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牛冠状病毒n基因的原核表达及初步应用

中国人兽共患病学报 2010年第1期26卷 76-80页

作者：刘合义余丽芸侯喜林孙留霞周玉龙王进轶刘双翼朴范泽黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319

目的获得牛冠状病毒n基因的全长序列,实现n基因在大肠杆菌中的高效表达,并进行初步应用。方法根据已发表的牛冠状病毒Mebus株的序列设计引物,对BCV-DQ株进行RT-PCR扩增、克隆和测序;将该基因插入到原核表达载体pET-30a(+)上进行原核表达... 详细信息

目的获得牛冠状病毒n基因的全长序列,实现n基因在大肠杆菌中的高效表达,并进行初步应用。方法根据已发表的牛冠状病毒Mebus株的序列设计引物,对BCV-DQ株进行RT-PCR扩增、克隆和测序;将该基因插入到原核表达载体pET-30a(+)上进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测;用纯化的重组n蛋白作为包被抗原,建立ELISA检测方法,对部分临床样本进行检测。结果BCV-DQ株n基因全长1347bp,与GenBank已发表的6株BCV的n基因相比较,核苷酸同源性98.3%以上。构建的重组质粒pET-n能表达出一条大小约为60ku的蛋白,且能与鼠抗BCV血清发生特异性反应。用建立的ELISA方法对黑龙江不同地区送检的共256份牛血清样品进行检测,结果阳性率65.23%,与病毒中和试验的符合率达95.31%。结论BCV n基因保守性很高,并在原核表达系统中获得了高效表达,其表达产物具有良好的免疫反应原性。临床检测结果表明n蛋白可作为诊断抗原用于牛冠状病毒病的流行病学调查。

关键词：牛冠状病毒 n基因克隆序列分析原核表达

水泡性口炎病毒n基因的克隆及其PCR检测方法的建立

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中国兽医科技 2003年第12期33卷 11-14页

作者：王海霞郑增忍龚振华张彦明宫云浩孙淑芳李会荣郭福生蒋正军西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 农业部动物检疫所动物及动物产品卫生质量监督检验测试中心山东青岛266032 温哥华病毒研究中心病毒及分子生物学部

根据国外发表的水泡性口炎病毒 (VSV)基因组核苷酸序列 ,设计了 2对特异性引物 ,通过RT PCR方法得到n基因。将此基因与 pGEM TEasyVector相连 ,通过蓝白斑筛选出阳性克隆 ,碱裂解法小剂量提取质粒。经测定 ,n基因与参考序列同源性高达 ... 详细信息

根据国外发表的水泡性口炎病毒 (VSV)基因组核苷酸序列 ,设计了 2对特异性引物 ,通过RT PCR方法得到n基因。将此基因与 pGEM TEasyVector相连 ,通过蓝白斑筛选出阳性克隆 ,碱裂解法小剂量提取质粒。经测定 ,n基因与参考序列同源性高达 99%。同时根据克隆产物进行亚克隆 ,建立了VSV的PCR检测方法。

关键词：水泡性口炎病毒 n基因基因克隆 PCR检测哺乳动物接触性传染病

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狂犬病毒分离株n基因的分析

华南农业大学学报 2009年第4期30卷 119-121页

作者：江飙刘晓慧陈晶孙招金郭霄峰华南农业大学兽医学院广东广州510642

运用RT-PCR和动物接种的方法从广东省东莞市正常犬只的唾液中分离获得1株狂犬病毒,编号为GD33.为了解析该毒株与兽用狂犬病弱毒疫苗的关系,对该分离株的n基因进行了克隆和测序,并将n基因的序列与GeneBank上已发表的狂犬病毒n基因核苷酸... 详细信息

运用RT-PCR和动物接种的方法从广东省东莞市正常犬只的唾液中分离获得1株狂犬病毒,编号为GD33.为了解析该毒株与兽用狂犬病弱毒疫苗的关系,对该分离株的n基因进行了克隆和测序,并将n基因的序列与GeneBank上已发表的狂犬病毒n基因核苷酸和推导的氨基酸序列进行比较.结果发现:该分离株仅能引起乳鼠发病,对6周龄成鼠无致病性,说明该毒株不是强毒.该分离株n基因与弱毒疫苗HEP-F lury n基因的相似性最高,达99.7%,并且同处系统发育树的最近分枝.因此,推测该分离株源自接种的弱毒疫苗.

关键词：狂犬病毒弱毒疫苗 n基因克隆序列分析

鸡传染性支气管炎病毒Hn99株n基因的克隆与序列分析

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2006年第11期34卷 42-46页

作者：张淑霞贺秀媛崔保安王建华西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）n基因序列，设计并合成1对特异性引物，用RT—PCR方法扩增IBV Hn99株的n基因，并将其克隆入pMD18-T载体，转化感受态大肠杆菌Top10。提取pMD18-T-n重组质粒，进行酶切和PCR鉴定，并对... 详细信息

根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）n基因序列，设计并合成1对特异性引物，用RT—PCR方法扩增IBV Hn99株的n基因，并将其克隆入pMD18-T载体，转化感受态大肠杆菌Top10。提取pMD18-T-n重组质粒，进行酶切和PCR鉴定，并对阳性质粒进行测序。将测序结果与H52，Ark99，BJ等参考毒株进行序列分析。结果表明，n基因全长为1230bp，编码1条409个氨基酸组成的多肽；其核苷酸与H52，Ark99和BJ等毒株的同源性为88．4％～90．7％。氨基酸同源性为91．7％～94．4％；Hn99株与H52，Ark99和BJ等其他各毒株的亲缘关系均较远，是1株新的IBV变异株。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 n基因基因克隆序列分析

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小反刍兽疫病毒新疆株的n基因序列分析

畜牧与兽医 2016年第2期48卷 17-23页

作者：赵亚马海璐李岳洋杨曦曦文山刚马世强萨依甫加玛.卡依萨尔努尔古丽.图尔贡赵丽刘永宏塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室新疆阿拉尔843300

为了分析小反刍兽疫病毒（PPRV）新疆株的分子演变特点,从Gen Bank数据库中下载所有国家全部PPRV的n基因全序列,应用DnAStar软件进行序列分析。结果显示：PPRV中国新疆株,与中国内地流行毒株核苷酸同源性最高,为99.2%～99.9%;与之前中... 详细信息

为了分析小反刍兽疫病毒（PPRV）新疆株的分子演变特点,从Gen Bank数据库中下载所有国家全部PPRV的n基因全序列,应用DnAStar软件进行序列分析。结果显示：PPRV中国新疆株,与中国内地流行毒株核苷酸同源性最高,为99.2%～99.9%;与之前中国西藏毒株核苷酸同源性为98.1%;与中国所用疫苗株核苷酸同源性为93.6%。与其他国家毒株相比,核苷酸同源性最低的是韩国毒株,同源性最高的是印度毒株。n基因系统进化关系分析显示,PPRV中国新疆株属于基因Ⅳ系。n蛋白氨基酸同源性结果与核苷酸比对结果相似。PPRV中国新疆株存在一定程度变异,可能为周边国家传入。

关键词：小反刍兽疫病毒 n基因序列分析新疆

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小反刍兽疫病毒n基因部分序列分子演化规律

中国兽医学报 2017年第12期37卷 2304-2309页

作者：王净王鹏王长顺河北北方学院动物科技学院河北张家口075131 河北北方学院农林科技学院河北张家口075131

为分析中国小反刍兽疫的流行特点,本研究采用生物信息学方法,从nCBI下载小反刍兽疫病毒(PPRV)n基因,以最大似然法建立分子进化树。结果显示,中国PPRV流行株分布于Ⅳ系,有2个分支,2007-2008年中国西藏流行株与2003年印度毒株遗传关系最近... 详细信息

为分析中国小反刍兽疫的流行特点,本研究采用生物信息学方法,从nCBI下载小反刍兽疫病毒(PPRV)n基因,以最大似然法建立分子进化树。结果显示,中国PPRV流行株分布于Ⅳ系,有2个分支,2007-2008年中国西藏流行株与2003年印度毒株遗传关系最近,2013-2015年中国西藏流行株与2012年巴基斯坦毒株遗传关系最近。中国小反刍兽疫主要发生于山羊,2015年新疆巴州毒株来自阿尔卑斯野山羊,与2013年以来的毒株在同一分支。China-BJ_2014与China-XJBZ_2015的遗传距离为0.011 7。中国两簇PPRV分支均与西部邻国毒株遗传关系最近,目前出现多宿主和变异性的流行特点,本研究为有效防控PPRV疫情提供基本的科学依据。

关键词： PPRV n基因分子进化树最大似然法遗传距离

安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒的n基因序列分析

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中国生物制品学杂志 2013年第3期26卷 304-308页

作者：吴杰解庭波黄思佳沈智俊王月朱理业曹明华刘红徐葛林严家新武汉生物制品研究所有限责任公司狂犬病检测中心湖北武汉430060 阜阳市疾病预防控制中心安徽阜阳236001 安徽省疾病预防控制中心安徽合肥230601

目的对安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)的n基因进行序列分析,并比较其与代表性RABV街毒株及疫苗株之间的差异。方法采集安徽省淮北地区狗肉市场的犬脑组织121份,伤人犬脑组织10份,采用直接免疫荧光法和双抗体夹... 详细信息

目的对安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)的n基因进行序列分析,并比较其与代表性RABV街毒株及疫苗株之间的差异。方法采集安徽省淮北地区狗肉市场的犬脑组织121份,伤人犬脑组织10份,采用直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测RABV抗原,并通过颅内接种昆明乳鼠进一步鉴定毒株;RT-PCR扩增分离病毒的n基因,与pMD18-T载体连接测序后,与代表性RABV街毒株及疫苗株的n基因序列进行比对,并进行遗传学分析。结果在送检的131份犬脑组织样品中检出RABV阳性19株,其中伤人犬脑组织阳性率为90%,狗肉市场犬脑组织阳性率为8.26%。19株RABV n基因核苷酸序列同源性为97.5%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性为98.7%～100%;与代表性人用和兽用RABV疫苗株相比,n基因核苷酸序列同源性为85.4%～89.9%,推导的氨基酸序列同源性为94.9%～99.1%,核苷酸序列的变异主要为同义突变。分离的19株RABV在系统进化树上高度聚集,与以往国内分离的代表性街毒株系统进化关系较近,在同一个分支(Hn10除外)与我国疫苗株CTn-181株亲缘关系最近,处于同一个亚群。结论从安徽省伤人犬和狗肉市场的犬脑组织中成功分离并鉴定了19株RABV,这些病毒株均属于基因I型RABV,且具有地域性特征。本研究对特定区域RABV的流行及监测具有一定的意义。

关键词：狂犬病病毒 n基因序列分析

侵染云南烟草的番茄环纹斑点病毒n基因的分子变异分析

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植物病理学报 2012年第2期42卷 195-201页

作者：卢训丁铭方琦方敦煌秦西云张仲凯云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所、云南省农业生物技术重点实验室、农业部西南农业基因资源与种质创制重点实验室昆明650223 云南省烟草农业科学研究院玉溪653100

应用电镜观察和ELISA检测从云南11个县(市)烟草种植区采集的烟草上检测到番茄环纹斑点病毒(Tomato zonatespot virus,TZSV)。根据TZSV n基因设计引物扩增得到了31个TZSV分离物n基因全序列。测序分析表明,31个TZSVn基因核苷酸序列与GenB... 详细信息

应用电镜观察和ELISA检测从云南11个县(市)烟草种植区采集的烟草上检测到番茄环纹斑点病毒(Tomato zonatespot virus,TZSV)。根据TZSV n基因设计引物扩增得到了31个TZSV分离物n基因全序列。测序分析表明,31个TZSVn基因核苷酸序列与GenBank中报道的序列相似性在94.9%～98%之间,其推导的氨基酸序列同源性为98.2%～99.3%。构建系统进化树发现云南不同地区的TZSV分离物存在一定差异。氨基酸序列比较发现,文山分离物和西畴分离物具有2个该地区独有的氨基酸位点。

关键词：番茄环纹斑点病毒 n基因分子变异

抗转Bt基因棉棉铃虫幼虫中肠氨肽酶n基因的克隆与序列特征

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棉花学报 2004年第1期16卷 13-20页

作者：苏建亚周晓梅张天翼沈晋良南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室农药学系江苏南京210095 中国科学技术大学生命科学院安徽合肥230027

通过对抗性和敏感棉铃虫中肠氨肽酶的克隆和测序,鉴定了氨肽酶基因家族的2个成员:Haapn3和Haapn4,其cDnA序列具有3053和2862个核苷酸,分别具有3045和2853bp的开放阅读框,编码产生1014和951个氨基酸的蛋白质。其推定氨基酸序列均具有锌... 详细信息

通过对抗性和敏感棉铃虫中肠氨肽酶的克隆和测序,鉴定了氨肽酶基因家族的2个成员:Haapn3和Haapn4,其cDnA序列具有3053和2862个核苷酸,分别具有3045和2853bp的开放阅读框,编码产生1014和951个氨基酸的蛋白质。其推定氨基酸序列均具有锌结合模体HEXXH和所有锌依赖氨肽酶共有的序列GAMEn。n 末端分别具有18和20个氨基酸的疏水性信号肽,C 末端均具有21个氨基酸的GPI添加信号肽。比对抗性和敏感棉铃虫cDnA的开放阅读框,在Haapn3的开放阅读框中,抗性品系的cDnA具有25个核苷酸的不同,其中9个碱基替代造成氨基酸的变化:苏氨酸189→天冬酰胺、甘氨酸229→天冬氨酸、赖氨酸231→精氨酸、谷氨酸250→丙氨酸、异亮氨酸275→缬氨酸、天冬酰胺281→天冬氨酸、酪氨酸302→组氨酸、缬氨酸648→异亮氨酸、脯氨酸975→谷氨酰胺,其它16个碱基替代为无义突变。在Haapn4的开放阅读框中,有15个点突变,其中8个突变为无义突变,其它7个导致了氨基酸的改变,即赖氨酸4→天冬酰胺、组氨酸162→酪氨酸、脯氨酸185→丝氨酸、谷氨酸297→甘氨酸、苯丙氨酸385→丝氨酸、甲硫氨酸450→异亮氨酸、缬氨酸630→异亮氨酸。本文报道的氨肽酶4个cDnA序列已提交GenBank,AY279536和AY279537分别是抗性和敏感品系的Haapn3。

关键词：抗转Bt基因棉棉铃虫幼虫氨肽酶 n基因基因克隆序列分析