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n端截短CBM41对枯草芽孢杆菌来源普鲁兰酶酶学性质的影响

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生物技术通报 2022年第6期38卷 245-251页

作者：付巧林啟兰薛强熊海容王亚伟中南民族大学生命科学学院武汉430074 武汉轻工大学生命科学与技术学院武汉430048

采用n端截短方式对Bacillus subtilis 168来源普鲁兰酶进行蛋白结构改造,构建不同形式的截短突变体,考察n端结构对酶学特性的影响。利用基因工程的手段分别删去CBM41结构域n端前2、4和6个氨基酸,获得突变体M1(Δn2)、M2(Δn4)和M3(Δn6)... 详细信息

采用n端截短方式对Bacillus subtilis 168来源普鲁兰酶进行蛋白结构改造,构建不同形式的截短突变体,考察n端结构对酶学特性的影响。利用基因工程的手段分别删去CBM41结构域n端前2、4和6个氨基酸,获得突变体M1(Δn2)、M2(Δn4)和M3(Δn6)。3种突变体最适反应温度(40-45℃)和最适pH(6.0)均与WT一致,WT、M1、M2和M3的T_(m)值分别为48.57℃、50.03℃、48.43℃和49.50℃,M1、M2和M3的比活力均高于野生型,是WT的1.18、1.60和2.44倍,WT、M1、M2和M3的K_(m)值分别为23.89、29.01、17.29和19.08 mg/mL。上述结果表明,通过截短普鲁兰酶n端氨基酸可获得性质得到改良的突变体,为提高该酶的热稳定性、比活力和底物结合能力提供新的方法和思路。

关键词： n端截短普鲁兰酶 Bacillus subtilis168 酶学特性

磷脂酶A1辅助蛋白n端截短菌株的构建及其优化表达

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食品与发酵工业 2018年第5期44卷 34-38,45页

作者：朱昊薛正莲王洲陈阿娜杨蒙安徽工程大学生物与化学工程学院安徽芜湖241000 微生物发酵安徽省工程研究中心安徽芜湖241000

根据GenBank公布的磷脂酶A1辅助蛋白plaS基因序列,通过生物信息学软件分析,截短辅助蛋白PlaS的n端35AA。将截短后的辅助蛋白plaS基因经PCR扩增技术与原核表达载体pET-28a(+)连接,再转化到BL21(DE3)宿主菌中进行融合表达,从而成功构建dS... 详细信息

根据GenBank公布的磷脂酶A1辅助蛋白plaS基因序列,通过生物信息学软件分析,截短辅助蛋白PlaS的n端35AA。将截短后的辅助蛋白plaS基因经PCR扩增技术与原核表达载体pET-28a(+)连接,再转化到BL21(DE3)宿主菌中进行融合表达,从而成功构建dSP28表达菌株。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导辅助蛋白表达,对诱导时间、IPTG浓度、起始菌体浓度(OD_(600nm))和温度逐项进行优化,摸索得到辅助蛋白的最佳诱导表达条件为诱导时间8 h,IPTG浓度0.2 mmol/L,起始体浓度(OD_(600nm))0.7,温度40℃,转速200 r/min。在此条件下,对P28、SP28和dSP28发酵中OD_(600nm)进行测定,结果表明,加入IPTG诱导后P28和dSP28能够快速的增殖,且诱导8 h后仍显示增长趋势,而SP28的生长受到明显的抑制作用。

关键词：磷脂酶A1辅助蛋白PlaS n端截短原核表达表达条件优化

n端截短的视网膜母细胞瘤基因对人骨肉瘤细胞株SaOS-2生长的影响

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中国骨肿瘤骨病 2004年第2期3卷 95-99页

作者：李扬乔慧邓家德张萌朱全胜丘钜世中山大学中山医学院病理教研室广州510089 广州市第一人民医院检验科

目的研究n端截短的视网膜母细胞瘤基因(Rb^(66))对骨肉瘤细胞Saos-2生长的影响。方法构建携带Rb^(66)cDnA片段的真核细胞表达载体pcDnA3-1-Rb,用脂质体LIPOFECTAMIME^(TM)2000将真核表达载体pcDnA3-1-Rb、空载体对照pcDnA3-1转染至SaO... 详细信息

目的研究n端截短的视网膜母细胞瘤基因(Rb^(66))对骨肉瘤细胞Saos-2生长的影响。方法构建携带Rb^(66)cDnA片段的真核细胞表达载体pcDnA3-1-Rb,用脂质体LIPOFECTAMIME^(TM)2000将真核表达载体pcDnA3-1-Rb、空载体对照pcDnA3-1转染至SaOS-2细胞中。RT-PCR及免疫细胞化学检测转染后SaOS-2中Rb^(66)mRnA及蛋白的表达;观察细胞形态的改变;测定细胞倍增时间及生长曲线的改变;流式细胞仪检测对细胞周期的影响。结果成功地将n端截短的Rb^(66)cDnA导入骨肉瘤细胞SaOS-2中,并在mRnA及蛋白水平获得了表达。转染后的SaOS-2细胞胞浆展开,细胞核浆比例变小;Rb^(66)导入后,SaOS-2细胞生长减慢,群体倍增时间延长,细胞周期呈现G_1期阻滞。结论 Rb^(66)可通过阻止细胞G_1→S期进展而抑制骨肉瘤细胞SaOS-2的增殖。

关键词： n端截短视网膜母细胞瘤基因骨肉瘤细胞株 SaOS-2生长细胞周期瘤细胞

(S)-β-没药烯合酶n端截短对其功能的影响

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北京农学院学报 2020年第1期35卷 1-5页

作者：杨倩穆星刘会云向英李振秋河北大学生命科学学院

【目的】探究(S)-β-没药烯合酶n端截短对其功能的影响。【方法】在截短处设计引物,引物引入限制性内切酶酶切位点,PCR产物经双酶切,连接到相应载体,经大肠杆菌Rosetta菌株表达,亲和层析纯化蛋白后蛋白酶切去融合标签,高分辨质谱测定蛋... 详细信息

【目的】探究(S)-β-没药烯合酶n端截短对其功能的影响。【方法】在截短处设计引物,引物引入限制性内切酶酶切位点,PCR产物经双酶切,连接到相应载体,经大肠杆菌Rosetta菌株表达,亲和层析纯化蛋白后蛋白酶切去融合标签,高分辨质谱测定蛋白分子量。体外催化产物经GC-FID/MS分析产物变化,Malachite Green无机磷酸含量法测定表观Kcat。【结果】截短10、20、30、40个氨基酸融合蛋白表达及纯化成功,GCFID分析结果表明去标签的不同长度截短的酶催化主产物均为没药烯,显示活性没有丧失;随着n端截短氨基酸数目的增多,表观Kcat稍有变化。截短60个氨基酸的融合蛋白His-n60表达成功,但亲和层析失败,取表达的上清蛋白体外催化,结果显示无倍半萜合酶活性。【结论】n端截短40个氨基酸不影响其产物特异性和活性。此结果和其他报道不一致,显示不同的倍半萜合酶n端的作用可能不同。

关键词：没药烯合酶 n端截短产物特异性

黏质沙雷菌磷脂酶A1辅助蛋白S对表达宿主菌大肠杆菌抑制作用机制

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食品科学 2021年第7期42卷 45-51页

作者：甘玉飞薛正莲周杰王芳王洲刘艳安徽工程大学生物与食品工程学院安徽芜湖241000 安徽省工业微生物分子育种工程实验室安徽芜湖241000 微生物发酵安徽省工程技术研究中心安徽芜湖241000

黏质沙雷菌plaS基因编码的磷脂酶A1辅助蛋白S(phospholipase A1 accessory protein S,PlaS)能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的表达活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道。本实验通过对PlaS进行生物信息学分... 详细信息

黏质沙雷菌plaS基因编码的磷脂酶A1辅助蛋白S(phospholipase A1 accessory protein S,PlaS)能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的表达活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道。本实验通过对PlaS进行生物信息学分析并对其n端截短系列表达菌株的生长特性进行研究以确定其抑制作用关键区域,并通过扫描电子显微镜观察和流式细胞仪检测来初步探究PlaS对表达宿主菌的抑制机理。结果表明,在PlaS n端分别截短前23、24、25、26、27个氨基酸构建的表达菌株中,dS_(23)P_(28)、dS_(24)P_(28)、dS_(25)P_(28)、dS_(26)P_(28)菌株仍表现出不同程度的生长抑制现象,而dS_(27)P_(28)菌株没有出现生长抑制现象,初步表明PlaS n端的前27个氨基酸为抑制关键区域。扫描电子显微镜和流式细胞仪结果显示,PlaS的表达对大肠杆菌的细胞膜有严重的破坏作用,而n端截短前27个氨基酸的PlaS表达后对大肠杆菌细胞膜的损伤作用消失,这一结果也与生长特性结果一致。本实验结果可为深入研究黏质沙雷菌PlaS功能提供理论参考。

关键词：黏质沙雷菌磷脂酶A1辅助蛋白大肠杆菌生长抑制 n端截短

粘质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白可溶性表达及其与磷脂酶A1相互作用研究

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粘质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白可溶性表达及其与磷脂酶A1相互作用...

作者：朱昊安徽工程大学

学位级别：硕士

磷脂酶A1辅助蛋白PlaS是一段在编码基因plaA的下游序列,它与磷脂酶A1在大肠杆菌中的高活性表达密切相关。为研究辅助蛋白PlaS的性质及其对磷脂酶A1的酶活调控机制,构建SP28重组质粒。实验表明,重组质粒中辅助蛋白PlaS的表达量极低,不能... 详细信息

磷脂酶A1辅助蛋白PlaS是一段在编码基因plaA的下游序列,它与磷脂酶A1在大肠杆菌中的高活性表达密切相关。为研究辅助蛋白PlaS的性质及其对磷脂酶A1的酶活调控机制,构建SP28重组质粒。实验表明,重组质粒中辅助蛋白PlaS的表达量极低,不能被SDS-PAGE检测到,仅通过Western Blot技术,才检测到其极微量的表达。本论文通过对辅助蛋白PlaS的蛋白结构进行生物信息学分析,并以此确定利用PCR技术对辅助蛋白PlaS的n端35个氨基酸进行截短处理,成功构建重组质粒dSP28。对构建的重组质粒dSP28进行诱导表达,结合发酵培养基优化,获得了大量的可溶性目的蛋白。最后,通过酵母双杂交技术,共表达菌株dBP28的构建,以及Biacore蛋白互作实验,对辅助蛋白PlaS与磷脂酶A1的体内和体外相互作用特性进行研究。主要研究内容和结果如下:(1)磷脂酶A1辅助蛋白PlaS表达系统的构建利用生物信息学手段,对plaS基因序列进行分析,为促进磷脂酶A1辅助蛋白胞内可溶性表达,将辅助蛋白PlaS的n端截短了35AA。辅助蛋白截短后的dplaS基因插入载体p ET-28a(+)中,再将测序验证正确的重组质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中进行表达,从而成功构建重组表达菌株dSP28。(2)磷脂酶A1辅助蛋白发酵培养基优化及蛋白分离纯化将构建成功的dSP28菌株进行发酵培养,为使目的蛋白在细胞内大量可溶性表达,比较不同组分的发酵培养基对目的蛋白可溶表达的影响,筛选出最适发酵培养基为TB加3%甘油的发酵培养基。利用该发酵培养基对dPlaS诱导表达,并用AKTA系统对目的蛋白进行纯化,得到纯化后的目的蛋白浓度为33.78μg/mL。(3)PlaA与辅助蛋白PlaS和dPlaS体内相互作用研究采用酵母双杂交技术,通过分子克隆成功构建诱饵质粒pGBKT7-PlaA,猎物质粒pGADT7-PlaS和pGADT7-dPlaS。先将诱饵质粒pGBKT7-PlaA转入酵母感受态细胞进行自激活验证,若未发生自激活反应,则将诱饵质粒pGBKT7-PlaA分别和猎物质粒pGADT7-PlaS,pGADT7-dPlaS共转进Y2HGold酵母感受态细胞,并增加阴性和阳性对照。结果表明,诱饵蛋白未发生自激活,随后进行的共转化实验中,阳性对照组中的菌落颜色与诱饵质粒和猎物质粒共转化平板上菌落颜色一致,均为蓝色,而阴性对照组中的菌落颜色为白色,说明PlaA与PlaS蛋白及PlaA与dPlaS在体内发生相互作用,激活酵母中的报告基因,所以二者间存在相互作用。为进一步验证PlaA与辅助蛋白PlaS和dPlaS体内相互作用,构建了plaA基因和dplaS基因的共表达菌株dSP28,并与实验室前期构建的含有pla A基因和plaS基因重叠菌株BP28的磷脂酶A1的酶活相比较。结果发现,共表达菌株中辅助蛋白dPlaS对PlaA的表达有促进作用,且酶活有明显提高。说明,截短后的辅助蛋白dPlaS与PlaA间存在相互作用。(4)PlaA与辅助蛋白dPlaS体外相互作用将实验室前期构建得到的AP28重组质粒进行发酵培养,得到大量PlaA的包涵体,对得到的包涵体进行变复性,并用AKTA蛋白纯化仪纯化得到PlaA纯蛋白。同时,对大量可溶性表达的辅助蛋白进行纯化,使纯化后的PlaA与辅助蛋白dPlaS纯度均达到90%以上。随后,将得到的纯蛋白在Biacore蛋白互作仪进行互作,发现PlaA与辅助蛋白dPlaS能够特异结合,并呈现很好的浓度依赖,两蛋白间的结合速率ka为9223 Ms,解离速率kd为1.054E-5 s,平衡亲和力KD为1.143E-9 M。

关键词：粘质沙雷氏菌磷脂酶A1 磷脂酶A1辅助蛋白 n端截短酵母双杂交蛋白质相互作用

辅助蛋白S结构及其对磷脂酶A1表达特性的研究

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辅助蛋白S结构及其对磷脂酶A1表达特性的研究

作者：甘玉飞安徽工程大学

学位级别：硕士

粘质沙雷氏菌plaS基因编码的辅助蛋白能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道。本文通过对磷脂酶A1辅助蛋白S（PlaS）生物信息学分析及其n端截短系列表达菌株的生长特性研究... 详细信息

粘质沙雷氏菌plaS基因编码的辅助蛋白能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道。本文通过对磷脂酶A1辅助蛋白S（PlaS）生物信息学分析及其n端截短系列表达菌株的生长特性研究来确定其抑制作用关键区域,并通过扫描电镜（SEM）观察和流式细胞仪（FCM）检测来初步探究其抑制机理。同时通过酵母双杂交,Biacore蛋白互作实验,以及对共表达菌株dB27P28（磷脂酶A1与n段截短27个氨基酸的辅助蛋白共表达）磷脂酶A1酶活测定,来研究截短后的辅助蛋白对磷脂酶A1的影响。主要研究内容与结果如下:（1）通过对PlaS信号肽,跨膜区,疏水区分析后,决定在PlaS的n端分别截短23、24、25、26、27个氨基酸,并将截短后的辅助蛋白基因分别导入到大肠杆菌BL21（DE3）中。在构建的表达菌株中,dS23P28、dS24P28、dS25P28、dS26P28菌株仍表现出不同程度的生长抑制现象,而dS27P28菌株没有出现生长抑制现象,初步表明PlaS的n端前27个氨基酸为生长抑制关键区域。（2）将SP28（辅助蛋白S基因导入到大肠杆菌BL21（DE3）中表达）,dS27P28菌株诱导表达后进行扫描电镜观察,同时以P28菌株为对照,发现PlaS的表达对大肠杆菌的细胞膜有严重的损伤现象,而从n段截短27个氨基酸的PlaS表达后对大肠杆菌细胞膜损伤作用消失,同时流式细胞仪数据也显示在SP28菌株诱导表达8h时细胞膜损伤率达到了 66.92%。这些结果与生长特性结果一致。（3）利用酵母双杂交技术构建了诱饵质粒pGBKT7-PLA1和猎物质粒pGADT7-dP1aS27,并将二者共转进Y2H Gold酵母细胞中。将共转细胞涂布于TDO/3’AT 20mM和QDO平板能生长,这说明激活报告基因HIS和ADE2表达,所以PLA1蛋白和dPlaS27蛋白之间体内有相互作用。将PLA1蛋白和dPlaS27蛋白进行纯化,随后将得到的纯蛋白在Biacore蛋白互作仪进行二者互作实验来判断二者间的相互特性,结果表明蛋白PLA1与蛋白dPlaS27能够特异结合,并呈现很好的浓度依赖,说明磷脂酶PLA1蛋白与辅助蛋白dPlaS27间在体外存在相互作用。（4）构建了磷脂酶A1与n段截短27个氨基酸的PlaS共表达菌株dB27P28,并与实验室先前构建的磷脂酶A1与PlaS共表达菌株BP28的磷脂酶A1的酶活相比较。发现酶活有很大提高,说明辅助蛋白截短27个氨基酸后没有改变磷脂酶A1的功能,且有助于提高磷脂酶A1的活性。并且对共表达菌株dB27P28初始诱导细胞OD600值,诱导时间和加入IPTG浓度三个方面进行了酶活优化,采用3因素3水平的正交实验,结果得出在菌株生长到OD600为0.6时加0.15mmol/L的IPTG进行诱导8小时酶活达到较高水平。本实验结果对深入研究粘质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白PlaS功能提供理论基础。

关键词：粘质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白磷脂酶A1 n端截短生长抑制蛋白质相互作用