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自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响

眼科新进展 2022年第3期42卷 179-183页

作者：陈莉张晶晶陈云珍黄旅珍首都医科大学附属北京朝阳医院眼科北京市100020 首都医科大学大兴教学医院眼科北京市102600 北京大学人民医院北京市100044

目的探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响。方法取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组。对照组:仅使用正常DMEM-F12完... 详细信息

目的探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响。方法取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组。对照组:仅使用正常DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:将ARPE-19细胞置于含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基中孵育12 h;3-MA组:使用含10 mmol·L^(-1)3-MA(美国Sigma-Aldrich公司)的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用正常DMEM-F12完全培养基孵育细胞12 h;3-MA联合A2E组:先使用10 mmol·L^(-1)3-MA预处理细胞1 h,再将细胞放入含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育12 h。使用CCK\|8法检测各组ARPE-19细胞增殖情况,透射电镜观察各组ARPE-19细胞超微结构,Western blot法检测各组ARPE-19细胞Beclin-1和P62自噬相关蛋白表达,免疫荧光染色法检测各组ARPE-19细胞自噬标志物LC3蛋白的表达,使用Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液10种细胞因子表达情况,10种细胞因子包括:细胞间黏附分子、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL^(-1)0、血管生成素2、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子和VEGFA。结果与A2E组相比,3-MA联合A2E组细胞生存率下降了27.16%(Pn-l蛋白相对表达量显著升高(Pn-l蛋白相对表达量显著降低(P黄斑变性的发生和发展中具有重要的调节作用。

关键词： n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺 3-甲基腺嘌呤视网膜色素上皮细胞自噬年龄相关性黄斑变性

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自噬激活剂雷帕霉素对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬调节的影响

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眼科新进展 2022年第12期42卷 942-946页

作者：陈云珍张晶晶首都医科大学大兴教学医院眼科北京市102600

目的探讨自噬激活剂雷帕霉素对n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬调节的影响。方法取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组:使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:使用... 详细信息

目的探讨自噬激活剂雷帕霉素对n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬调节的影响。方法取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组:使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:使用含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素组:使用含100 nmol·L^(-1)雷帕霉素的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素联合A2E组:使用100 nmol·L^(-1)雷帕霉素预处理细胞1 h后,再用含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞。使用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞因子表达情况。透射电镜观察各组细胞超微结构,Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达,免疫荧光染色法检测各组细胞自噬标志物LC3蛋白的表达。结果与对照组相比,A2E组细胞生存率显著下降(Pn-1蛋白相对表达量显著升高(Pn-1蛋白相对表达量明显升高(P<0.01),而P62蛋白相对表达量明显降低(P<0.001)。雷帕霉素联合A2E组ARPE-19细胞内LC3蛋白的绿色荧光斑点大量聚集,与A2E组相比荧光强度增加,斑点体积更大,数量也更多。结论雷帕霉素能够进一步激活A2E诱导的ARPE-19细胞自噬活性,一定程度上降低了A2E对RPE细胞造成的损伤,并抑制了ARPE-19细胞中炎症因子和血管生成因子的分泌。

关键词： n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺雷帕霉素视网膜色素上皮细胞自噬年龄相关性黄斑变性

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脂褐素与年龄相关性黄斑变性

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国际眼科杂志 2019年第8期19卷 1326-1329页

作者：罗茂梅蔡善君遵义医科大学

年龄相关性黄斑变性(ARMD)是引起中老年人视力丧失的首要原因,其确切病因尚未明了,故治疗效果不佳。脂褐素随着年龄增长在视网膜色素上皮的积累是眼睛老化的标志,通过光化学作用等影响正常视网膜色素上皮细胞的功能,与ARMD的发生发展有... 详细信息

年龄相关性黄斑变性(ARMD)是引起中老年人视力丧失的首要原因,其确切病因尚未明了,故治疗效果不佳。脂褐素随着年龄增长在视网膜色素上皮的积累是眼睛老化的标志,通过光化学作用等影响正常视网膜色素上皮细胞的功能,与ARMD的发生发展有一定联系。本文就脂褐素及其与ARMD的关系进行综述。

关键词：脂褐素 n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺年龄相关性黄斑变性视网膜色素上皮氧化应激

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蓝光照射人RPE细胞过程中A2E的分布规律及其对胞浆内ROS浓度的影响

蓝光照射人RPE细胞过程中A2E的分布规律及其对胞浆内ROS浓度的影响

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作者：曾纯遵义医学院

学位级别：硕士

目的:通过建立蓝光诱导负载A2E的RPE细胞损伤模型,探索A2E及ROS在蓝光致人RPE细胞损伤过程中的分布规律,为后续实验提供基础。方法:将在培养瓶中培养的第4-6代人RPE细胞消化,制成细胞悬液并随机分为5组,A组:对照组;B组:蓝光光照组;C组:... 详细信息

目的:通过建立蓝光诱导负载A2E的RPE细胞损伤模型,探索A2E及ROS在蓝光致人RPE细胞损伤过程中的分布规律,为后续实验提供基础。方法:将在培养瓶中培养的第4-6代人RPE细胞消化,制成细胞悬液并随机分为5组,A组:对照组;B组:蓝光光照组;C组:A2E负载组;D组:A2E负载+蓝光光照组;E组:A2E负载+蓝光光照+硝苯地平组;(1)用DCFH-DA探针标记人RPE细胞,用流式细胞法检测各组细胞胞浆内ROS浓度。(2)用流式细胞法检测各组细胞胞浆内A2E荧光强度。(3)用Lyso Tracker Red标记人RPE细胞溶酶体,流式细胞法测定各组细胞溶酶体内A2E荧光强度、激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内荧光情况。结果:(1)流式细胞法检测各组人RPE细胞胞浆内ROS浓度:对照组(8438.70±148.06)、蓝光光照组(22803.90±3301.88)、A2E负载组(14139.33±2092.67)、A2E负载+蓝光组(37991.23±1950.92)、A2E负载+蓝光+硝苯地平组(32434.73±2512.59),此差异具有统计学意义(F=89.123,P=0.000)。与对照组相比,高蓝光光照组、A2E负载组、A2E负载+蓝光组、A2E负载+蓝光+硝苯地平组胞浆内ROS浓度均高,差异有统计学意义(P=0.000,0.011,0.000,0.000);蓝光光照组、A2E负载+蓝光组、A2E负载+蓝光+硝苯地平组胞浆内ROS浓度均高于A2E负载组,差异有统计学意义(P=0.001,0.000,0.000);A2E负载+蓝光组、A2E负载+蓝光+硝苯地平组胞浆内ROS浓度均高于单纯给蓝光光照组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000);A2E负载+蓝光组胞浆内ROS浓度高于A2E负载+蓝光+硝苯地平组,差异有统计学意义(P=0.013)。(2)流式细胞法检测各组人RPE细胞胞浆内A2E荧光强度:对照组(1595.17±23.91)、蓝光光照组(3676.37±93.90)、A2E负载组(1880.07±27.31)、A2E负载+蓝光组(4232.87±35.52)、A2E负载+蓝光+硝苯地平组(3979.40±17.17),此差异具有统计学意义(F=1968.88,P=0.000)。与对照组相比,高蓝光光照组、A2E负载组、A2E负载+蓝光组、A2E负载+蓝光+硝苯地平组胞浆内A2E荧光强度均高,差异有统计学意义(P=0.000,0.000,0.000,0.000);蓝光光照组、A2E负载+蓝光组、A2E负载+蓝光+硝苯地平组胞浆内A2E荧光强度均高于A2E负载组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000,0.000);A2E负载+蓝光组、A2E负载+蓝光+硝苯地平组胞浆内A2E荧光强度均高于蓝光光照组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000);A2E负载+蓝光组胞浆内A2E荧光强度高于A2E负载+蓝光+硝苯地平组,差异有统计学意义(P=0.000)。(3)流式细胞法检测各组人RPE细胞溶酶体内A2E荧光强度:对照组(1800.80±80.39)、蓝光光照组(2117.40±26.34)、A2E负载组(12129.00±38.86)、A2E负载+蓝光组(3635.33±0.67)、A2E负载+蓝光+硝苯地平组(3516.83±8.61),此差异具有统计学意义(F=31210.829,P=0.000)。与对照组相比,高蓝光光照组、A2E负载组、A2E负载+蓝光组、A2E负载+蓝光+硝苯地平组溶酶体内A2E荧光强度均高,差异有统计学意义(P=0.000,0.000,0.000,0.000);A2E负载组、A2E负载+蓝光组、A2E负载+蓝光+硝苯地平组溶酶体内A2E荧光强度均高于蓝光光照组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000,0.000);A2E负载组、A2E负载+蓝光组溶酶体内A2E荧光强度均高于A2E负载+蓝光+硝苯地平组,差异有统计学意义(P=0.000,0.006);A2E负载组溶酶体内A2E荧光强度高于A2E负载+蓝光组,差异有统计学意义(P=0.000)。(4)激光扫描共聚焦显微镜观察A2E负载于RPE细胞后溶酶体内荧光显示:A2E产生的绿色荧光与溶酶体标记红色荧光大部分重合,可以初步说明产生的A2E大部分聚集在溶酶体内。结论:(1)蓝光光照、A2E负载可致人RPE细胞胞浆内ROS增加,且两者具有协同作用。(2)A2E和(或)蓝光照射可损伤溶酶体膜,使溶酶体膜通透性增加、破裂,从而使A2E可从溶酶体释放入胞浆。

关键词： n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺年龄相关性黄斑变性凋亡溶酶体

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A2E在蓝光致人RPE细胞损伤过程中对溶酶体膜通透性的影响

A2E在蓝光致人RPE细胞损伤过程中对溶酶体膜通透性的影响

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作者：李丹遵义医学院

学位级别：硕士

目的:本课题拟通过建立A2E及蓝光诱导RPE细胞损伤模型,探讨A2E在蓝光致人RPE细胞损伤过程中对溶酶体膜通透性的影响,为后续实验提供基础。方法:(1)采用MTT法检测不同浓度A2E负载RPE细胞培养不同时间后RPE细胞活力,确立A2E负载RPE细胞的... 详细信息

目的:本课题拟通过建立A2E及蓝光诱导RPE细胞损伤模型,探讨A2E在蓝光致人RPE细胞损伤过程中对溶酶体膜通透性的影响,为后续实验提供基础。方法:(1)采用MTT法检测不同浓度A2E负载RPE细胞培养不同时间后RPE细胞活力,确立A2E负载RPE细胞的最适宜浓度;(2)利用荧光显微镜观察RPE细胞分别负载浓度为0、10、25、50μM A2E后RPE细胞中荧光强度变化;(3)将细胞分为四组:对照组、单纯蓝光光照组、A2E负载组、A2E负载+蓝光光照组。TUnEL法、流式细胞仪检测RPE细胞凋亡情况;(4)吖啶橙(AO)标记,运用激光扫描共聚焦显微镜观察A2E负载后RPE细胞内溶酶体膜通透性变化并利用共聚焦软件对荧光强度进行分析。结果:(1)MTT比色法显示,A2E(10μM、25μM、50μM)作用于RPE细胞12h、24h、48h、72h,细胞增殖率随浓度增加出现下降趋势。当A2E负载浓度为10μM时,细胞培养12h、24h、48h、72h时,与对照组比较,差异均无统计学意义(P=0.821,0.641,0.406,0.572);当A2E负载浓度为25μM、50μM时,在细胞培养12h时,与对照组比较,差异无统计学意义(P=0.169,0.058);当A2E负载浓度为25μM、50μM时,在24h时,OD值分别为(0.423±0.035)、(0.349±0.010),低于对照组(0.508±0.035),差异均有统计学意义(P=0.000,0.000);当A2E负载浓度为25μM、50μM时,在48h时,OD值分别为(0.544±0.042)、(0.439±0.086),低于对照组(0.688±0.064),差异有统计学意义(P=0.028,0.002);当A2E负载浓度为25μM、50μM时,在72h时,OD值分别为(0.661±0.021)、(0.430±0.082),低于对照组(0.878±0.032),差异均有统计学意义(P=0.000,0.000)。因此,我们选择浓度为25μM的A2E负载于RPE细胞进行后续实验研究。(2)不同浓度A2E负载RPE细胞后,荧光显微镜观察发现随着A2E的负载浓度增加,RPE细胞胞浆内荧光强度逐渐由绿色变为黄色。(3)流式细胞仪检测:对照组RPE细胞凋亡率(3.39±0.15%)、A2E负载组凋亡率(4.61±1.44%)、单纯蓝光光照组(8.21±0.52%)、蓝光+A2E负载组(24.77±1.49%)。各组间比较,差异有统计学意义(F=130.292,P=0.000)。光照组、A2E负载+蓝光光照组凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P=0.004,0.000);A2E负载组与对照组比较,差异无统计学意义(P=0.348);A2E负载+光照组较光照组及A2E负载组凋亡率高,差异有统计学意义(P=0.000,0.000);光照组较A2E负载组凋亡率高,差异有统计学意义(P=0.019)。(4)TUnEL法检测各组细胞凋亡情况:对照组(10.40±2.46%)、A2E负载组(24.07±1.17%)、单纯蓝光光照组(43.00±4.41%)、A2E负载+光照组(53.00±4.50%)。各组间比较,差异有统计学意义(F=92.423,P=0.000)。A2E负载组、光照组、A2E负载+蓝光光照组凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P=0.001,0.000,0.000);A2E负载+光照组较光照组及A2E负载组凋亡率高,差异有统计学意义(P=0.007,0.000);光照组较A2E负载组凋亡率高,差异有统计学意义(P=0.000)。(5)光照组、A2E负载组、A2E负载+光照组与对照组比较红色颗粒状荧光均减弱,胞浆的绿色荧光增强。利用Leica Confocal Software(LCS Lite)进行荧光强度分析,4组平均荧光强度(红色)分别为:对照组(37.00±1.30)、光照组(29.48±0.62)、A2E负载组(32.37±0.72)、A2E负载+光照组(22.16±0.73)。各组间整体平均荧光强度比较,差异有统计学意义(F=246.955,P=0.000)。光照组、A2E负载组及A2E负载+光照组均低于对照组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000,0.000);光照组低于A2E负载组,差异有统计学意义(P=0.000);A2E负载+光照组低于光照组、A2E负载组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000)。结论:(1)A2E负载RPE细胞的最适宜浓度为25μM。(2)蓝光光照、A2E联合蓝光光照可导致RPE细胞凋亡,且两者具有协同作用。(3)A2E、蓝光光照、A2E联合蓝光光照可导致RPE细胞内溶酶体膜通透性增加。

关键词： n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺年龄相关性黄斑变性视网膜色素上皮凋亡溶酶体

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A2E与蓝光照射对人RPE细胞溶酶体及线粒体摄取、释放Ca2+的影响

A2E与蓝光照射对人RPE细胞溶酶体及线粒体摄取、释放Ca2+的影响

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作者：罗茂梅遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:通过建立蓝光照射负载A2E的人RPE细胞光损伤模型,探索在此过程中A2E与蓝光对人RPE细胞内溶酶体及线粒体摄取、释放Ca2+的影响。方法:原代培养人RPE细胞,将传代至第四至第六代的细胞用于实验。同一个体的同一代细胞用于相同的检测指... 详细信息

目的:通过建立蓝光照射负载A2E的人RPE细胞光损伤模型,探索在此过程中A2E与蓝光对人RPE细胞内溶酶体及线粒体摄取、释放Ca2+的影响。方法:原代培养人RPE细胞,将传代至第四至第六代的细胞用于实验。同一个体的同一代细胞用于相同的检测指标,将细胞随机分为五组:对照组、蓝光光照组、蓝光光照+硝苯地平组、负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组;蓝光光照强度(2000±500)Lux,时间6小时,光照结束后继续培养24小时;光照前2小时加入终浓度为25 μM的A2E;光照前1小时加入终浓度为10-4M的硝苯地平。(1)使用CaTM-2AM结合胞浆内的钙离子,激光扫描共聚焦显微镜观察每组RPE细胞的荧光变化并拍照,并通过软件分析荧光强度(2)使用Rhod-2 AM结合线粒体内的钙离子,激光扫描共聚焦显微镜观察各组线粒体钙离子荧光情况并拍照,分析荧光强度(3)使用LysoTracker Red DnD-99标记人RPE细胞酸性溶酶体,Fluo-3 AM结合细胞内的钙离子,激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照,二者共定位后分析溶酶体内钙离子荧光强度(4)将细胞分为四组:对照组、蓝光光照组、负载A2E组、负载A2E+蓝光光照组,用JC-1法检测线粒体膜电位变化情况。结果:(1)激光扫描共聚焦显微镜检测各组人RPE细胞胞浆内的钙离子荧光强度发现:蓝光光照组、蓝光光照+硝苯地平组、负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组内钙离子荧光强度均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);蓝光光照+硝苯地平组内荧光强度低于蓝光光照组(P<0.05),负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组高于蓝光光照组(P<0.05);负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组高于蓝光光照+硝苯地平组,差异均有统计学意义(P<0.05);负载A2E+蓝光光照组荧光强度高于负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组(P<0.05)。(2)激光扫描共聚焦显微镜检测各组人RPE细胞线粒体内的钙离子荧光强度发现:蓝光光照组、蓝光光照+硝苯地平组内钙离子荧光强度高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05),负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组均低于对照组(P<0.05);蓝光光照+硝苯地平组、负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组内荧光强度均低于蓝光光照组(P<0.05);负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组均低于蓝光光照+硝苯地平组(P<0.05);负载A2E+蓝光光照组荧光强度低于负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组(P<0.05)。(3)激光扫描共聚焦显微镜检测各组人RPE细胞溶酶体内的钙离子荧光强度发现:蓝光光照组、蓝光光照+硝苯地平组内钙离子荧光强度高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05),负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组均低于对照组(P<0.05);蓝光光照+硝苯地平组、负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组内荧光强度均低于蓝光光照组(P<0.05);负载A2E+蓝光光照组、负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组均低于蓝光光照+硝苯地平组(P<0.05);负载A2E+蓝光光照组荧光强度低于负载A2E+蓝光光照+硝苯地平组(P<0.05)。(4)流式细胞法检测各组人RPE细胞线粒体膜电位水平,膜电位去极化程度越大,对应线粒体膜电位水平越低,因此发现对照组膜电位水平高于蓝光光照组、负载A2E组及负载A2E+蓝光光照组,差异均具有统计学意义(P<0.05);负载A2E组内线粒体膜电位水平高于蓝光光照组(P<0.05),蓝光光照组、负载A2E组均高于负载A2E+蓝光光照组(P<0.05)。结论:(1)蓝光光照可导致RPE细胞胞浆、溶酶体及线粒体内Ca2+浓度升高,不影响溶酶体及线粒体摄取Ca2+功能。(2)A2E通过损伤溶酶体及线粒体膜致二者释放Ca2+进入胞浆。(3)蓝光光照、A2E负载均可使线粒体膜电位降低,且二者具有协同作用。

关键词： n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺钙离子溶酶体线粒体视网膜色素上皮细胞

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