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肌球蛋白1d对自噬溶酶体生成机制的研究

肌球蛋白1D对自噬溶酶体生成机制的研究

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作者：冯学召新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨肌球蛋白1d（myosin1d）对自噬溶酶体形成的影响及其作用机制。方法:（1）在大鼠肾细胞（Normal rat kidney,NRK）中,免疫荧光及Apex-透射电镜观察细胞内myosin1d蛋白与自噬体的定位,免疫共沉淀（CO-immunoprecipitation,CO-I... 详细信息

目的:探讨肌球蛋白1d（myosin1d）对自噬溶酶体形成的影响及其作用机制。方法:（1）在大鼠肾细胞（Normal rat kidney,NRK）中,免疫荧光及Apex-透射电镜观察细胞内myosin1d蛋白与自噬体的定位,免疫共沉淀（CO-immunoprecipitation,CO-IP）观察myosin1d与自噬相关蛋白的相互作用;（2）应用CRISPR/Cas9技术敲除myosin1d基因,建立myosin1d-KO细胞,蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB）检测自噬底物蛋白P62表达水平的变化;（3）在myosin1d敲除的细胞中利用免疫荧光观察LC3与溶酶体膜相关蛋白LAMP1的定位,分析其荧光共定位情况,并应用GFP-RFP-LC3质粒表达观察自噬溶酶体的形成;（4）透射电镜观察自噬溶酶体的形成变化水平;（5）RT-q PCR和WB分别在分子水平和蛋白质水平观察myosin1d对LAMP-1表达的影响;（6）利用溶酶体探针Lyso Sensor检测溶酶体活性的变化。结果:（1）在NRK细胞中,免疫荧光显微镜观察到myosin1d与LC3明显共定位,免疫磁珠样品中myosin1d富集明显,Apex透射电镜显示高密度颗粒的myosin1d主要定位于自噬体结构;（2）饥饿处理2、4小时,WB结果显示,与对照组相比,myosin1d敲除后,P62蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）;（3）细胞饥饿处理4小时,免疫荧光显示,myosin1d敲除后LC3和Lamp-1的共定位明显降低;瞬转GFP-RFP-LC3表达载体,与对照组相比,myosin1d基因敲除后,自噬溶酶体的数目明显减少;（4）饥饿处理4小时,透射电镜结果显示,myosin1d敲除的细胞中自噬溶酶体的数量明显减少;（5）与对照组相比,myosin1d基因敲除细胞中,溶酶体Lamp1 m RNA的表达水平无明显差异性（P＞0.05）,WB结果显示,myosin1d敲除后Lamp1蛋白的表达量与对照相比升高;（6）细胞饥饿处理2、4小时,溶酶体活性探针结果表明,myosin1d基因敲除后,溶酶体活性较对照组有增强（P＜0.05）。结论:myosin1d参与并影响自噬溶酶体的生成过程,其作用机制可能是myosin1d参与了自噬体的转运并影响其与溶酶体的融合。

关键词：细胞自噬 myosin1d 自噬溶酶体自噬流

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