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Improvement of PCR reaction conditions for site-directed mutagenesis of big plasmids

Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology) 2012年第4期13卷 244-247页

作者： Bogdan MUNTEANU Mario BRAUN Kajohn BOONROD RLP AgroScience GmbH AlPlanta-Institute for Plant ResearchBreitenweg 71D-67435 NeustadtGermany

QuickChange mutagenesis is the method of choice for site-directed mutagenesis （SDM） of target sequences in a plasmid. It can be applied successfully to small plasmids （up to 10 kb）. However, this method cannot efficiently mutate bigger plasmids. Using KOD Hot Start polymerase in combination with high performance liquid chromatography （HPLC） purified primers, we were able to achieve SDM in big plasmids （up to 16 kb） involving not only a single base change but also multiple base changes. Moreover, only six polymerase chain reaction （PCR） cycles and 0.5μI of polymerase （instead of 18 PCR cycles and 1.0 μI of enzyme in the standard protocol） were sufficient for the reaction.

关键词： Site-directed mutagenesis (SDM) mutant plasmid

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