2b相关蛋白检测方法联合质谱对人干扰素α2b相关蛋白进行一级结构分析,确认不同保留时间的相关蛋白。方法:液相色谱条件为Agilent ZORBAX C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,300?,5μm);流动相A为30%乙腈水溶液(含0.2%三氟... 详细信息

目的:用人干扰素α2b相关蛋白检测方法联合质谱对人干扰素α2b相关蛋白进行一级结构分析,确认不同保留时间的相关蛋白。方法:液相色谱条件为Agilent ZORBAX C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,300?,5μm);流动相A为30%乙腈水溶液(含0.2%三氟乙酸),流动相B为80%乙腈水溶液(含0.2%三氟乙酸),流速为0.5 mL·min^(-1),柱温为室温。质谱条件为电喷雾正离子模式,采用MS模式进行扫描,毛细管电压为2500 V,Cone电压为40 V,去溶剂气体温度为350℃,源温为120℃,去溶剂气体流速为800 L·h^(-1),扫描范围为m/z 400~4000,碰撞电压为40 V,MS采集时间为20~60 min。结果:相关蛋白的相对分子质量均与理论相对分子质量一致,3号峰为主峰,相对分子质量为19264.81和19395.93,为人干扰素α2b和n-末端甲硫氨酸化人干扰素α2b;1号峰相对分子质量为19280.72,为氧化人干扰素α2b,2号峰相对分子质量为19412.25,为(氧化+n-末端甲硫氨酸化)人干扰素α2b;4号峰相对分子质量为19265.13,为人干扰素α2b;5号峰相对分子质量为19322.81,为(氧化+n-末端乙酰化)人干扰素α2b;6号峰相对分子质量为19306.79,为n-末端乙酰化人干扰素α2b。结论:确认主峰为人干扰素α2b和n-末端甲硫氨酸化的人干扰素α2b,确认保留时间在主峰前面的相关蛋白分别为氧化和(氧化+n-末端甲硫氨酸化)修饰的人干扰素α2b,保留时间在主峰后面的相关蛋白分别为(氧化+n-末端乙酰化)和n-末端乙酰化修饰的人干扰素α2b。

关键词：人干扰素α2b 相关蛋白一级结构 n-末端甲硫氨酸化氧化 n-末端乙酰化

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胸腺肽β4（Tβ4）的生物合成及其相关研究

胸腺肽β4（Tβ4）的生物合成及其相关研究

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作者：曹赛湖南农业大学

学位级别：硕士

胸腺肽β4（Tβ4）是β胸腺肽家族的一员,由43个氨基酸残基组成,n-末端Ser残基位点被乙酰化修饰,具有多重生物学功能,在组织再生、重塑、创伤愈合、维持肌动蛋白平衡、肿瘤发病与转移、细胞凋亡、炎症、血管生成、毛囊发育等生理、病理... 详细信息

胸腺肽β4（Tβ4）是β胸腺肽家族的一员,由43个氨基酸残基组成,n-末端Ser残基位点被乙酰化修饰,具有多重生物学功能,在组织再生、重塑、创伤愈合、维持肌动蛋白平衡、肿瘤发病与转移、细胞凋亡、炎症、血管生成、毛囊发育等生理、病理过程中扮演着极为重要的角色。美国雷根内克斯公司化学合成出Tβ4对其作为治疗用药的研究已经进入Ⅱ期临床阶段。由于生物提取和化学合成的局限性,人们尝试生物制备Tβ4,但生物合成存在两大难点,乙酰化修饰和小分子多肽的表达,因此未能获得与天然结构一致的Tβ4。本研究中,将其编码基因融合在一种分子量极小的Spl DnaX Intein（136个氨基酸残基,来源于Spirulina platensis）的n端,同时在Intein的C端添加His标签,构建融合表达载体pET-Tβ4-Intein,将其与乙酰化酶表达载体pACYC-nat共转至BL21（DE3）中,得到n-末端乙酰化修饰的Tβ4-intein融合蛋白。由于该Intein的C末端残基Asn突变为残基Ala,阻断了剪接反应,在体外用巯基乙醇诱导融合蛋白发生n端切割,获得具有n-末端乙酰化修饰的Tβ4。目的蛋白经过疏水,反相和阴离子交换层析进一步纯化,经过RP-HPLC分析,最后用Q-TOFMS和Q-TOF MS/MS质谱鉴定其精确分子量和乙酰化修饰位点,最终获得了与天然结构一致的Tβ4。同时利用该方法制备了Tβ4的三个突变体。此方法重复性高,得率较好,平均每升培养液中能获得纯度超过96.7%的目的蛋白61.79mg,具有应用前景。在体外Tβ4及其三个突变体均可与肌动蛋白结合。本工作为进一步研究Tβ4的功能和应用奠定了基础。

关键词：胸腺肽β4 n-末端乙酰化 Intein 肌动蛋白结合活性

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