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作者：王乐内蒙古农业大学

学位级别：硕士

通过荧光定量PCR和酶联免疫法,对5、6、8、12月龄苏尼特羊(32只)和巴美肉羊(32只)背最长肌、股二头肌和臂三头肌中CnAα、NFATc3、MEF2c基因的表达量和FoxO1的蛋白表达量进行测定。同时测定了肉质指标,如剪切力、pH(pH0、 pH24)及色泽(L... 详细信息

通过荧光定量PCR和酶联免疫法,对5、6、8、12月龄苏尼特羊(32只)和巴美肉羊(32只)背最长肌、股二头肌和臂三头肌中CnAα、NFATc3、MEF2c基因的表达量和FoxO1的蛋白表达量进行测定。同时测定了肉质指标,如剪切力、pH(pH0、 pH24)及色泽(L*、a*、b*)。研究CaN/NFAI、CaN/MEF2通路相关基因与FoxO1基因、myhc家族基因表达的相关性,分析了CnAα、NFATc3、MEF2c基因表达水平及FoxO1蛋白水平对肉质的影响。结果显示：CnAα、NFATc3及MEF2c在苏尼特羊和巴美肉羊均与FoxO1及myhcs表现出相近的组织表达差异规律,即臂三头肌总是显著高于背最长肌(pmyhcI呈负相关。在背最长肌和臂三头肌中,MEF2c均与Ⅱ型肌球蛋白重链基因表达呈正相关。CnAα、NFATc3及MEF2c,总表现出两两正相关。巴美肉羊的背最长肌和臂三头肌中,CnAα NFATc3及MEF2c均与FoxO1、 myhcI呈负相关。CnAα总与NFATc3呈正相关。在与肉质相关性方面,苏尼特羊的背最长肌和臂三头肌中,CnAa、NFATc3及MEF2c均与剪切力呈正相关,且CnAa与pH、NFATc3与色泽均呈负相关。巴美肉羊的CnAa与剪切力呈负相关,与pH24呈负相关且在股二头肌达到显著(p<0.05)。MEF2c与剪切力、pH24和红度值呈正相关,NFATc3总与亮度呈负相关。在FoxO1蛋白研究中发现,苏尼特三个部位FoxO1蛋白表达随月龄变化趋势一致,都在8月龄最低。5月龄股二头肌显著高于背最长肌和臂三头肌(p<0.05)。此外,苏尼特羊FoxO1蛋白表达与mRNA随月龄变化呈正相关。巴美肉羊中FoxO1蛋白表达趋势基本与苏尼特羊相反,三个部位均在12月龄最低。8月龄的股二头肌显著高于其他两个部位(p<0.05)。巴美背最长肌FoxO1蛋白与mRNA表达呈正相关。FoxO1蛋白表达量总与两种羊的剪切力呈负相关,与pH24和亮度值呈正相关。

关键词： FoxO1 CnAα NFATc3 MEF2c myhc 羊肉品质

MSTN基因编辑猪产肉性状和骨骼肌肌纤维类型研究

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MSTN基因编辑猪产肉性状和骨骼肌肌纤维类型研究

作者：曾智杰安徽农业大学

学位级别：硕士

产肉性状一直是现代生猪遗传改良的重要目标,围绕产肉量和肉品质提高的育种目标,通过多种技术手段已经定位和挖掘了一批可以用于猪产肉性状遗传改良的关键因子。如肌肉抑制素,其由MSTN基因编码,已被证明在牛等动物个体中突变能导致个体... 详细信息

产肉性状一直是现代生猪遗传改良的重要目标,围绕产肉量和肉品质提高的育种目标,通过多种技术手段已经定位和挖掘了一批可以用于猪产肉性状遗传改良的关键因子。如肌肉抑制素,其由MSTN基因编码,已被证明在牛等动物个体中突变能导致个体肌肉增多表型。目前,利用多种基因修饰手段,全球范围内的科学家已经创制出多种MSTN基因修饰猪,在多个品种猪的群体中获得了产肉量的提升。但是,MSTN基因对全身骨骼肌的调控是否存在特异性研究匮乏,且鲜有全面研究MSTN基因修饰猪的全身多部位骨骼肌类型的特征的工作。本研究以本团队前期获得的MSTN编辑大白猪为研究对象,选取了MSTN编辑大白猪和野生型大白猪共16头,采集了试验猪的腰大肌、半腱肌、股二头肌、颈斜方肌、臀浅肌、背阔肌、腹直肌、腹横肌、比目鱼肌、腓肠肌和冈上肌等11个部位的骨骼肌组织,评价MSTN编辑大白猪和野生型大白猪的胴体性状和肉质性状、细化11个部位骨骼肌组织的肌纤维直径和横截面积,分析了不同部位骨骼肌中肌纤维类型的特征。结果显示:***猪MSTN基因表达调控。MSTN基因修饰后,不同部位的骨骼肌组织中的MSTN基因表达水平呈现不一致的变化趋势。颈斜方肌、腰大肌、腓肠肌和腹横肌的MSTN的表达水平在MSTN敲除组和野生型两组之间没有显著差异,其他7个部位的骨骼肌组织目的基因MSTN的表达水平存在不同程度的上调。***猪与野生型猪的屠宰性状与肉质性状比较。与野生型猪相比,同日龄MSTN大白猪眼肌面积与胴体瘦肉率分别显著与极显著提高;p H显著高于野生型大白猪,滴水损失较野生型大白猪相比提高86%,肌内脂肪较野生型大白猪相比减少55%。***基因修饰后,不同部位骨骼肌肌纤维平均直径变化趋势存在差异。MSTN大白猪腰大肌平均直径显著大于野生猪(pmyhcs比例的变化并不一致。比目鱼肌、腰大肌与背阔肌发生编码氧化型肌纤维的MYH2或MYH7表达下调,编码酵解型肌纤维的MYH1或MYH7表达上调。虽股二头肌也出现MYH4表达上调,MYH2与MYH7表达水平下调的结果,但肌纤维未出现肥大。半腱肌主要体现在MYH1与MYH4基因表达水平上调。冈上肌myhcs表达水平无显著变化。我们发现MSTN基因修饰后,不同部位的骨骼肌组织的MSTN基因表达水平呈现不一致的变化趋势,大部分部位的肌纤维的直径和横截面积是随着MSTN基因表达上调而变大。但是,这些肌纤维肥大的骨骼肌部位中My HCs比例的变化并不一致。综上,MSTN基因编辑事件对全身骨骼肌的表型以及对肌纤维面积的增大、肌纤维类型的转换等事件的调控作用在不同部位骨骼肌组织中存在特异性。

关键词：肌纤维 myostatin myhc 基因编辑猪

妊娠期和哺乳期母猪日粮添加粗纤维和丁酸钠对仔猪背最长肌特性的影响

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妊娠期和哺乳期母猪日粮添加粗纤维和丁酸钠对仔猪背最长肌特性的...

作者：冀笑明南京农业大学

学位级别：硕士

母体营养可以影响子代生长代谢、对外界环境的适应能力以及对疾病的抵抗力。以往的研究表明日粮中添加粗纤维和丁酸钠可以改善母体和断奶仔猪的健康状况,提高哺乳母猪的乳脂率,改善母乳的组成成分以及断奶仔猪肠道菌群结构,促进子代的... 详细信息

母体营养可以影响子代生长代谢、对外界环境的适应能力以及对疾病的抵抗力。以往的研究表明日粮中添加粗纤维和丁酸钠可以改善母体和断奶仔猪的健康状况,提高哺乳母猪的乳脂率,改善母乳的组成成分以及断奶仔猪肠道菌群结构,促进子代的生长发育。肌肉约占动物体重的50%,但是妊娠期和哺乳期母猪饲喂纤维和丁酸钠日粮对子代骨骼肌特性的影响报道较少。本试验旨在研究母猪妊娠期和哺乳期饲喂纤维和丁酸钠日粮对新生和断奶仔猪骨骼肌特性的影响。1母体饲喂粗纤维和丁酸钠日粮对仔猪肌肉表观指标的影响选择85头纯种大约克母猪,随机平均分成三组,对照组,5%粗纤维组和0.1%丁酸钠组。粗纤维组母猪在妊娠期和哺乳期饲喂与对照组等能量但纤维含量不同的饲料,在人工授精前一周进行日粮处理,直到仔猪断奶停止。分别在母猪分娩当天和分娩第28 d,采集新生和断奶仔猪样品。采集前称量仔猪体重,用放射免疫分析法检测血清中的IGF-1水平,称量背最长肌重,用HE染色,分析新生和断奶阶段背最长肌肌纤维横截面积,检测背最长肌RNA、DNA含量。结果表明,妊娠和哺乳期间母猪日粮中添加5%的粗纤维和0.1%的丁酸钠,在体重上,新生阶段丁酸钠组体重显著提高(Pmyhc)的表达。结果发现妊娠和哺乳期间母猪饲喂5%的粗纤维和0.1%的丁酸钠日粮,新生仔猪myhc基因和蛋白没有发生变化。在断奶阶段高纤维组myhc Ⅰ型蛋白显著升高(PmyhcⅡx型基因表达显著降低(Pmyhc Ⅱ型蛋白没有发生变化,说明粗纤维日粮对子代肌纤维分化产生了影响。PGC-1α蛋白在新生阶段没有变化,在断奶阶段粗纤维组显著地高于对照组(P<0.05),丁酸钠组没有变化。在新生阶段丁酸钠组mTOR蛋白显著地高于对照组(P<0.05),5%的粗纤维组在新生和断奶时期mTOR蛋白均没有发生变化。新生和断奶仔猪mTOR下游EIF2以及P-EIF2蛋白没有发生变化。妊娠和哺乳期间母猪饲喂5%的粗纤维和0.1%的丁酸钠日粮,新生仔猪背最长肌MYOD、MYOG、MSTN的基因和蛋白没有产生变化。断奶仔猪5%粗纤维组MYOD、MSTN显著低于对照组(P<0.05),丁酸钠组MSTN显著低于丁酸钠组,同时丁酸钠组MYF5基因显著升高,但对蛋白均没有产生影响。以上结果显示了妊娠和哺乳期间母猪饲喂5%的粗纤维日粮影响了子代骨骼肌肌纤维类型,但母体两种日粮处理对子代骨骼肌生长相关基因没有产生显著性影响。

关键词：粗纤维丁酸钠母体骨骼肌 myhc 猪

白藜芦醇通过脂联素信号通路调控肌纤维类型转化的研究

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白藜芦醇通过脂联素信号通路调控肌纤维类型转化的研究

作者：程晓芳广西大学

学位级别：硕士

白藜芦醇对肌肉的pH值、肉色及系水力具有改善作用,并能提高肌肉嫩度,有效改善肉质。脂联素(AdipoQ)作为脂肪细胞因子中唯一的负性调节激素,在骨骼肌氧化代谢方面也发挥着重要作用。为探究白藜芦醇通过脂联素信号通路调控肌纤维转化的... 详细信息

白藜芦醇对肌肉的pH值、肉色及系水力具有改善作用,并能提高肌肉嫩度,有效改善肉质。脂联素(AdipoQ)作为脂肪细胞因子中唯一的负性调节激素,在骨骼肌氧化代谢方面也发挥着重要作用。为探究白藜芦醇通过脂联素信号通路调控肌纤维转化的分子机制,本研究运用过表达及干扰沉默等多种实验方法,在细胞水平及小鼠有机整体水平探究白藜芦醇通过脂联素信号通路,对肌纤维类型变化的影响,获得的主要研究结果如下:1.根据GenBank公布的猪AdipoQ基因CDS序列设计引物,扩增广西陆川猪AdipoQ基因CDS序列,进行生物信息学分析。结果显示陆川猪AdipoQ基因CDS区长为732 bp,可编码242个氨基酸,分子量为26400.7 Da;核酸序列分析发现,不同物种间AdipoQ基因的同源性较高;蛋白预测发现,AdipoQ具有很强的亲水性,有高含量的无规则卷曲和延伸链,较低含量的α-螺旋及β-折叠,含有信号肽,是一种分泌蛋白。成功构建了 pLV-AdipoQ慢病毒表达载体,为后续试验奠定基础。2.将pLV-AdipoQ重组慢病毒载体质粒转染C2C12细胞后成功过表达AdipoQ基因。重组gAcrp30处理组和pLV-AdipoQ过表达组细胞诱导分化结果显示,AdipoR1、AdipoR2、AMPK、PGC-1a、myhc1、myhc2a的表达水平在两个不同处理组中均较对照组显著上调。以上结果说明AdipoQ具有调控肌纤维类型转化的作用。3.C2C12细胞诱导分化过程中,不同处理组(Res处理组、重组gAcrp30处理组、Res+gAcrp30处理组)与对照组结果比较显示,gAcrp30与Res 均具有上调 AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、AMPK、PGC-1 α、myhc1基因表达量,下调myhc2b基因表达量的作用,Res+gAcrp30处理组定量结果显示,在肌纤维类型转化调控作用中二者具有协同叠加效应。结合白黎芦醇对选择性干扰AdipoR1、AdipoR2、AdipoR1/2基因的C2C12细胞作用结果显示,当AdipoR1基因受到干扰表达下调后,AMPK、PGC-1α基因表达量呈相同趋势,均显著下调,在白藜芦醇的作用下,AdipoR2基因的表达量显著升高,但AMPK、PGC-1α基因表达变化差异不显著;当AdipoR2基因受到干扰表达下调后,AdipoR1、AMPK、PGC-1α基因的表达量变化并不受到影响,在白藜芦醇的作用下,AdipoR1、AdipoR2、AMPK、PGC-1α基因的表达水平均呈上调趋势;当AdipoR1、AdipoR2基因均受到干扰表达下调后,在白藜芦醇的作用下AdipoR1、AdipoR2、AMPK、PGC-1α基因的表达水平均显著增加。综合细胞水平验证结果提示白藜芦醇主要通过AdipoR1调控AMPK磷酸化激活作用下上调下游通路蛋白PGC-1α的表达,进而调控肌纤维的类型。4.白藜芦醇饲喂小鼠12周,白藜芦醇饲喂组与对照组相比,体重和采食量,及生化指标均无明显差异,肝脏、脂肪组织以及血清中AdipoQ表达水平较对照组显著升高,趾长伸肌和比目鱼肌中AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、AMPK、PGC-1α、myhc1,myhc2a,myhc2x基因表达量均明显高于对照组,myhc2b表达量低于对照组。综上所述,白藜芦醇通过脂联素信号通路上调AdipoR1基因表达,激活AMPK及其下游PGC-1α基因的表达,进而调控肌纤维向氧化型转化。

关键词：白藜芦醇脂联素脂联素受体肌纤维类型 myhc

人参皂苷Rg1促进C2C12细胞增殖与分化

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人参皂苷Rg1促进C2C12细胞增殖与分化

作者：贾胜男东北师范大学

学位级别：硕士

骨骼肌属于横纹肌,是动物躯体中肌肉组织的一种,主要分布在躯干和四肢。骨骼肌为高度分化组织,具有维持躯体姿势、产生躯体运动和进行葡萄糖代谢等多种生理功能。然而,在躯体运动过程中或者某些病理条件下,骨骼肌容易受到损伤或者产生... 详细信息

骨骼肌属于横纹肌,是动物躯体中肌肉组织的一种,主要分布在躯干和四肢。骨骼肌为高度分化组织,具有维持躯体姿势、产生躯体运动和进行葡萄糖代谢等多种生理功能。然而,在躯体运动过程中或者某些病理条件下,骨骼肌容易受到损伤或者产生代谢障碍,并会严重影响患者的正常行动和生活。因此,治疗与修复受损骨骼肌、维持骨骼肌正常代谢和提高骨骼肌机能具有非常重要的临床意义。人参皂苷Rg1,一种人参萜三醇,是人参中主要活性成分之一。近年来,人参皂苷Rg1的药用价值受到广泛的关注。多项研究发现,其对人体健康具有很多重要作用,如抗癌,抗辐射和抗衰老等。但是,有关人参皂苷Rg1对骨骼肌发育和代谢调控作用的报道较少。因此,本实验主要探究了人参皂苷Rg1对骨骼肌增殖、分化和葡萄糖摄取三个方面的影响。[实验目的]分析人参皂苷Rg1对小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12增殖、分化和葡萄糖摄取的影响,研究人参皂苷Rg1对骨骼肌的保护作用。[实验方法]用不同浓度的人参皂苷Rg1孵育小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12。通过细胞计数、MTT和流式细胞术等方法研究Rg1对C2C12细胞的促增殖作用;通过Western blot检测myhc和MyoG的表达情况,研究Rg1对C2C12细胞的促分化作用;通过葡萄糖氧化酶法检测C2C12细胞葡萄糖消耗情况,通过Western blot检测GLUT-4的表达与转位,研究Rg1对C2C12细胞促进葡萄糖摄取的作用。[实验结果]用一定浓度的Rg1(10-4,10-3,10-2,10-1mM)孵育小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12后,能够有效提高C2C12细胞活力,促进其增殖;同时,Rg1能够上调肌球蛋白重链myhc和肌细胞生成素MyoG的表达,促进C2C12细胞分化;此外,Rg1还能增加C2C12细胞对葡萄糖的消耗并促进葡萄糖转运蛋白-4的表达和转位,在C2C12细胞摄取葡萄糖方面具有一定促进作用。综合以上实验结果得出:人参皂苷Rg1对小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12增殖、分化和葡萄糖摄取均具有一定的促进作用。表明人参皂苷Rg1参与了骨骼肌的发育、分化和代谢调控,为人参皂苷Rg1在骨骼肌损伤后修复、肌萎缩治疗以及提高骨骼肌机能等方面的临床研究与应用提供了理论基础。

关键词：人参皂苷Rg1 增殖 myhc MyoG GLUT-4

miR-208b和miR-499在巴马香猪骨骼肌肌纤维类型转化中的作用研究

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miR-208b和miR-499在巴马香猪骨骼肌肌纤维类型转化中的作用研究

作者：李艳君广西大学

学位级别：硕士

MicroRNAs是一类进化上非常保守的小的非编码RNA,在骨骼肌发育中起到了至关重要的调控作用。本实验以巴马香猪为对象,探究miR-208b和miR-499在骨骼肌肌纤维类型转化中的作用,为揭示巴马香猪优良肉质形成机制的研究奠定基础。获得的主要... 详细信息

MicroRNAs是一类进化上非常保守的小的非编码RNA,在骨骼肌发育中起到了至关重要的调控作用。本实验以巴马香猪为对象,探究miR-208b和miR-499在骨骼肌肌纤维类型转化中的作用,为揭示巴马香猪优良肉质形成机制的研究奠定基础。获得的主要研究结果如下：***-208b和miR-499在巴马香猪背最长肌、股二头肌、心脏中均有高丰度表达,在其他组织中的表达丰度较低。对巴马香猪不同发育时期的背最长肌进行检测,发现miR-208b和miR-499的表达量在胚胎期持续升高,出生后表达量下降。2.巴马香猪背最长肌发育过程中,myhc Ⅰ的表达量显著性逐渐降低(Pmyhc Ⅰ的表达呈显著正相关(r=0.9561,Pmyhc ⅡB的表达呈显著负相关(r=-0.9410,Pmyhc Ⅰ的表达量(Pmyhc ⅡB的表达量(P0.05);C2C12及肌肉卫星细胞分化过程中,AMPK的表达量实验组和对照组均无显著差异(P>0.05);肌肉卫星细胞中PGC-1α的表达水平显著上调(PmyhcI的表达(Pmyhc ⅡB的表达(P0.05);AMPK、PGC-1α的表达水平均显著上调(P<0.05)。综上所述,miR-208b和miR-499对氧化型肌纤维的形成有促进作用,对酵解型肌纤维有抑制作用,可能通过调控AMPK、PGC-1α起作用。

关键词：巴马香猪肌纤维类型 myhc miR-208b miR-499 AMPK PGC-1α

GSK3β蛋白对山羊骨骼肌卫星细胞增殖分化的作用

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GSK3β蛋白对山羊骨骼肌卫星细胞增殖分化的作用

作者：肖霞四川农业大学

学位级别：硕士

糖原合成酶激酶3（GSK3）是一种广泛存在于哺乳动物中的丝氨酸/苏氨酸类激酶,其作用的底物繁多,参与众多的信号通路并在其中发挥重要的功能。在哺乳动物中GSK3存在GSK3α和GSK3β两种亚型,已有研究表明GSK3β参与了细胞的增殖和分化过... 详细信息

糖原合成酶激酶3（GSK3）是一种广泛存在于哺乳动物中的丝氨酸/苏氨酸类激酶,其作用的底物繁多,参与众多的信号通路并在其中发挥重要的功能。在哺乳动物中GSK3存在GSK3α和GSK3β两种亚型,已有研究表明GSK3β参与了细胞的增殖和分化过程的调控,本研究通过抑制GSK3β的活性,探究GSK3β对骨骼肌卫星细胞（SMSCs）增殖分化的作用。同时构建了 myhc2a启动子6个不同片段载体,利用双荧光素酶报告基因检测系统揭示GSK3β蛋白对myhc2a启动子的转录调控作用,并为进一步研究GSK3β在肌肉生长发育中的作用提供理论基础。主要的结果如下:***开始贴壁生长时,呈长梭形,分化的第1d,细胞有规律的朝同一方向生长,至第7 d,细胞相互融合形成大量的肌管。qPCR检测结果显示在SMSCs的增殖期（0 d）,Pax7和MyoD表达量高,而myhc和MyoG几乎不表达;Pax7进入分化阶段后表达量极显著下降（P＜0.01）;MyoD基因表达量在分化期维持较高水平（3d）,随后在分化5 d和7 d显著降低（P＜0.05）;与增殖期相比,myhc在分化3d、5 d和7d时表达量显著上调（P＜0.01）,而在分化1d时表达量差异不显著;MyoG基因表达量与增殖期相比,在分化阶段表达量增加,其中在分化3d时达到最高（P＜0.01）,随后显著下调（P＜0.01）。2.用SB216763抑制GSK3β蛋白的活性后,山羊骨骼肌卫星细胞的分化被抑制,同时分化标志基因的表达下调。与对照组相比,SB216763处理后增殖阶段的标志基因Pax7的表达量差异不显著,而MyoD基因表达量在0 d显著降低（P＜0.05）;而分化标志基因myhc处理组在分化5 d和7 d时表达量极显著下调（P＜0.01）,而在0d、分化1d和分化3d的表达量无显著差异。MyoG基因表达量在增殖期无明显变化,进入分化阶段后表达量下降,在分化3d极显著下调（P＜0.01）。3.利用双荧光素酶报告系统检测myhc2a启动子片段的活性,结果表明:在SMSCs增殖阶段,构建的6个myhc2a基因的启动子片段相对活性均显著地高于pGL3-basic的活性（P＜0.05）。片段154/+55的荧光素酶活性显著地低于片段-229/+55的相对荧光素酶活性（P＜0.05）,说明片段-154到-229之间存在正向调控元件;片段-229/+55的相对荧光素酶活性显著地高于片段-466/+55（P＜0.05）,同时片段-466/+55,-514/+55,-704/+55和-1038/+55的荧光素酶活性无显著性差异,说明在片段-229/+55到片段-466/+55之间存在负向调控元件。在SMSCs分化阶段,通过片段缺失试验结果可以看出,片段-514/+55的荧光素酶活性最高,显著地高于片段-466/+55（P＜0.05）,说明-446到-514之间存在正向调控元件。而在片段-704/+55的荧光素酶活性显著地低于片段-514/+55的荧光素酶活性（P＜0.05）,而显著地高于片段-1038/+55的荧光素酶活性（P＜0.05）,说明-514到-704之间或-704到-1038间存在负向调控元件。4.用双荧光素酶报告系统检测抑制GSK3β后myhc2a启动子片段活性。结果表明:与单独转染构建的6个myhc2a启动子活性相比,在SMSCs的增殖阶段,抑制 GSK3β 对山羊 myhc2a 启动子片段-466/+55,-514/+55,-704/+55 和-1038/+55的活性有显著促进作用（P＜0.05）,而对片段-229/+55的活性有显著抑制作用（P＜0.05）;在SMSCs的分化阶段,抑制GSK3β对启动子片段-466/+55和-1038/+55的活性有显著促进作用（P＜0.05）,而对片段-229/+55和-514/+55有显著抑制作用（P＜0.05）。

关键词：山羊 GSK3β SMSCs 启动子 myhc 转录调控

利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响

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利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响

作者：李文涛华中农业大学

学位级别：硕士

肌肉是由不同类型的肌纤维构成,根据肌球蛋白重链的不同可将肌纤维类型分为I型、IIa型、IIb型和IIx型等四种。四种不同肌纤维在肌肉中所占比例的变化影响着肌肉的品质,因此研究不同肌纤维类型之间的转化对改良肌肉的品质具有重要意义。F... 详细信息

肌肉是由不同类型的肌纤维构成,根据肌球蛋白重链的不同可将肌纤维类型分为I型、IIa型、IIb型和IIx型等四种。四种不同肌纤维在肌肉中所占比例的变化影响着肌肉的品质,因此研究不同肌纤维类型之间的转化对改良肌肉的品质具有重要意义。FHL3蛋白是LIM蛋白家族一员,本课题组前期研究表明在C2C12成肌细胞中超表达FHL3基因可抑制myhc I基因的表达,促进myhc IIa和myhc IIb基因的表达,但在活体水平FHL3基因对不同肌纤维类型的影响仍不清楚。本研究以肌肉超表达FHL3转基因小鼠为模型,在活体水平上验证了该基因对不同肌纤维类型形成的影响。具体研究结果如下:1.构建了pEGFP-N1L-MCK-FHL3肌肉特异表达的转基因载体,利用PCR技术成功筛选获得FHL3阳性转基因小鼠,采用Q-PCR法和热不对称交错式PCR法检测了F0、F1代阳性小鼠外源FHL3基因拷贝数及F0代51号小鼠FHL3基因的插入位点,结果表明外源基因FHL3是以连续多个拷贝的方式插入小鼠基因组内,且51号个体FHL3基因插入在小鼠4号染色体内。2.统计了F0代小鼠窝产仔数、F1代小鼠阳性率以及生长曲线,结果表明F0代转基因母鼠的窝产仔数显著高于野生母鼠,F0代转基因公鼠所产后代阳性率显著低于F0代转基因母鼠所产后代的阳性率,2-8周龄转FHL3基因公鼠和母鼠的体重与野生公鼠和母鼠的体重无显著差异。3.利用Q-PCR方法检测了FHL3基因在2月龄转基因小鼠和野生小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、胃、脂肪、肌肉、睾丸等组织中的表达量,结果表明转FHL3基因小鼠的心肌、骨骼肌、睾丸中,FHL3基因的mRNA表达量显著高于野生鼠。4.对2月龄小鼠股四头肌进行石蜡包埋、切片、HE染色,利用Image J软件对股四头肌肌纤维数目和横截面积分别进行统计,统计结果显示转FHL3基因小鼠的肌纤维数目和横截面积与野生鼠相比均无显著差异。5.提取2月龄转FHL3基因小鼠和野生小鼠腓肠肌组织的RNA和蛋白,利用Q-PCR和Western blotting技术分别检测了FHL3、myhc I、myhc IIa、myhc IIb等基因的mRNA和蛋白的表达水平,结果表明转基因小鼠中FHL3、myhc IIa、myhc IIb基因的mRNA和蛋白表达量显著高于野生鼠,myhc I基因的mRNA和蛋白表达量显著低于野生鼠。6.利用ATP酶染色和SDH染色区分2月龄小鼠比目鱼肌和股四头肌中的不同肌纤维类型,与非转基因小鼠相比,转基因小鼠I型纤维显著降低,II型纤维显著上升。综上所述,本研究利用转FHL3基因小鼠模型,验证了FHL3可负调控myhc I基因的表达,正调控My HC IIa和myhc IIb基因的表达,从而导致I型肌纤维降低,II型肌纤维增多。本研究在活体水平上阐明了FHL3基因对不同肌纤维类型的影响,为改善动物肉质品质提供了一定的理论基础。

关键词： FHL3 转基因小鼠肌纤维类型 myhc

C2C12成肌分化过程中SKIP与PI3K/Akt和p38信号通路之间关系的研究

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C2C12成肌分化过程中SKIP与PI3K/Akt和p38信号通路之间关系的研究

作者：李小珊华中农业大学

学位级别：硕士

骨骼肌纤维是骨骼肌的主要组成部分,而肌纤维的数目由出生前肌源细胞的成肌分化进程所决定,直接影响家畜的生长潜能和肉质。MyoD依赖的肌肉特异性基因的染色质重塑激活是控制成肌分化的重要方式,受PI3K/Akt和p38信号通路共同调控;SKIP(S... 详细信息

骨骼肌纤维是骨骼肌的主要组成部分,而肌纤维的数目由出生前肌源细胞的成肌分化进程所决定,直接影响家畜的生长潜能和肉质。MyoD依赖的肌肉特异性基因的染色质重塑激活是控制成肌分化的重要方式,受PI3K/Akt和p38信号通路共同调控;SKIP(Skeletal muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase)在成肌分化过程中上调表达,并负调控成肌分化。本课题旨在探究C2C12成肌分化过程中SKIP与PI3K/Akt和p38信号通路之间的关系。主要研究结果如下:1)2%马血清诱导C2C12成肌分化,通过荧光定量PCR以及蛋白质免疫印迹检测SKIP的表达、亚硫酸氢盐方法检测成肌分化前后SKIP调控区DNA甲基化状态、ATAC-seq技术检测成肌分化前后SKIP的染色质开放状态、ChIP检测成肌分化前后转录因子MyoD以及甲基化组蛋白H3K27me3与SKIP启动子的结合情况。结果表明:SKIP的mRNA水平以及蛋白水平均在成肌分化中上调表达;相比成肌分化前,成肌分化后SKIP调控区DNA甲基化的分布发生改变,程度无明显差异;在成肌分化前,SKIP启动子区的染色质呈关闭或抑制状态,分化后SKIP染色质呈开放状态;在成肌分化前MyoD与SKIP启动子几乎没结合,在成肌分化后与SKIP启动子有结合;在成肌分化后H3K27me3与SKIP启动子的结合水平显著低于成肌分化前。2)在C2C12中超表达SKIP后诱导成肌分化,通过荧光定量PCR、免疫荧光、Western blot检测发现,分化标志基因Myogenin、MCK、MyoD、MEF2C的mRNA水平降低;myhc、Myogenin的蛋白水平降低;p-Akt、p-p38皆降低。表明SKIP负调控PI3K/Akt和p38信号通路介导的成肌分化。3)在C2C12诱导分化过程中,分别利用抑制剂LY294002、SB203580处理,通过荧光定量PCR、免疫荧光、ChIP检测发现,抑制剂处理后,Myogenin、MCK、MyoD、MEF2C、myhc以及SKIP的mRNA水平显著或极显著降低;myhc、Myogenin的蛋白水平降低;用LY抑制PI3K,SKIP启动子几乎没有富集转录因子MyoD,用SB抑制p38,SKIP的启动子有MyoD的结合。表明PI3K/Akt介导的成肌分化需要MyoD结合SKIP的启动子,而p38信号介导的成肌分化可能需要MyoD与其他辅助因子结合SKIP的启动子,两条通路协同上调SKIP的表达。

关键词： SKIP myhc Myogenin p-Akt p-p38 成肌分化

CFL2基因干扰对成肌细胞C2C12肌球蛋白重链基因的影响及分子作用机制的初步探讨

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CFL2基因干扰对成肌细胞C2C12肌球蛋白重链基因的影响及分子作用...

作者：刘丹辽宁医学院

学位级别：硕士

目的通过RNAi技术建立CFL2基因低表达的C2C12细胞表型，利用实时定量PCR和western blot技术分析myhc及与调节myhc相关的信号通路因子的表达水平的变化，为进一步阐明猪CFL2基因与肌纤维myhc的特异功能关系及CFL2调节myhc的信号通路的... 详细信息

目的通过RNAi技术建立CFL2基因低表达的C2C12细胞表型，利用实时定量PCR和western blot技术分析myhc及与调节myhc相关的信号通路因子的表达水平的变化，为进一步阐明猪CFL2基因与肌纤维myhc的特异功能关系及CFL2调节myhc的信号通路的作用机制奠定基础。方法采用RNAi技术，将设计合成的SiRNA转染小鼠成肌细胞C2C12，WesternBlot鉴定CFL2蛋白表达及相关蛋白p38、ERK2、CBP的表达;实时定量PCR技术分析低表达猪CFL2的C2C12细胞株中肌球蛋白重链基因（myhcslow、myhc2x、myhc2b）及其相关信号通路因子AMPKα1、MuRF1、MEF-2的表达水平变化。结果 1、SiRNA转染10%FBS DMEM培养的C2C12，Western Blot鉴定表明细胞低表达的CFL2基因，实时定量PCR分析低表达的C2C12，结果表明myhc1/slow、myhc2x、和myhc2b基因的表达明显下降。 2、SiRNA转染2%马血清诱导后的的C2C12中，Western Blot鉴定结果细胞表达CFL2基因表达下调;实时定量PCR方法分析马血清诱导后SiRNA转染的C2C12中myhc的表达，结果表明,myhc各类型的表达也没有明显变化。 3、Western Blot方法分析低表达CFL2基因的C2C12中myhc信号通路相关因子的表达变化，结果表明CFL2基因的变化的同时相关通路因子的表达也有明显的变化。其中p38表达明显下降，ERK2表达增加，CBP表达下调。 4、实时定量PCR方法分析低表达CFL2基因的C2C12中myhc信号通路相关因子的结果表明：AMPKa1的基因表达下调，MURF1的基因表达明显增加，MEF-2的基因表达明显降低。结论 1、C2C12分化后再对CFL2进行RNAi获得低表达，肌球蛋白重链基因的表达不再发生变化，说明CFL2对myhc的调节发生在C2C12细胞分化前。 2、CFL2基因低表达影响未分化的C2C12细胞myhcslow、myhc2x、myhc2b基因的表达明显下调。 3、C2C12分化前RNA干扰CFL2获得低表达，p38,MEF-2,CBP,AMPKα1等因子的表达下调， ERK2，MuRF1的表达上调可能影响myhc2b、2x、slow表达变化。

关键词：猪 CFL2 myhc p38 ERK2 MEF-2