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munc13-1 C2C结构域相互作用蛋白的筛选

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Munc13-1 C2C结构域相互作用蛋白的筛选

作者：任怡静华中科技大学

学位级别：硕士

大脑功能的正常发挥依赖于神经元之间高效有序的信息交流,而突触(synapse)是神经元间信息交流的基础。聚集于突触前膜的突触囊泡以响应钙离子的方式实现与突触前膜的融合,完成神经递质分泌。在突触囊泡到达膜融合位点后,还需经过拴系、... 详细信息

大脑功能的正常发挥依赖于神经元之间高效有序的信息交流,而突触(synapse)是神经元间信息交流的基础。聚集于突触前膜的突触囊泡以响应钙离子的方式实现与突触前膜的融合,完成神经递质分泌。在突触囊泡到达膜融合位点后,还需经过拴系、锚定、启动、融合等过程完成神经递质的释放,此过程受到多种突触前蛋白的调控。munc13-1是一种重要的突触分泌调控蛋白。在线虫和小鼠中,munc13-1的敲除会导致严重的突触囊泡拴系减少。munc13-1参与囊泡拴系的功能单元包含结合DAG的C1结构域,结合PI(4,5)P2的C2B结构域和结合突触囊泡膜的C2C结构域。munc13-1通过C1和C2B结构域同突触前膜结合,同时通过C2C结构域同突触囊泡结合,将突触囊泡拴系在膜融合位点。虽然已经有多项研究表明munc13-1 C2C结构域同突触囊泡膜的结合对神经递质分泌非常重要,但是其结合囊泡的具体机制还不清楚。本文针对munc13-1 C2C结构域与突触囊泡结合的机制展开研究,并得到以下结果:(1)通过蔗糖密度梯度离心对突触囊泡进行了分离纯化,用巨型单层囊泡招募实验发现munc13-1 C1C2Bmunc2C结构域与突触囊泡的结合依赖于突触囊泡膜上的蛋白而非磷脂组分;(2)利用GST pull-down、蛋白质谱的方法,鉴定出突触囊泡膜上与munc13-1 C2C结构域相互作用的蛋白质组;(3)借助蛋白-脂质体共漂浮、GST pull-down、APEX临近标记技术等实验手段证明了munc13-1 C2C结构域结合的突触囊泡蛋白是Rab15;(4)获得了稳定表达的munc13-1 C2C结构域蛋白,并利用蛋白质结晶获得了munc13-1 C2C结构域的蛋白质晶体。综上所述,本课题完善了munc13-1介导突触囊泡与突触前膜连接的分子机制,获得了munc13-1 C2C结构域的蛋白质结晶,为后续munc13-1 C2C结构与功能的研究奠定了基础。

关键词： munc13-1 C2C 质谱 Rab15

munc13-1及RIM1在颞叶癫痫患者及戊四氮大鼠模型中的表达

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Munc13-1及RIM1在颞叶癫痫患者及戊四氮大鼠模型中的表达

作者：吴昆仑重庆医科大学

学位级别：硕士

背景神经突触前膜胞内蛋白13-1(mammalian uncoordinated 13-1,munc13-1)特异表达于突触前膜活性区。它作为突触囊泡启动装置的重要组成部分来参与调控突触囊泡的释放。然而突触囊泡的异常释放与异常突触重塑及神经元异常放电密切相关... 详细信息

背景神经突触前膜胞内蛋白13-1(mammalian uncoordinated 13-1,munc13-1)特异表达于突触前膜活性区。它作为突触囊泡启动装置的重要组成部分来参与调控突触囊泡的释放。然而突触囊泡的异常释放与异常突触重塑及神经元异常放电密切相关。而且,在胰高血糖素样肽-1(GLP-1)参与的胞吐过程中,munc13-1可与神经元突触膜胞外分泌调节蛋白1(Rab-interacting molecules 1,RIM1)结合并产生相互作用,且RIM1与癫痫的发生关系密切。因此我们猜想munc13-1可能通过与RIM1结合参与了癫痫的发生。目的本研究试图通过检测在颞叶癫痫患者和戊四氮癫痫大鼠模型中munc13-1及RIM1的表达差异及两者的相关性分析,来初步探究munc13-1及RIM1在癫痫发生中的作用。方法***13-1、RIM1在正常人体及癫痫患者脑组织中的定位和表达情况。收集标本:采集颞叶癫痫患者病灶切除术后的皮质标本18例作为癫痫组,脑外伤患者术后切除的正常皮质标本15例作为对照组。检测:采用免疫荧光技术分析munc13-1在人体大脑皮质中的分布及定位情况,同时运用免疫组化、Western blot检测munc13-1和RIM1在正常组及癫痫组中表达量的变化。***13-1、RIM1在正常大鼠及癫痫大鼠大脑海马及皮质组织中的定位、表达情况及相互作用。动物模型构建:随机抽签将40只SPF级雄性SD大鼠分成两组,每组20只,其中一组大鼠连续腹腔注射戊四氮(3.5 mg/kg)21 d,给药后行为学观察1 h,记录发作等级和发作频率,出现至少连续3 dⅣ级及以上癫痫发作的大鼠纳入为癫痫组(n=15),另一组大鼠腹腔注射等量生理盐水,将其作为对照组(n=20)。检测:采用免疫荧光技术观察munc13-1在大鼠海马和大鼠皮质中的分布及定位情况,同时运用免疫组化、Western blot检测munc13-1和RIM1在癫痫组大鼠及对照组大鼠中表达量的变化,最后通过免疫共沉淀法在大鼠脑组织中验证munc13-1和RIM1的相互作用。结果1.在人体大脑皮质中,munc13-1主要表达于神经元轴突,且munc13-1和RIM1在癫痫组中的表达量高于对照组,差异有统计学意义(P(27)0.01)。2.在大鼠模型的大脑皮质及海马中,munc13-1也主要表达于神经元轴突,同时munc13-1和RIM1在癫痫大鼠中的表达量较正常大鼠均明显升高。免疫共沉淀证实munc13-1与RIM1存在相互作用。结论munc13-1及RIM1在癫痫患者及大鼠癫痫模型中的表达水平均明显升高,且munc13-1与RIM1存在相互作用,提示munc13-1可能通过与RIM1结合来参与癫痫的发生。

关键词：颞叶癫痫 munc13-1 RIM1 戊四氮

大鼠胰腺发育过程中munc13-1对胰岛素释放功能的影响

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第四军医大学学报 2006年第9期27卷 832-834页

作者：袁庆新刘超滕丽萍刘翠萍周锦勇郭靖程梅德伟南京医科大学第一附属医院内分泌科南京医科大学生物化学与分子生物学系江苏南京210029

目的:研究大鼠胰腺发育不同阶段munc131基因及蛋白表达的变化及munc131在胰岛素释放过程中的作用方法:应用显微分离及提取技术获得大鼠胚胎发育12.5d(E12.5),E15.5,E18.5,新生大鼠,出生后21d(P21)及成年大鼠胰腺组织;另外,从大鼠胚胎发... 详细信息

目的:研究大鼠胰腺发育不同阶段munc131基因及蛋白表达的变化及munc131在胰岛素释放过程中的作用方法:应用显微分离及提取技术获得大鼠胚胎发育12.5d(E12.5),E15.5,E18.5,新生大鼠,出生后21d(P21)及成年大鼠胰腺组织;另外,从大鼠胚胎发育15d开始给予孕鼠半量饮食,造成宫内发育迟缓动物模型,提取其新生大鼠胰腺组织.采用RTPCR,RealtimePCR和Westernblot技术确定munc131的表达情况,并测定不同发育时期血中胰岛素浓度.结果:胰岛素基因从E12.5开始出现,munc131基因从E15.5开始表达,随着胎龄的增长,二者表达量皆增多.E15.5和E18.5时munc131蛋白表达量较少,以后明显增多.自E18.5即检测到血中胰岛素的存在,随着胚胎的发育,血胰岛素浓度逐渐升高.宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素浓度低,同时munc131基因及蛋白表达量亦比正常对照组明显减少.结论:munc131在胰岛素释放过程中的作用,随着胚胎发育期胰岛素分泌的增多表达也增加,宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素分泌减少时,munc131的表达亦减少.

关键词： munc13-1 胰岛素分泌胚胎胰腺发育糖尿病宫内发育迟缓

DOC2β与munc13-1在神经突触分泌过程中相互作用的结构生物学研究

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DOC2β与Munc13-1在神经突触分泌过程中相互作用的结构生物学研究

作者：陈泓羽华中科技大学

学位级别：硕士

大脑中的神经元通过突触来传递信息。突触前膜释放的神经递质与突触后膜的相关受体相互作用,从而将信息从前一个神经元稳定而高效地传递至下一个神经元。神经递质的分泌是一种高度协调的精细过程,包括蛋白质与蛋白质,生物膜与蛋白质以... 详细信息

大脑中的神经元通过突触来传递信息。突触前膜释放的神经递质与突触后膜的相关受体相互作用,从而将信息从前一个神经元稳定而高效地传递至下一个神经元。神经递质的分泌是一种高度协调的精细过程,包括蛋白质与蛋白质,生物膜与蛋白质以及生物膜与生物膜之间多重协同的相互作用。munc13-1蛋白和Doc2β蛋白在神经递质释放的过程中发挥着重要作用。munc13-1促进syntaxin-1由闭合构象转变为开放构象,进而使syntaxin-1可以和突触前膜上的SNAP-25以及囊泡上的Synaptobrevin形成SNARE复合物,最终在钙离子的触发下,发生囊泡融合与神经递质释放。Doc2β蛋白具有很高的钙离子亲和性,有研究认为Doc2β是神经递质异步释放以及自发释放过程中的钙离子感受器。Doc2β与munc13-1之间的相互作用具有重要的生理学意义,干扰它们之间的相互作用会影响PC12细胞以及胆碱能突触中囊泡的释放。然而,Doc2β与munc13-1之间相互作用的具体机制尚不清楚,了解相互作用的具体机制对进一步理解Doc2β与munc13-1在神经递质释放过程中的功能具有重要意义。在Neuro-2a细胞中的共定位实验暗示了Doc2β可以和munc13-1相互作用。当Neuro-2a细胞在外界高浓度氯化钾的刺激下发生去极化,引起胞外钙离子内流使细胞内钙离子浓度升高时,Doc2β通过其CAB结构域结合到细胞质膜上,并通过与munc13-1的相互作用将munc13-1招募到膜上。有文章报道,Doc2β可以通过其氨基末端的Mid结构域与munc13-1相互作用,在munc13-1中相互作用的区域为851-1461。这个区域与munc13-1中的MUN结构域(859-1531)的位置接近,而MUN结构域被认为是munc13-1在突触囊泡启动过程中发挥活性的最小模块,具有重要的生理意义。我们推测Doc2β可以和MUN结构域相互作用,并在GST pull-down实验中证明了这一点。munc13-1 MUN结构域分为A、B、C、D四个亚结构域,为了进一步研究munc13-1中相互作用的位点,我们设计了一系列的截短并验证与Doc2β的相互作用,将munc13-1中相互作用的片段缩小到MUN BC(1011-1407)之中。一方面,我们在MUN BC中进行点突变来寻找具体作用的位点,另一方面,我们挑选合适的MUN结构域片段与Doc2βMid结构域共结晶,希望从晶体的角度阐释相互作用的机制。MUN是已经获得晶体结构的MUN结构域片段,其蛋白性质良好,包含与Doc2β相互作用的位点。为了得到MUN 与Mid结构域的共晶,我们采取了两种方法:(1)单独将MUN结晶,然后将Mid结构域的小肽按照特定比例加入到晶体中;(2)直接纯化MUN/Mid复合物,然后结晶。经过大规模的筛选,我们最终得到了可供衍射的MUN/Mid晶体。本课题在分子水平和细胞水平上验证了Doc2β与munc13-1之间的相互作用,并通过GST pull-down的方法将munc13-1中与Doc2β相互作用的位点缩小到了MUN BC区域。通过对MUN/Mid复合物晶体的筛选,最终得到了可供衍射的晶体,为进一步阐释Doc2β与munc13-1相互作用的生理意义奠定了基础。

关键词：神经递质分泌相互作用 Doc2β munc13-1 蛋白质结晶

Doc2b/munc13-1复合物在突触分泌中的结构生物学研究

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Doc2b/Munc13-1复合物在突触分泌中的结构生物学研究

作者：谢圣华中科技大学

学位级别：硕士

神经元间的信息交流依赖于突触囊泡释放的神经递质。由囊泡包裹的神经递质经过转运、锚定、膜融合等过程分泌至突触间隙,进而作用于突触后膜受体。膜融合是在Ca触发下,由SNARE复合物介导的精密调控过程。SNARE复合物的组装起始于munc18-... 详细信息

神经元间的信息交流依赖于突触囊泡释放的神经递质。由囊泡包裹的神经递质经过转运、锚定、膜融合等过程分泌至突触间隙,进而作用于突触后膜受体。膜融合是在Ca触发下,由SNARE复合物介导的精密调控过程。SNARE复合物的组装起始于munc18-1/Syntaxin-1,而munc13-1作为调控因子催化打开Syntaxin-1的闭合构像促进SNARE复合物形成。作为SNARE复合物的上游调控因子,munc13-1的活性如何被调节至今仍不清楚。候选因子Doc2是突触前重要的小分子蛋白,其氨基端的MID结构域能特异性与munc13-1发生相互作用。在缺少Doc2的神经元中,自发释放减少了50%-75%,同步释放不受影响。嗜铬细胞中过表达Doc2增强了囊泡融合,以及在小鼠背根神经节中注入过量Doc2的MID多肽会抑制神经递质释放,表明Doc2与munc13-1的相互作用参与了囊泡分泌过程,但对其相互作用机制以及如何影响突触功能等方面还不了解。本文对Doc2和munc13-1的相互作用机制进行了探究。首先,通过GST pull down实验验证了Doc2家族中的亚型Doc2b与munc13-1的MUN结构域的相互作用,并证明与munc13-1的相互作用最小区域为MUN BC亚结构域,同时也在HEK293T细胞中利用佛波酯刺激munc13-1诱导Doc2上膜的共定位实验进一步验证了互作。其次,利用分子排阻层析和等温滴定量热(ITC)实验发现Doc2b MID结构域是与munc13-1相互作用的必要区域但不是结合最强的区域,这为Doc2b/munc13-1复合物的结晶提供了指导。最后,经过大规模的结晶筛选初步得到了Doc2b/munc13-1复合物的晶体。综上,我们的工作初步阐明了Doc2b与munc13-1相互作用的分子机制,并且为进一步解析复合物的结构以及二者相互作用位点打下良好基础。

关键词：囊泡分泌 SNARE复合物 munc13-1 Doc2 蛋白质结晶

运用CRISPR/Cas9系统构建munc13-1基因敲除的Neuro-2a细胞系

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运用CRISPR/Cas9系统构建Munc13-1基因敲除的Neuro-2a细胞系

作者：王蕾华中科技大学

学位级别：硕士

Ca触发的突触囊泡融合介导的神经递质释放过程,由syntaxin-1、SNAP-25和synaptobrevin组成SNARE复合物核心组分,同时受munc18-1、munc13-1和synaptotagmin-1等蛋白调控,各类相关蛋白通过彼此直接或间接的相互作用共同协调完成。munc13-... 详细信息

Ca触发的突触囊泡融合介导的神经递质释放过程,由syntaxin-1、SNAP-25和synaptobrevin组成SNARE复合物核心组分,同时受munc18-1、munc13-1和synaptotagmin-1等蛋白调控,各类相关蛋白通过彼此直接或间接的相互作用共同协调完成。munc13-1通过MUN结构域催化munc18-1–syntaxin-1复合物向SNARE复合物的转换,在突触囊泡分泌启动过程中发挥关键调控作用。运用CRISPR/Cas9系统尝试构建munc13-1基因稳定敲除的小鼠Neuroblastoma(Neuro-2a)细胞系,将为我们提供验证此机制并进一步了解munc13-1功能及其分子机制的胞内操作平台。目前已开展以下工作并获得部分结果,在小鼠munc13-1基因第29号外显子(编号:ENSMUSE00000329984)上选取3个CRISPR/Cas9系统敲除munc13-1基因靶点。随后设计并合成对应靶点的sgRNA序列,退火形成寡核苷酸双链并构建至带有GFP荧光或嘌呤霉素抗性筛选标签的CRISPR/Cas9系统敲除载体PX458和PX459。接下来确定各靶点的敲除效率。重组质粒PX459-sgRNA转染Neuro-2a细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选及测序分析选定活性80%以上的sgRNA2作为munc13-1基因对应敲除靶点。初步建立munc13-1基因敲除的Neuro-2a细胞系。重组质粒PX458-sgRNA2转染Neuro-2a细胞,通过流式分选和有限稀释法筛选GFP表达阳性单细胞并扩增培养。最后鉴定munc13-1基因敲除的Neuro-2a细胞系。鉴定基因编辑后的突变类型及munc13-1蛋白的表达,以确认munc13-1基因敲除Neuro-2a细胞系的敲除效果。本课题运用CRISPR/Cas9技术初步构建了munc13-1基因敲除的Neuro-2a细胞系,为进一步建立munc13-1基因稳定敲除的Neuro-2a细胞系打下基础。

关键词： munc13-1 CRISPR/Cas9 基因敲除 Neuro-2a细胞