检索结果-南通市图书馆

作者：王芬安徽大学

学位级别：硕士

错配修复系统广泛的存在于生物体中,由于这个系统的存在保证了DNA复制过程中的保真度。在原核大肠杆菌和嗜热栖生菌中同样也有这一系统的存在,且大肠杆菌是第一个被发现的。错配识别蛋白muts是错配修复系统中一系列蛋白的其中之一,且在... 详细信息

错配修复系统广泛的存在于生物体中,由于这个系统的存在保证了DNA复制过程中的保真度。在原核大肠杆菌和嗜热栖生菌中同样也有这一系统的存在,且大肠杆菌是第一个被发现的。错配识别蛋白muts是错配修复系统中一系列蛋白的其中之一,且在行使功能时第一个发挥作用。错配识别蛋白muts可以单独的识别并结合未配对的和含有错配的DNA双链,并能结合由于碱基的缺失或多余而引起的突出环。出现于20世纪60年代的合成生物学在21世纪得以正式的发展,在其发展过程中取得了重大的成就和一系列的突破。随着DNA自动化合成效率的继续提高和基因组数据库的逐渐丰富,为DNA的合成提高了条件,但是基因组移植技术和大片段扩增技术是合成生物学的两大技术瓶颈。DNA错配修复是大片段扩增技术的一大难点之一,其解决方法之一就是蛋白介导的错配修复。这个蛋白质就是错配识别蛋白muts。这一方法为DNA合成中经常出现的错配问题提供了更好的解决方案,使合成生物学能够得到更好的发展。本实验中我们构建了E.coli和T.thermophilus的错配识别蛋白muts的原核表达载体pET-32(a+)-Emuts和pET-32(a+)-Tmuts;并在大肠杆菌BL21(DE3)得以表达,通过疏水作用亲和层析和离子交换层析纯化得到了具有一定纯度的MutS蛋白。利用凝胶滞缓实验分别检测了E.coli和T.thermophilus的MutS蛋白的错配识别活性,与含有错配位点的DNA作用有滞后带出现。当DNA: E-MutS蛋白的分子个数比为1：4时,测序比对后,统计出E.coli的MutS蛋白使含有1-3个错配位点的DNA错配率分别由53%、60%、58%下降到36%、35%和33%;DNA的错配率分别降低了17%、25%和25%。T.thermophilus的MutS蛋白作用于含有一个错配位点的DNA双链,当DNA:MutS蛋白的分子个数比分别为1：4、1：6、1：8时,DNA的错配率分别由58%、59%、57%降低到35%、32%、31%;双链DNA的错配率分别降低了23%、27%、26%。由此,我们成功的构建、表达并纯化了大肠杆菌muts和嗜热栖生菌的MutS蛋白,并通过凝胶滞缓实验对这两种蛋白的进行了活性研究。得出的结论是E-muts和T-MutS蛋白均能明显降低DNA的错配率,并寻找了T-MutS蛋白作用1/1000错配率的DNA的最佳分子数比是：1：6-1：8,且相同分子个数比的T-MutS蛋白的活性较E-muts强。

关键词： MutS蛋白重组表达错配率凝胶滞缓实验

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DNA合成错误纠正及相关检测新技术研究

DNA合成错误纠正及相关检测新技术研究

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作者：沈皖珠安徽医科大学

学位级别：硕士

DNA从头合成技术是以化学合成寡核苷酸链为起始制备长片段DNA技术。凭借设计灵活、不受天然模板限制、可规模化生产等显著优势,DNA从头合成迅速发展成为合成生物学的底层支撑技术。目前基因片段的人工合成及组装中存在的一个重大问题是... 详细信息

DNA从头合成技术是以化学合成寡核苷酸链为起始制备长片段DNA技术。凭借设计灵活、不受天然模板限制、可规模化生产等显著优势,DNA从头合成迅速发展成为合成生物学的底层支撑技术。目前基因片段的人工合成及组装中存在的一个重大问题是DNA产物保真度较差,在寡核苷酸的化学合成、短片段组装及拼接过程中都会引入碱基错误,导致获得正确产物的筛选难度增大、测序成本增加,严重影响合成效率。基于错配切割法和错配结合法的DNA合成错误纠正技术可有效降低合成序列的错误率,减少重复克隆筛选工作量、时间和成本。但现有DNA合成错误纠正技术因试剂昂贵、单种纠错酶纠错效果不稳定、操作复杂等问题,并没有大规模应用于DNA合成中。在本研究中,我们提出了一种基于多种错配切割酶协同作用的组合酶纠错体系,利用多种酶之间不同的作用机制来开发纠错效果稳定、适合不同目标序列且成本较低的酶法纠错新技术。同时,对基于错配结合酶Mut S蛋白的物理分离纠错法进行了验证,利用Mut S蛋白固定化的FeO颗粒作为错配双链捕获工具,简化纠错后DNA溶液回收操作,使DNA合成错误纠正法可以向着自动化方向发展。最后,基于磁性纳米标签材料开发了新型的表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)免疫层析检测新技术,用于DNA错配序列及肿瘤标志物的高灵敏检测。论文的主要研究内容如下:(1)一种新型的组合酶纠错体系的开发及优化筛选十种常用错配切割酶,比较各酶纠错特性如正确克隆提高比例、错误率降低幅度,选择纠错效果最佳的错配切割酶组合。试验不同组合酶(种类、数量等)纠正1.2千碱基对(kb)和3.7kb序列效果。优化组合酶纠错反应条件,包括反应时间、反应温度、反应缓冲液、酶用量、纠错次数。对组合酶纠正2.1kb和2.5kb序列进行性能验证。经过筛选和优化,建立了组合酶错配切割纠错法,合成的DNA序列正确率比T7核酸内切酶I纠错后正确率提高1～2倍,二轮纠错效率与商业化纠错试剂Surveyor相当,对部分序列纠错效果甚至超过Surveyor。(2)基于Mut S蛋白固定化磁珠的纠错能力评价采用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)化学偶联法将三种Mut S蛋白分别修饰在羧基化磁珠上,试验磁珠@Mut S特异性结合固定错配双链和非特异性结合同源双链能力,并筛选出纠错活性最强的Taq Mut S蛋白。设计两种磁珠@Mut S纠错策略,一是试验磁珠@Mut S单独纠正1.2kb序列效果,二是试验核酸内切酶V与磁珠@Mut S联合纠正1.2kb序列效果。实验结果表明核酸内切酶V与磁珠@Mut S联合纠正1.2kb DNA序列可将错误率从2.35/kb降至1.64/kb。磁珠@Mut S与核酸内切酶V联合纠错法可有效降低序列错误率,为DNA人工合成中的错误纠正提供了新的研究方法与思路。(3)发明一种磁性SERS层析法用于DNA错配序列及肿瘤标志物的检测首先采用具有SERS活性及磁富集能力的金壳磁性纳米材料(FeO@Au)作为检测标签,在其表面修饰Taq Mut S蛋白用于溶液中DNA错配序列的捕获。通过在免疫层析试纸条上构建检测线(T线)的方式,捕获形成的FeO@Au-Mut S-DNA错配序列,并通过检测T线产生的SERS信号实现对错配序列的快速检测。此外,为了进一步提升磁性SERS层析的灵敏度,发明了一种树莓状的FeO@Au作为新型SERS标签,具有精密的表面缝隙和极强的SERS性能。最后利用基于树莓状FeO@Au标签构建用于肿瘤标志物联合检测的磁性SERS免疫层析体系,实现了三种常见肿瘤标志物的高灵敏定量检测。

关键词： DNA从头合成错配切割组合酶 MutS蛋白表面增强拉曼光谱纸层析

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DNA错配修复系统研究进展

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生物化学与生物物理进展 2003年第1期30卷 32-37页

作者：毕利军周亚凤邓教宇张先恩张成刚中国科学院武汉病毒研究所武汉430071 中国科学院沈阳应用生态研究所沈阳110015

DNA错配修复 (mismatchrepair ,MMR)系统广泛存在于生物体中 .从原核生物大肠杆菌到真核生物及人类 ,MMR系统有不同的组成成分和修复机制 .人体内MMR基因缺陷会造成基因组的不稳定并诱发遗传性非息肉型直肠癌以及其他自发性肿瘤 .大肠杆... 详细信息

DNA错配修复 (mismatchrepair ,MMR)系统广泛存在于生物体中 .从原核生物大肠杆菌到真核生物及人类 ,MMR系统有不同的组成成分和修复机制 .人体内MMR基因缺陷会造成基因组的不稳定并诱发遗传性非息肉型直肠癌以及其他自发性肿瘤 .大肠杆菌MMR系统中的MutS蛋白可特异识别错配或未配对碱基 ,目前已经发展了多种基于MutS蛋白的基因突变 /多态性检测技术 .

关键词： DNA错配错配修复机制 MutS蛋白基因突变多态性检测 MMR系统

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DNA错配修复系统组成和功能的研究进展

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现代生物医学进展 2008年第6期8卷 1160-1165页

作者：刘卓吴建新首都儿科研究所北京100020

DNA错配修复(Mismateh repair,MMR)系统广泛的存在于从原核到真核的生物体中,是进化上保守的生化通路。MMR系统由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子(错配修复基因产物)组成。细胞由于此系统的存在使DNA复制保持忠实性,从而保持遗传... 详细信息

DNA错配修复(Mismateh repair,MMR)系统广泛的存在于从原核到真核的生物体中,是进化上保守的生化通路。MMR系统由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子(错配修复基因产物)组成。细胞由于此系统的存在使DNA复制保持忠实性,从而保持遗传物质的完整性和稳定性,避免遗传物质发生突变。MMR系统基因的失活会导致自发突变率的明显增加,从而导致微卫星不稳定(MSI),可能引发某些肿瘤发生。近年来,MMR系统的研究越来越受到学者的重视,对MMR作用机制及组成该系统的几种酶蛋白结构与功能方面的研究不断深入,加深了对MMR系统的理解。这些为MMR系统相关的应用研究,尤其是为肿瘤发生奠定了理论的基础。本文重点讨论了错配修复系统的蛋白组成、各蛋白的功能及它们如何相互协调发挥作用的最新研究进展。

关键词： DNA错配修复重建系统 MutS蛋白

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